JP5278913B2 - 単一細胞捕捉用マイクロ流路デバイス - Google Patents
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Description
マイクロ流路(深さ;1mm,幅;1mm)作製のための鋳型を、CAD−CAMM(computer−aided design−computeraided modeling machineシステム;PNC−300,ローランド株式会社製)を用いて、厚さ3mmのPMMA(polymethylmethacrylate)の基板を切削することにより作製した。この鋳型を超音波洗浄した後に乾燥させ、PDMS(poly−dimethylsiloxane)の主剤と硬化剤(シルガード184;ダウコーニング社製)とを10:1で混合し、鋳型に注入後、減圧下において脱気し、上部基板を作製した。また、マイクロメッシュ用開口窓が設けられた上部平板はPDMSと硬化剤を50:1で配合したものを使用した。このPDMSを85℃で20分間以上加熱することにより硬化させた。これらの表面に20秒間プラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることでPDMSを接着し、マイクロ流路部材を作製した。また、試料供給口と試料送出口にはシリコンチューブ(内径1mm×外径3mm)を接続した。同様に、PDMSと硬化剤とを10:1で混合し、鋳型に注入後、減圧下において脱気し、下部基板を作製した。また、下部平板は主剤と硬化剤を50:1で配合したものを使用した。このPDMSを85℃で20分間以上加熱することにより硬化させた。これらの表面に20秒間プラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることでPDMSを接着し、吸引流路部材を作製した。また、吸引口にはシリコンチューブを接続した。
Raji細胞(ヒトバーキットリンパ腫)を供試細胞とし、細胞にダメージを与えない方法として、厚さ38μmのブラックPET(bPET)に代えて厚さ5μmのSUS304の薄板からなるマイクロメッシュを備えた以外は図2に示されるマイクロ流路デバイスを用いて、細胞捕捉における吸引圧の検討を行った。その結果、図3に示すように、微生物の場合と異なり細胞の場合は圧力差90kPa(−90kPa)では細胞が破壊した。そこで、吸引圧を、−40kPa(圧力差40kPa)、−20kPa(圧力差20kPa)、−10kPa(圧力差10kPa)、−5kPa(圧力差5kPa)に変えて同様に細胞捕捉における吸引圧の検討を行った。結果を図4に示す。その結果、−5kPaという低減圧吸引条件下で細胞を効率よく捕捉可能なことがわかった。
マイクロメッシュの材料として、厚さ5μmのSUS304の薄板、厚さ5μmのPETフィルム(村中医療器社製)、厚さ38μmのブラックPETフィルム(村中医療器社製)を用いて、バックグラウンドの自家蛍光について調べた。結果を図5に示す。その結果、透明のPETよりも、SUSや半透明のブラックPETの方が自家蛍光が少ないことがわかった。
PET製マイクロメッシュとSUS製マイクロメッシュにおける反すり鉢状微細貫通孔の形状を調べた。走査型電子顕微鏡(SEM)イメージを図6〜図8に示す。図6〜図8より、PETの方がSUSよりも均一な微細加工を精度よく行うことができることがわかった。
10000の微細貫通孔を有するブラックPET製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに、圧力差1.5kPa(−1.5kPa)の吸引条件下、1000個、3000個、5000個及び10000個のRaji細胞を注入し、マイクロメッシュ上に捕捉された細胞数をスキャナーで測定した。走査イメージ、マイクロメッシュ上に捕捉された細胞数、捕捉効率を図9に示す。図9からわかるように、本発明のマイクロ流路デバイスを用いると、細胞捕捉率60%以上を達成することができる。
Calcein-AMで染色した1000個のRaji細胞を、圧力差1.5kPa(−1.5kPa)の吸引条件下、ブラックPET製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに捕捉させる前後の生存率を求めた。捕捉前後のCalcein-AM染色Raji細胞をPI溶液を導入し、NIBAフィルターセット(ex.:470-490,em.:515-550)及びWIGフィルターセット(ex.:520-550,em.:580)を用いて、蛍光顕微鏡写真(合成画像)により観察した。その結果、捕捉前の細胞生存率は96.8%であり、捕捉後の細胞生存率は91.3%であったことから、本発明の細胞の捕捉方法によると、捕捉細胞の生存率はきわめて高いものと評価できる。
PDMS製マイクロ流路部材を備えたマイクロ流路デバイスのマイクロ流路を、0.1%,1%,10%の各濃度の非イオン性界面活性剤(プルロニックF127)で処理した後、CellTracker RedCMTPXで染色したRaji細胞1500個を注入し、マイクロ流路内面に付着したRaji細胞をWIGフィルターセット(ex.:520-550,em.:580)の蛍光顕微鏡写真により観察した。結果を図10に示す。1%のプルロニックF127溶液処理で、PDMSマイクロ流路への細胞の付着を防止できることがわかった。
Raji細胞をブラックPET製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに捕捉させた後、50%エタノール/PBSをマイクロ流路に導入し、ホットプレート上にマイクロ流路デバイスをセットして、細胞の透過化処理を行った。透過化処理が施された細胞に、ヒトβ−アクチンに対するCy3標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、42℃で2時間ハイブリダイズを行った。蛍光顕微鏡写真を図11に示す。また、Calcein-AMで標識した血清飢餓Raji細胞(n=38)と血清処理Raji細胞(n=28)との混合懸濁液を、マイクロ流路デバイスに導入後、ブラックPET製マイクロメッシュ上に捕捉させた後、ヒトβ−アクチンmRNAに対して、ヒトβ−アクチンmRNA用Cy3標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いてFISHをマイクロ流路デバイス上で行った。次いで、単一細胞の蛍光強度を測定した。結果を図12に示す。血清処理によりヒトβ−アクチンmRNAの発現が増強した細胞の蛍光強度は、ヒトβ−アクチンmRNAの発現が抑制された血清飢餓細胞よりも強かった。これらのことから、マイクロ流路デバイスを用いることにより、単一細胞の遺伝子発現の定量的解析が可能であることがわかる。
CTLマーカーであるCD8と、gp100ペプチドへの抗原レセプターとをともに発現している細胞のみを単離する目的で、FITC標識抗CD8抗体+/PE標識gp100−HLA-A2−テトラマーで二重蛍光免疫染色したCTL細胞懸濁液をマイクロ流路デバイスに導入し、−2.0kPaで減圧吸引を行うことで、細胞をブラックPETマイクロメッシュ上へ捕捉した。蛍光顕微鏡(BX−51; Olympus社製) を用いて、ブラックPETマイクロメッシュ上の細胞を観察したところ、1細胞レベルで分離・捕捉できていることを確認した。
マイクロ流路デバイスを用いたヒト末梢血単核球細胞(PBMCs)中に約0.1%の割合で存在する稀少細胞である造血幹細胞(HSCs)の分離・捕捉の概要を図13に示す。FITC標識抗CD45抗体及びPE標識抗CD34抗体を用いて二重蛍光免疫染色を行った104個のPBMCsを10000穴ブラックPET製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに捕捉させた後、電動ステージを配した蛍光顕微鏡下でNIBA及びWIGフィルターセットを用いて観察を行い、マイクロメッシュ全体の蛍光画像を取得した。この蛍光顕微鏡写真を図14に示す。写真は、緑色に染色されたCD45+細胞(上段の4点全て及び下段の左から1〜3番目の3点)、及び、赤色に染色されたCD34+細胞(写真中下段右から1番目の1点)を示す。また、二重蛍光免疫染色を行った104個のPBMCsのPE及びFITCの蛍光強度の相関関係を図15に示す。
この結果、本発明にかかるマイクロメッシュを用いることにより、PBMCs中にわずか0.1%程度の存在率しかないHSCs細胞を、1万穴に9割以上の極めて高い確率で細胞1個の単位で捕捉することができたので、ごく稀少な細胞(赤色に染色された細胞)でもロスなく確実に回収することができることが確認できた。このように本発明のマイクロ流路デバイスを使用すると、免疫染色法を用いた細胞の多重染色により、末梢血中に含まれる細胞のプロファイリング解析に利用できる。また、基板材として顔料を含有したプラスチックを用いていることで、目的細胞の超高感度検出が可能であることがわかった。
上述のようにしてマイクロメッシュ上に捕捉された細胞群の中から、赤色に染色されたCD34+細胞(HSCs細胞)のみを手動でキャピラリーにより分離し、ピッキングした。また対照として、CD45+細胞のみを手動でキャピラリーにより分離し、ピッキングした。そして、ピッキングしたCD34+細胞及びCD45+細胞を試料として用い、RT−PCRを行った。逆転写反応は、42℃で60分間の条件で行い、PCRは94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒の各条件で50サイクルずつ行った。増幅産物に対し電気泳動を行い、細胞内に発現しているmRNAについて解析した。このRT−PCRを用いた単一細胞mRNA発現分析によるCD34mRNA及びβアクチンmRNAの発現結果を図16に示す。
また、本発明のマイクロ流路デバイスは、送液による各種試薬の導入が容易であることから、リアルタイム観察による細胞の解析にも最適なツールであり、現在注目されているiPS細胞をはじめとする幹細胞等において、目的細胞の誘導メカニズムの解析や目的細胞の培養にも利用可能な研究支援ツールとして有望である。
Claims (10)
- マイクロメッシュにより試料中に含まれる動物細胞を1細胞レベルで捕捉することができるマイクロ流路デバイスであって、
表面に試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、
前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、
前記上部平板の開口窓の下方に相当する位置に、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュと、該マイクロメッシュを保持する保持板からなるマイクロメッシュ保持平板と、
前記保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、
表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板と、
を順次備え、
前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板が前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成されており、
前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメッシュ保持平板とが装脱着可能に構成されている
ことを特徴とするマイクロ流路デバイス。 - マイクロメッシュが、着色PET製であることを特徴とする請求項1記載のマイクロ流路デバイス。
- 下部基板の片側に、下から順次下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を積層したときと同じ高さとなるような段差部が設けられ、減圧吸引時に下部基板上に下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を安定に積層載置するよう構成されたことを特徴とする請求項1又は2記載のマイクロ流路デバイス。
- 上部基板と上部平板が、PDMS(poly−dimethylsiloxane)を主剤とするプラスチック製であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
- マイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項5記載のマイクロ流路デバイス。
- マイクロメッシュを保持する保持板が、ガラス製であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
- マイクロメッシュがPET製であると共に反すり鉢状の細胞捕捉用の微細貫通孔を有し、上部基板と上部平板がPDMSを主剤とするプラスチック製であり、マイクロメッシュを保持する保持板がガラス製であり、上部基板と上部平板とで協働して形成されたマイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されているデバイスであって、少なくとも、細胞捕捉率が50%以上であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
- 請求項1〜8のいずれか記載のマイクロ流路デバイスの試料供給口から動物細胞を含む試料を注入し、−10kPa〜−0.1kPaの吸引圧で吸引することを特徴とする試料中に含まれる細胞を1細胞レベルで捕捉する方法。
- 請求項1〜8のいずれか記載のマイクロ流路デバイスを用いて、試料中に含まれる動物細胞を1細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析する方法。
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