CN109609339B - 一种实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，包括有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层底片；所述上层基片中的微流控通道由双乳化液滴产生区、双乳化液滴缓冲存储区、双乳化液滴锚定区、多余液滴排出通道、锚定液滴排出通道组成；所述下层底片由玻璃片及涂覆在玻璃片表面的高分子材料薄膜组成。本发明的微流控芯片具有良好的生物兼容性、热稳定性和气体通透性，适宜对于细胞进行处理；适宜采用显微镜技术和荧光染色技术，实时动态观察细胞。本发明的微流控芯片可以通过外部泵提供驱动力对流体进行精确操控，实现悬浮细胞、培养基、缓冲液和用于对悬浮细胞处理的生化试剂的输入的时间和空间控制。本发明的微流控芯片可以实现悬浮细胞的单细胞处理及实时观察。

Description

一种实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及微流控芯片领域，具体指一种用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片及其制备方法和应用，该芯片能够将悬浮细胞以单细胞形式包覆在双乳化液滴中并固定在芯片内部确定位置，能批量地对单个悬浮细胞进行实时观察及生化处理。

背景技术

微流控芯片是指通过微纳加工技术在很小面积的一块衬底材料上制作加工的微型单元,可以实现对于样本的生化处理。微流控芯片技术以微米尺度的流体通道网络为结构特征，利用特殊微纳结构对于微量液体进行精确控制，一方面能够将常规生化实验室的检测分析等技术手段集成在几平方厘米的芯片中，实现集成化、自动化和小型化，另一方面利用微小空间尺度下流体运动的独特规律为化学和生物学研究提供新的研究思路和相应技术手段。

由于微流控芯片在流体控制的尺寸精度上与细胞契合，微流控芯片技术在与细胞相关的研究，尤其是单细胞研究中具有广阔的前景。目前利用微流控芯片研究单细胞的手段主要是将细胞包覆在单乳化液滴(油包水液滴)之中，或者利用油性溶液将培养溶液和其中的细胞分隔在单独的微腔室之中。但是这类方法由于以油性液体为工作液，氧气等营养物质无法足量溶解，难以给细胞提供充足的持续的养分供给；同时，用于处理细胞的各类生化试剂也不易溶解，难以完成对细胞的生化处理。虽然在微流控芯片中可以将细胞包覆在水凝胶内实现为细胞提供供给或向细胞输送生化处理试剂，这种方法只能提供水凝胶环境，仅适用于贴壁细胞的单细胞研究。作为细胞两大分类中另一大类的悬浮细胞需要液体生存环境，此种方法并不适用。

双乳化液滴(水包油包水液滴)一般是指在水性溶液中分散的油性液滴内又包含有水性液滴的具有双层结构的乳化液体系。该体系的内外相的水性溶液相互分隔，其性质可以相同或者不同，同时内外相的水性溶液之间能够发生一定的物质交换。这种特性使得双乳化液滴在长时间培养单细胞、可控调节细胞所处环境等应用方面有巨大潜力。

发明内容

本发明提供了一种利用双乳化液滴进行实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片及其制备方法和应用，可实现单个悬浮细胞的实时观察及生化处理，可用于单细胞分析、细胞时空行为观察、药物筛选等方面的研究。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，包括有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层底片；所述上层基片中的微流控通道由双乳化液滴产生区、双乳化液滴缓冲存储区、双乳化液滴锚定区、多余液滴排出通道、锚定液滴排出通道组成；所述双乳化液滴产生区连接所述双乳化液滴缓冲存储区；所述双乳化液滴锚定区一端连接双乳化液滴缓冲存储区，另一端连接锚定液滴排出通道；所述多余液滴排出通道连接所述双乳化液滴缓冲存储区；所述下层底片由玻璃片及涂覆在玻璃片表面的高分子材料薄膜组成；

所述双乳化液滴产生区用于产生包覆单个悬浮细胞的双乳化液滴，以及为芯片内部锚定的悬浮细胞提供生化处理试剂；所述双乳化液滴缓冲存储区用于暂时存储生成的双乳化液滴；所述双乳化液滴锚定区设有若干圆形微腔室，用于捕获和锚定单个双乳化液滴；所述多余液滴排出通道用于排出过量的双乳化液滴；所述锚定液滴排出通道用于排出经过处理后的包覆有悬浮细胞的双乳化液滴以实现回收。

所述微流控芯片上层基片的材料、下层底片的涂覆材料均为聚二甲基硅氧烷材料；所述下层底片的材料为玻璃。

所述双乳化液滴产生区由细胞接种通道、与细胞接种通道连通的油性溶液进液通道和与细胞接种通道连通的水性溶液进液通道构成；所述细胞接种通道一端为细胞接种通道入口c；所述油性溶液进液通道一端为油性溶液进液通道入口b，一端与细胞接种通道形成十字型通道；所述水性溶液进液通道一端为水性溶液进液通道a，一端与细胞接种通道形成十字型通道；所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；所述双乳化液滴缓冲存储区为三角形通道一，三角形通道一的三角形顶点处连接水性溶液进液通道，对应底边连接双乳化液滴锚定区；所述双乳化液滴缓冲存储区横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；所述锚定液滴排出通道为三角形通道二，三角形通道二的三角形底边连接双乳化液滴锚定区，对应顶点锚定液滴排出口d；所述锚定液滴排出通道横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；

所述双乳化液滴锚定区设有20-50排圆形微腔室，每排包含25-50个圆形微腔室，相邻两排间距为200-500μm，每排内的圆形微腔室的间距为50-100 μm；圆形微腔室的直径为100-150μm；每一排上的相邻的圆形微腔室由直通道连接，所述直通道长度为100-150μm，宽度为50-75μm；所述双乳化液滴锚定区一端连接在双乳化液滴缓冲存储区底边，另一端连接锚定液滴排出通道；所述双乳化液滴锚定区横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；

所述多余液滴排出通道由分布于所述双乳化液滴锚定区两侧的通道一、通道二和位于双乳化液滴锚定区下方的通道三组成；所述通道一与通道二分别连接所述双乳化液滴缓冲存储区底边的端点；所述通道三分别连接通道一和通道二；多余液滴排出通道出口e连接通道三的中间；所述多余液滴排出通道横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同。

本申请所述的用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，所述细胞接种通道为宽度不变的直通道，宽度为50-100μm；所述油性溶液进液通道宽度为100-200μm；所述水性溶液进液通道宽度为100-200μm；所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同，均为100-150 μm；三角形通道一张角为90°-150°，底边宽度为6000-12000μm；三角形通道二张角为90°-150°，底边宽度为4000-10000μm；所述通道一、通道二和通道三为宽度不变的直通道，宽度为100-200μm。

本发明还提供了上述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：第一步，利用计算机绘图软件设计好芯片结构，通过激光照排机制作对应的光刻掩膜版；

第二步，将光刻胶涂覆于硅片表面，进行紫外曝光和显影，将掩膜版上的图样转移到光刻胶上，得到上层基片的模板；

第三步，将聚二甲基硅氧烷；材料浇铸到模板表面，经过除气泡、烘焙、打孔得到上层基片；

第四步，将聚二甲基硅氧烷材料涂覆于玻璃片表面，烘焙得到下层底片；

第五步，将有微流控通道的上层基片与下层底片进行封合，制成微流控芯片。

本发明同时通过了所述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的微流控通道表面亲水性处理方法，包括如下步骤：第一步，将4wt％聚乙烯醇的水溶液从水性溶液进液通道入口a通入微流控芯片，将5KPa压强的空气从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入微流控芯片，聚乙烯醇水溶液依次引入水性溶液进液通道、双乳化液滴缓冲存储区、双乳化液滴锚定区、锚定液滴排出通道、多余液滴排出通道，持续时间为10-60min；

第二步，从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入空气至完全充满整个通道并且排出微流控通道内部的聚乙烯醇水溶液；

第三步，90-120摄氏度烘焙微流控芯片10-30min；

第四步，重复上述第一步至第三步3-5次。

本申请所述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片在产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法，包括如下步骤：第一步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将载有悬浮细胞的缓冲液从细胞接种通道入口c 泵入细胞接种通道；

第二步，油性溶液由油性溶液进液通道入口b泵入油性溶液进液通道，与细胞接种通道流出的含有单个悬浮细胞的缓冲液在十字型通道处汇合，通过控制油性溶液和缓冲液的流速比，形成粒径可控的油包水液滴；所述油包水液滴中包覆有单个悬浮细胞；

第三步，水性溶液由水性溶液进液通道入口a泵入水性溶液进液通道，与油性溶液进液通道流出的含有油包水液滴的油性溶液在十字型通道处汇合，通过控制水性溶液和油性溶液的流速比，形成粒径可控的水包油包水双乳化液滴；所述双乳化液滴中包覆有单个悬浮细胞；

第四步，所述双乳化液滴进入双乳化液滴缓冲存储区，当液滴在双乳化液滴缓冲存储区中积累到一定数量之后会分别进入双乳化液滴锚定区中的圆形微腔室之中；双乳化液滴在圆形微腔室中由于表面张力恢复为球形，并且被锚定在圆形微腔室之中。

本发明进一步提供了所述微流控芯片在处理和实时观察悬浮细胞的方法，包括如下步骤：第一步，按照所述微流控芯片在产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法将包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴锚定在所述微流控芯片的圆形微腔室中；

第二步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片，将油性溶液进液通道中残余的油性溶液从油性溶液进液通道入口b排出，将细胞接种通道中残余的载有悬浮细胞的缓冲液从细胞接种通道入口c排出，将未锚定于双乳化液滴锚定区圆形微腔室中的双乳化液滴分别从锚定液滴排出通道出口d和多余液滴排出通道出口e排出；

第三步，在第二步通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片的同时将用于对悬浮细胞进行处理的生化试剂分别从油性溶液进液通道和细胞接种通道泵入所述微流控芯片；所述缓冲液与用于对悬浮细胞处理的试剂在双乳化液滴缓冲区混合后向双乳化液滴锚定区进行灌注，所述用于对悬浮细胞处理的试剂逐步扩散至被锚定的双乳化液滴内，对于悬浮细胞完成处理；

第四步，在第二步通过通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片后，将所述微流控芯片中残余的用于对悬浮细胞处理的生化试剂分别从油性溶液进液通道入口b、细胞接种通道入口c、锚定液滴排出通道出口d和多余液滴排出通道出口e排出；所述缓冲液向双乳化液滴锚定区进行灌注，完成清洗处理；

第五步，将所述微流控芯片放置于显微镜载物台上，通过调节所述微流控芯片的位置并通过显微镜物镜镜头即可实时观察处理中或者已处理的位于被锚定的双乳化液滴内部的单个悬浮细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：1、本发明的微流控芯片选用聚二甲基硅氧烷高分子材料，具有良好的生物兼容性、热稳定性和气体通透性，适宜对于细胞进行处理；透明、自发荧光微弱，适宜采用显微镜技术和荧光染色技术，实时动态观察细胞。

2、本发明的微流控芯片的阵列式双乳化液滴锚定区，便于实现单个或者数个细胞的阵列式处理及实时观察。

3、本发明的微流控芯片可以通过外部泵提供驱动力对流体进行精确操控，实现悬浮细胞、培养基、缓冲液和用于对悬浮细胞处理的生化试剂的输入的时间和空间控制。

4、本发明的微流控芯片可以实现悬浮细胞的单细胞处理及实时观察，解决了目前已有的微流控芯片技术无法进行悬浮细胞单细胞研究分析的问题。有利于在单细胞层面研究悬浮细胞的功能、细胞之间的相互作用以及细胞对于生长因子/药物等刺激物的响应情况。

附图说明

图1为本发明实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的结构分解示意图。

其中，1为有微流控通道的上层基片，2为涂覆在玻璃表面的PDMS薄膜，3为玻璃片。

图2为本发明实施例1实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片中微流控通道结构的俯视结构图和局部放大图。其中，a为水性溶液进液通道入口，b 为油性溶液进液通道入口，c为细胞接种通道入口，d为锚定液滴排出通道出口，e为多余液滴排出通道出口，11为水性溶液进液通道，12为油性溶液进液通道，13为细胞接种通道，14为双乳化液滴缓冲存储区，15为双乳化液滴锚定区，16、17、18为多余液滴排出通道，19为锚定液滴排出通道，20为圆形微腔室。

图3(a)为所述微流控芯片产生和锚定包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴的方法的示意图。(b)为实施例3所述微流控芯片产生包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴的显微镜明场图片。(c)为实施例3所述微流控芯片锚定的包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴的显微镜明场图片，其中，21为水性溶液， 22为油性溶液，23为载有悬浮细胞的缓冲液，24为包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴，25为锚定的双乳化液滴，26为悬浮细胞。

图4(a)为所述微流控芯片处理和实时观察锚定的双乳化液滴中悬浮细胞的方法的示意图。(b)为实施例4所述微流控芯片中进行细胞活性荧光染色处理的试剂二乙酸荧光素(FDA)向双乳化液滴锚定区进行灌注的显微镜荧光图片。(c)为实施例4所述微流控芯片中进行细胞活性荧光染色处理后的包覆有人类白血病细胞系TF-1悬浮细胞的锚定的双乳化液滴的显微镜明场图及荧光图，其中，31为含有0.5wt％PVA的DMEM与甘油按照体积比8:2混合成的水性溶液，32为由硅油PMX-200和PDMS预聚物按照体积比7:3混合成的油性溶液，25为锚定的双乳化液滴，26为悬浮细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

参见图1-4，本发明用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，包括有微流控通道的上层基片1以及与该上层基片封合的下层底片2、3；所述上层基片中的微流控通道由双乳化液滴产生区、双乳化液滴缓冲存储区、双乳化液滴锚定区、多余液滴排出通道、锚定液滴排出通道组成；所述下层底片由玻璃片3及涂覆在玻璃片3表面的高分子材料薄膜2组成。所述双乳化液滴产生区用于产生包覆单个悬浮细胞的双乳化液滴，以及为芯片内部锚定的悬浮细胞提供生化处理试剂；所述双乳化液滴缓冲存储区用于暂时存储生成的双乳化液滴；所述双乳化液滴锚定区设有若干圆形微腔室，用于捕获和锚定单个双乳化液滴；所述多余液滴排出通道用于排出过量的双乳化液滴；所述锚定液滴排出通道用于排出经过处理后的包覆有悬浮细胞的双乳化液滴以实现回收。

所述微流控芯片上层基片的材料、下层底片的涂覆材料均为聚二甲基硅氧烷材料；所述下层底片的材料为玻璃。

参阅图2，所述双乳化液滴产生区的特征在于：双乳化液滴产生区由细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道11构成。所述细胞接种通道13为宽度不变的直通道，宽度为50-100μm，一端为细胞接种通道入口c。所述油性溶液进液通道12宽度为100-200μm，一端为油性溶液进液通道入口b，一端与细胞接种通道13形成十字型通道。所述水性溶液进液通道11宽度为100-200μm，一端为水性溶液进液通道a，一端与细胞接种通道13形成十字型通道。所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道11的横截面高度相同，均为100-150μm。

参阅图2，所述双乳化液滴缓冲存储区14为三角形通道，三角形顶点处连接水性溶液进液通道11，对应底边连接双乳化液滴锚定区15。三角形通道张角为90°-150°，底边宽度为6000-12000μm。所述双乳化液滴缓冲存储区14横截面高度为100-150μm，即：所述双乳化液滴缓冲存储区14横截面高度与所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道11 的横截面高度相同。

参阅图2，所述双乳化液滴锚定区15的特征在于：双乳化液滴锚定区设有20-50排圆形微腔室，每排包含25-50个圆形微腔室，相邻两排间距为 200-500μm，每排内的圆形微腔室的间距为50-100μm；圆形微腔室的直径为 100-150μm；每一排上的相邻的圆形微腔室由直通道连接，所述直通道长度为100-150μm，宽度为50-75μm。所述双乳化液滴锚定区15一端连接在双乳化液滴缓冲存储区14底边，另一端连接锚定液滴排出通道19。所述双乳化液滴锚定区15横截面高度为100-150μm，即：所述双乳化液滴锚定区15横截面高度与所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道 11的横截面高度相同。

参阅图2，所述锚定液滴排出通道19为三角形通道，三角形底边连接双乳化液滴锚定区15，对应顶点锚定液滴排出口d。三角形通道张角为90°-150°，底边宽度为4000-10000μm。所述锚定液滴排出通道19横截面高度为100-150μm，即：所述锚定液滴排出通道19横截面高度与所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道11的横截面高度相同。

参阅图2，所述多余液滴排出通道16、17、18由两段分居所述双乳化液滴锚定区15两侧的通道16、通道17和通道18组成。所述通道16、通道17 和通道18为宽度不变的直通道，宽度为100-200μm。所述通道16与通道17 分别连接所述双乳化液滴缓冲存储区14底边的端点；所述通道18分别连接通道16与通道17；多余液滴排出通道出口e连接通道18的中间。所述多余液滴排出通道16、17、18横截面高度相为100-150μm，即：所述多余液滴排出通道16、17、18横截面高度与所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道 12和水性溶液进液通道11的横截面高度相同。

本发明还提供了上述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：第一步，利用计算机绘图软件设计好芯片结构，通过激光照排机制作对应的光刻掩膜版；

第二步，将光刻胶涂覆于硅片表面，进行紫外曝光和显影，将掩膜版上的图样转移到光刻胶上，得到上层基片的模板。

第三步，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料浇铸到模板表面，经过除气泡、烘焙、打孔得到上层基片。

第四步，将聚二甲基硅氧烷材料涂覆于玻璃片表面，烘焙得到下层底片。

第五步，将有微流控通道的上层基片与下层底片进行封合，制成微流控芯片。

本发明还提供了上述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的微流控通道表面亲水性处理方法，包括如下步骤：第一步，参阅图2，将4wt％聚乙烯醇(PVA)的水溶液从水性溶液进液通道入口a通入微流控芯片，将适当压强的空气从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入微流控芯片，聚乙烯醇水溶液引入水性溶液进液通道11、双乳化液滴缓冲存储区14、双乳化液滴锚定区15、锚定液滴排出通道19、多余液滴排出通道16、17、18，持续时间为10-60min。

第二步，参阅图2，从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入空气至完全充满整个通道并且排出微流控通道内部的聚乙烯醇水溶液。

第三步，90-120摄氏度烘焙微流控芯片10-30min。

第四步，重复上述第一步至第三步3-5次。

以上方法的效果：使得聚二甲基硅氧烷材料转变变为亲水性质，实现水包油液滴的产生。聚二甲基硅氧烷材料的本质浸润性为疏水性质，无法实现水包油液滴的产生，也就无法产生双乳化液滴。利用聚二甲基硅氧烷材料完成微流控芯片的制备，微流控通道表面仍然为疏水性质。通过上述方法在微流控通道表面涂覆一层亲水性的聚乙烯醇薄膜，实现微流控通道表面从疏水性变为亲水性。

本发明还提供了所述微流控芯片在产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法，包括如下步骤：第一步，参阅图2及图3(a)，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将载有悬浮细胞的缓冲液23从细胞接种通道入口c泵入细胞接种通道13。

第二步，参阅图2及图3(a)，油性溶液22由油性溶液进液通道入口b 泵入油性溶液进液通道12，与细胞接种通道13流出的含有单个悬浮细胞的缓冲液在十字型通道处汇合，通过控制油性溶液和缓冲液的流速比，形成粒径可控的油包水液滴。所述油包水液滴中包覆有单个悬浮细胞。

第三步，参阅图2及图3(a)，水性溶液21由水性溶液进液通道入口a 泵入水性溶液进液通道11，与油性溶液进液通道12流出的含有油包水液滴的油性溶液在十字型通道处汇合，通过控制水性溶液和油性溶液的流速比，形成粒径可控的水包油包水双乳化液滴24。所述双乳化液滴中包覆有单个悬浮细胞。

第四步，参阅图2及图3(a)，所述双乳化液滴进入双乳化液滴缓冲存储区14，当液滴在双乳化液滴缓冲存储区14中积累到一定数量之后会分别进入双乳化液滴锚定区15中的圆形微腔室之中。双乳化液滴在圆形微腔室中由于表面张力恢复为球形，并且被锚定在圆形微腔室之中。

本发明还提供了所述微流控芯片在处理和实时观察悬浮细胞的方法，包括如下步骤：第一步，按照所述微流控芯片在产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法将包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴锚定在所述微流控芯片的圆形微腔室中。

第二步，参阅图2，图3(a)及图4(a)，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片，将油性溶液进液通道12中残余的油性溶液22从油性溶液进液通道入口b排出，将细胞接种通道13中残余的载有悬浮细胞的缓冲液23从细胞接种通道入口c 排出，将未锚定于双乳化液滴锚定区15圆形微腔室中的双乳化液滴分别从锚定液滴排出通道出口d和多余液滴排出通道出口e排出。

第三步，参阅图2及图4(a)，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片，同时将用于对悬浮细胞进行处理的生化试剂分别从油性溶液进液通道12和细胞接种通道13 泵入所述微流控芯片。所述缓冲液与用于对悬浮细胞处理的试剂在双乳化液滴缓冲区14混合后向双乳化液滴锚定区15进行灌注，所述用于对悬浮细胞处理的试剂逐步扩散至被锚定的双乳化液滴25内，对于悬浮细胞完成处理。

第四步，参阅图2及图4，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片，将所述微流控芯片中残余的用于对悬浮细胞处理的生化试剂分别从油性溶液进液通道入口b、细胞接种通道入口c、锚定液滴排出通道出口d和多余液滴排出通道出口e排出。所述缓冲液31向双乳化液滴锚定区15进行灌注，完成清洗处理。

第五步，将所述微流控芯片放置于显微镜载物台上，通过调节合适的所述微流控芯片的位置以及选用合适的显微镜物镜镜头即可实时观察处理中或者已处理的位于被锚定的双乳化液滴内部的单个悬浮细胞。

实施例1

一种用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，包括有微流控通道的上层基片1、涂覆在下层底片表面的PDMS薄膜2以及下层底片3。所述微流控芯片上层基片1的材料、下层底片涂覆的薄膜2材料均为聚二甲基硅氧烷材料；所述下层底片3的材料为玻璃。上层基片的微流控沟道由细胞接种通道13，油性溶液进液通道12，水性溶液进液通道11，双乳化液滴缓冲存储区 14，双乳化液滴锚定区15，多余液滴排出通道16、17、18，以及锚定液滴排出通道19构成。所述细胞接种通道13为宽度不变的直通道，宽度为100μm。所述油性溶液进液通道12宽度为100μm，与细胞接种通道11形成十字型通道。所述水性溶液进液通道11宽度为100μm，与细胞接种通道13形成十字型通道。所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道 11的宽度相同，均为100μm；所述细胞接种通道13、油性溶液进液通道12和水性溶液进液通道11的横截面高度相同，均为130μm。所述双乳化液滴缓冲存储区14为三角形通道，三角形一端顶点处连接细胞接种通道13，另一端底边连接双乳化液滴锚定区15。三角形通道张角为150°，对应底边宽度为 12000μm。所述双乳化液滴缓冲存储区14横截面高度为130μm。所述双乳化液滴锚定区15设有25排圆形微腔室，每排包含20个圆形微腔室，相邻两排间距为400μm，每排内的圆形微腔室的间距为100μm；圆形微腔室的直径为 100μm；每一排上的相邻的圆形微腔室由直通道连接，所述直通道长度为100 μm，宽度为50μm。所述双乳化液滴锚定区一端连接在双乳化液滴缓冲存储区14底边，另一端连接锚定液滴排出通道19。

所述双乳化液滴锚定区15横截面高度为130μm。所述锚定液滴排出通道 19为三角形通道，三角形一端底边连接双乳化液滴锚定区15，对应顶点处连接锚定细胞排出通道出口d。三角形通道张角为150°，对应底边宽度为10000 μm。所述锚定液滴排出通道19横截面高度为130μm。

所述多余液滴排出通道由通道16，通道17和通道18组成。所述通道16 与通道17分别排列在所述双乳化液滴锚定区两侧，为宽度不变的直通道，宽度为200μm。所述通道16与通道17分别连接所述双乳化液滴缓冲存储区14 底边的端点。所述通道18为宽度不变的直通道，宽度为200μm，两端分别连接所述通道16和通道17。所述多余液滴排出通道16、17和18横截面高度相同，均为130μm。

用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的制作方法为：1、采用光刻胶制作微流控芯片阳模：芯片制作采用光刻技术，采用SU-8 2100光刻胶工艺制作芯片微通道阳模，阳模厚度为130μm。

2、微流控芯片的制备：将PDMS预聚物和交联剂按质量比10:1混匀，浇铸于阳模表面，待液体中气泡完全去除后80℃加热固化2h，从阳模表面剥离切片并打孔，得到有微流控通道的上层基片。将PDMS预聚物和交联剂按质量比10:1混匀，采用1400转/分钟的转速涂覆于玻璃片表面，80℃加热固化2h 得到有PDMS薄膜的下层底片。等离子清洗仪清洗上层基片及下层底片，然后将上层基片与下层底片进行封合，得到微流控芯片。

实施例2本实施例为实施例1所述处理悬浮细胞的微流控芯片的微流控通道表面亲水性处理方法，包括如下步骤：

第一步，将4wt％聚乙烯醇(PVA)的水溶液从水性溶液进液通道入口a通入微流控芯片，使用恒压泵将5KPa的空气从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入微流控芯片并将空气保持在油性溶液进液通道12和细胞接种通道13之中。聚乙烯醇水溶液进入水性溶液进液通道11，双乳化液滴缓冲存储区14，双乳化液滴锚定区15，锚定液滴排出通道19，多余液滴排出通道 16、17及18，浸泡时间为15min。

第二步，从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c使用恒压泵以0.1Mpa压力通入空气至完全充满整个通道，完全排出微流控通道内部的聚乙烯醇水溶液。

第三步，90-120℃烘焙微流控芯片5min。

第四步，重复上述第一步至第三步3-5次。

实施例3本实施例为实施例1所述处理悬浮细胞的微流控芯片的产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法，包括如下步骤：

第一步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将载有悬浮细胞人类白血病细胞系TF-1的细胞培养液含有0.5wt％PVA的DMEM溶液从细胞接种通道入口13以200-1000μL/h的流速泵入细胞接种通道13。

第二步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，由硅油PMX-200和PDMS 预聚物按照体积比7：3混合成油性溶液32，由油性溶液进液通道入口b以 200-1000μL/h的流速泵入油性溶液进液通道12，流速与所述含有单个悬浮细胞的DMEM流速相同。

第三步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，由含有0.5wt％PVA 的DMEM与甘油按照体积比8：2混合成水性溶液31，由水性溶液进液通道入口a以2000-6000μL/h的流速泵入水性溶液进液通道11，与油性溶液进液通道12流出的含有油包水液滴的油性溶液在十字型通道处汇合，通过控制水性溶液和油性溶液的流速比，形成粒径可控的水包油包水双乳化液滴。所述双乳化液滴中包覆有单个悬浮细胞。

第四步，所述双乳化液滴进入双乳化液滴缓冲存储区14，当液滴在双乳化液滴缓冲存储区14中积累到一定数量之后会分别进入双乳化液滴锚定区14 的圆形微腔室之中。此时停止细胞接种通道11、油性溶液进液通道12以及水性溶液进液通道13的溶液泵入，双乳化液滴在圆形微腔室中由于表面张力恢复为球形，并且被锚定在圆形微腔室之中。

实施例4本实施例为实施例1所述处理悬浮细胞的微流控芯片的处理和实时观察悬浮细胞的方法，其建立悬浮细胞活性荧光染色的处理和实施观察方法，包括如下步骤：

第一步，按照所述实施例3将包覆有单个悬浮细胞人类白血病细胞系TF-1 的双乳化液滴锚定在所述微流控芯片的圆形微腔室中。

第二步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将细胞培养基DMEM 溶液以200μL/h的流速从水性溶液进液通道11泵入所述微流控芯片，将油性溶液进液通道12中残余的油性溶液32从油性溶液进液通道入口b排出所述微流控芯片，将未锚定于双乳化液滴锚定区中圆形微腔室的双乳化液滴分别从多余液滴排出通道16、17、18和锚定液滴排出通道19排出。

第三步，在暗室环境中，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道11以50μL/h的流速泵入所述微流控芯片，同时将用于对悬浮细胞进行细胞活性荧光染色处理的试剂二乙酸荧光素(FDA)分别从油性溶液进液通道12和细胞接种通道13以50μL/h的流速泵入所述微流控芯片。所述DMEM与FDA在双乳化液滴缓冲区混合后向双乳化液滴锚定区进行灌注，持续时间为15min，完成对于悬浮细胞完成处理。

第四步，在暗室环境中，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将细胞培养基DMEM溶液从水性溶液进液通道11以200μL/h流速泵入所述微流控芯片，将所述微流控芯片中残余的FDA溶液分别从油性溶液进液通道入口b、细胞接种通道入口c、多余液滴排出通道16、17、18以及锚定液滴排出通道 19排出所述微流控芯片，持续时间为15min。

第五步，将所述微流控芯片放置于显微镜载物台上，通过调节合适的所述微流控芯片的位置以及选用200倍放大倍数的显微镜头，施加以蓝色激发光源，即可实时观察处理中或者已处理的位于被锚定的双乳化液滴内部的单个TF-1细胞，具有良好活性的细胞发出绿色荧光，死亡细胞没有荧光。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范本，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，包括有微流控通道的上层基片以及与该上层基片封合的下层底片；所述上层基片中的微流控通道由双乳化液滴产生区、双乳化液滴缓冲存储区、双乳化液滴锚定区、多余液滴排出通道、锚定液滴排出通道组成；双乳化液滴产生区连接双乳化液滴缓冲存储区；所述双乳化液滴锚定区一端连接双乳化液滴缓冲存储区，另一端连接锚定液滴排出通道；所述多余液滴排出通道连接所述双乳化液滴缓冲存储区；所述下层底片由玻璃片及涂覆在玻璃片表面的高分子材料薄膜组成；所述双乳化液滴产生区用于产生包覆单个悬浮细胞的双乳化液滴，以及为芯片内部锚定的悬浮细胞提供生化处理试剂；所述双乳化液滴缓冲存储区用于暂时存储生成的双乳化液滴；所述双乳化液滴锚定区设有若干圆形微腔室，用于捕获和锚定单个双乳化液滴；所述多余液滴排出通道用于排出过量的双乳化液滴；所述锚定液滴排出通道用于排出经过处理后的包覆有悬浮细胞的双乳化液滴以实现回收；

所述双乳化液滴产生区由细胞接种通道、与细胞接种通道连通的油性溶液进液通道和与细胞接种通道连通的水性溶液进液通道构成；所述细胞接种通道一端为细胞接种通道入口c；所述油性溶液进液通道一端为油性溶液进液通道入口b，一端与细胞接种通道形成十字型通道；所述水性溶液进液通道一端为水性溶液进液通道a，一端与细胞接种通道形成十字型通道；所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；

所述双乳化液滴缓冲存储区为三角形通道一，三角形通道一的三角形顶点处连接水性溶液进液通道，对应底边连接双乳化液滴锚定区；所述双乳化液滴缓冲存储区横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；所述锚定液滴排出通道为三角形通道二，三角形通道二的三角形底边连接双乳化液滴锚定区，对应顶点锚定液滴排出口d；所述锚定液滴排出通道横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；

所述双乳化液滴锚定区设有20-50排圆形微腔室，每排包含25-50个圆形微腔室，相邻两排间距为200-500μm，每排内的圆形微腔室的间距为50-100μm；圆形微腔室的直径为100-150μm；每一排上的相邻的圆形微腔室由直通道连接，所述直通道长度为100-150μm，宽度为50-75μm；所述双乳化液滴锚定区一端连接在双乳化液滴缓冲存储区底边，另一端连接锚定液滴排出通道；所述双乳化液滴锚定区横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同；

所述多余液滴排出通道由分布于所述双乳化液滴锚定区两侧的通道一、通道二和位于双乳化液滴锚定区下方的通道三组成；所述通道一与通道二分别连接所述双乳化液滴缓冲存储区底边的端点；所述通道三分别连接通道一和通道二；多余液滴排出通道出口e连接通道三的中间；所述多余液滴排出通道横截面高度与所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同。

2.根据权利要求1所述的用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片上层基片的材料、下层底片的涂覆材料均为聚二甲基硅氧烷材料；所述下层底片的材料为玻璃。

3.根据权利要求1所述的用于实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片，其特征在于：所述细胞接种通道为宽度不变的直通道，宽度为50-100μm；所述油性溶液进液通道宽度为100-200μm；所述水性溶液进液通道宽度为100-200μm；所述细胞接种通道、油性溶液进液通道和水性溶液进液通道的横截面高度相同，均为100-150μm；三角形通道一张角为90°-150°，底边宽度为6000-12000μm；三角形通道二张角为90°-150°，底边宽度为4000-10000μm；所述通道一、通道二和通道三为宽度不变的直通道，宽度为100-200μm。

4.如权利要求1所述的实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：

第一步，利用计算机绘图软件设计好芯片结构，通过激光照排机制作对应的光刻掩膜版；

第二步，将光刻胶涂覆于硅片表面，进行紫外曝光和显影，将掩膜版上的图样转移到光刻胶上，得到上层基片的模板；

第三步，将聚二甲基硅氧烷材料浇铸到模板表面，经过除气泡、烘焙、打孔得到上层基片；

第四步，将聚二甲基硅氧烷材料涂覆于玻璃片表面，烘焙得到下层底片；

第五步，将有微流控通道的上层基片与下层底片进行封合，制成微流控芯片。

5.权利要求1所述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片的微流控通道表面亲水性处理方法，包括如下步骤：第一步，将4wt％聚乙烯醇的水溶液从水性溶液进液通道入口a通入微流控芯片，将5KPa压强的空气从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入微流控芯片，聚乙烯醇水溶液依次引入水性溶液进液通道、双乳化液滴缓冲存储区、双乳化液滴锚定区、锚定液滴排出通道、多余液滴排出通道，持续时间为10-60min；

第二步，从油性溶液进液通道入口b和细胞接种通道入口c通入空气至完全充满整个通道并且排出微流控通道内部的聚乙烯醇水溶液；

第三步，90-120摄氏度烘焙微流控芯片10-30min；

第四步，重复上述第一步至第三步3-5次。

6.权利要求1所述实时观察和处理悬浮细胞的微流控芯片在产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法，包括如下步骤：第一步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将载有悬浮细胞的缓冲液从细胞接种通道入口c泵入细胞接种通道；

第二步，油性溶液由油性溶液进液通道入口b泵入油性溶液进液通道，与细胞接种通道流出的含有单个悬浮细胞的缓冲液在十字型通道处汇合，通过控制油性溶液和缓冲液的流速比，形成粒径可控的油包水液滴；所述油包水液滴中包覆有单个悬浮细胞；

第三步，水性溶液由水性溶液进液通道入口a泵入水性溶液进液通道，与油性溶液进液通道流出的含有油包水液滴的油性溶液在十字型通道处汇合，通过控制水性溶液和油性溶液的流速比，形成粒径可控的水包油包水双乳化液滴；所述双乳化液滴中包覆有单个悬浮细胞；

第四步，所述双乳化液滴进入双乳化液滴缓冲存储区，当液滴在双乳化液滴缓冲存储区中积累到一定数量之后会分别进入双乳化液滴锚定区中的圆形微腔室之中；双乳化液滴在圆形微腔室中由于表面张力恢复为球形，并且被锚定在圆形微腔室之中。

7.权利要求1所述微流控芯片在处理和实时观察悬浮细胞的方法，包括如下步骤：

第一步，按照所述微流控芯片在产生和锚定包覆悬浮细胞单细胞的双乳化液滴的方法将包覆有单个悬浮细胞的双乳化液滴锚定在所述微流控芯片的圆形微腔室中；

第二步，通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片，将油性溶液进液通道中残余的油性溶液从油性溶液进液通道入口b排出，将细胞接种通道中残余的载有悬浮细胞的缓冲液从细胞接种通道入口c排出，将未锚定于双乳化液滴锚定区圆形微腔室中的双乳化液滴分别从锚定液滴排出通道出口d和多余液滴排出通道出口e排出；

第三步，在第二步通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片的同时将用于对悬浮细胞进行处理的生化试剂分别从油性溶液进液通道和细胞接种通道泵入所述微流控芯片；所述缓冲液与用于对悬浮细胞处理的试剂在双乳化液滴缓冲区混合后向双乳化液滴锚定区进行灌注，所述用于对悬浮细胞处理的试剂逐步扩散至被锚定的双乳化液滴内，对于悬浮细胞完成处理；

第四步，在第二步通过外部泵提供驱动力对流体进行操控，将缓冲液从水性溶液进液通道入口a泵入所述微流控芯片后，将所述微流控芯片中残余的用于对悬浮细胞处理的生化试剂分别从油性溶液进液通道入口b、细胞接种通道入口c、锚定液滴排出通道出口d和多余液滴排出通道出口e排出；所述缓冲液向双乳化液滴锚定区进行灌注，完成清洗处理；

第五步，将所述微流控芯片放置于显微镜载物台上，通过调节所述微流控芯片的位置并通过显微镜物镜镜头即可实时观察处理中或者已处理的位于被锚定的双乳化液滴内部的单个悬浮细胞。

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