CN112774748B - 一种微坑锚定液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种微坑锚定液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用，所述芯片包括自上而下依次贴合的上层芯片和盖玻片，上层芯片靠近盖玻片的表面为功能层，功能层设有第一水相进样口、第二水相进样口、油相进样口和多条液滴排布通道；第一水相进样口用于通入冷冻保护剂，第二水相进样口用于通入细胞悬液，第一水相进样口、第二水相进样口和油相进样口均与液滴排布通道连通；沿液滴排布通道均布有多个液滴捕获腔室，每个液滴捕获腔室内部设有微坑，微坑的开口朝向盖玻片。本申请能够为单细胞提供皮升级别的冷冻体系，还可以保证冷冻冻融过程中液滴的稳定性，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。

Description

一种微坑锚定液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用

技术领域

本申请涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种微坑锚定液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用。

背景技术

随着卵泡浆单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection，简称ICSI)的发展，使严重稀少精子患者生育子代成为可能。对于严重少弱精子症或精液中间歇存在活动精子，以备ICSI技术；对于梗阻性与非梗阻性输精管手术治疗，输精管缺如患者输精管切除术后还想要生育孩子，以及患有肿瘤患者需要接触放射线治疗的男性，在生育力丧失之前来进行精液采集和存储，能够给予储存者未来做父母的希望。

在ICSI技术中，附睾和睾丸精子数量不足，质量较差，冷冻复苏率低，活力弱，冷冻保存后则体外受精结果差，依赖于ICSI辅助受精获成功；精子冷冻保存后与卵子融合的能力不会丢失，而且ICSI技术只需要选择一条活动精子，故解冻后只要存在数量有限的活动精子，仍可满足ICSI技术对精子数的要求。因此，提供一种单细胞的冷冻技术，以实现稀少精子的冷冻，在辅助生殖临床治疗上是非常有必要的。

发明内容

本申请的目的在于提供一种微坑锚定液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用，通过微坑将单细胞液滴固定，能够为单细胞提供皮升级别的冷冻体系，还可以保证冷冻冻融过程中液滴的稳定性，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。

本申请是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本申请提供一种微坑锚定液滴阵列芯片，包括自上而下依次贴合的上层芯片和盖玻片，所述上层芯片靠近所述盖玻片的表面为功能层，所述功能层设有第一水相进样口、第二水相进样口、油相进样口和多条液滴排布通道；所述第一水相进样口用于通入冷冻保护剂，所述第二水相进样口用于通入细胞悬液，所述第一水相进样口、所述第二水相进样口和所述油相进样口均与所述液滴排布通道连通；沿所述液滴排布通道均布有多个液滴捕获腔室，每个所述液滴捕获腔室内部设有微坑，所述微坑的开口朝向所述盖玻片。

进一步地，还包括第一水相管路、第二水相管路和油相管路；所述第一水相管路的一端与所述第一水相进样口连通，所述第二水相管路的一端与所述第二水相进样口连通，所述第一水相管路的另一端与所述第二水相管路的另一端汇聚形成一条总水相管路；所述油相管路包括从所述油相进样口分出的第一油相管路支路和第二油相管路支路，所述第一油相管路支路和所述第二油相管路支路对称设于所述总水相管路的两侧；所述总水相管路与所述第一油相管路支路和所述第一油相管路支路汇聚形成液滴生成区。

进一步地，所述液滴生成区与所述液滴排布通道的入口之间设有液滴排布缓冲区，所述液滴生成区与所述液滴排布缓冲腔之间设有液滴喷口。

进一步地，所述所述液滴喷口的直径设置为预设液滴直径的一半。

进一步地，所述微坑的直径设置为预设液滴直径的1/3～2/3；所述微坑的高度设置为固定单个液滴。

进一步地，所述液滴捕获腔室的高度与所述微坑的高度的加和等于所述预设液滴直径。

进一步地，所述上层芯片的材质为聚二甲基硅氧烷或塑料。

进一步地，所述盖玻片的厚度不大于150μm。

第二方面，本申请提供一种上述的微坑锚定液滴阵列芯片在单细胞液滴生成的应用。

第三方面，本申请提供一种基于上述的微坑锚定液滴阵列芯片的液滴生成方法，包括：

从第一水相进样口或第二水相进样口通入水相样品，排出空气；

从油相进样口通入矿物油，将芯片预先浸润；

设定油相进样口、第一水相进样口和第二进样口在进样压力上相等，在油相进样口处通入矿物油，在第一水相进样口处通入冷冻保护剂，在第二水相进样口处通入细胞悬液，持续稳定生成具有预设直径的单细胞液滴，进入液滴排布通道；

停止加压后，所述单细胞液滴自动排布于所述微坑内。

实施本申请，具有如下有益效果：

1、本申请通过微坑锚定液滴，将单细胞液滴固定在芯片微坑中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冻融过程中液滴的稳定性，保证液滴在冷冻冻融过程中不会发生融合，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。

2、由于本申请中的液滴阵列芯片为单细胞提供了极小的冷冻体系，能够大大降低精子等单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

3、本申请中的液滴阵列芯片具有两个水相进样口和一个油相进样口，两个水相进样口分别通入细胞悬液和对应的冷冻保存剂的成分，可以实现冷冻保护剂的快速加载，冷冻保护剂在生成液滴的瞬间包裹单细胞，能够避免细胞损伤，还可以通过调整冷冻保存剂的流量来实现调节单细胞冷冻保存剂配方的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本申请实施例的微坑锚定液滴阵列芯片的俯视示意图；

图2为本申请实施例的微坑锚定液滴阵列芯片的侧视示意图；

图3为本申请实施例微坑锚定液滴的示意图；

图4为基于本申请实施例的微坑锚定液滴阵列芯片生成液滴的流程示意图；

图5为在冷冻之后芯片内液滴融合的显微镜表征示意图；

附图标记对应为：1-盖玻片、2-上层芯片、3-油相进样口、4-第一水相进样口、5-第二水相进样口、6-微坑、7-第一水相管路、8-第二水相管路、9-总水相管路、10-第一油相管路支路、11-第二油相管路支路、12-液滴喷口、13-液滴排布缓冲区。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本申请作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

实施例

细胞冷冻过程中，首先胞外溶液形成冰晶，造成活细胞外高渗透压环境，驱动水分从胞内转移至胞外，这种冷冻方法容易导致细胞损伤。目前精子常使用慢速冷冻法进行冻存，其最理想的冷冻速率是既要保证胞内尽可能少的形成冰晶，也要保证细胞不为胞外高渗环境损伤。现有研究表明，从理论上，冷冻保护剂的浓度与冷冻速率之间负相关，即冷冻速率越快，所需要的冷冻保护剂浓度越低，可以设想，当冷冻速率接近极限快时，所需的冷冻保护剂浓度接近于零，这便是无冷冻保护剂却达到理想冷冻效果的理论基础。由于精子在自身结构上具有体积小、胞浆少的特点，从而有可能在不添加冷冻保护剂以及极快降温速率的情况下，瞬间形成玻璃样固体，却不形成冰晶。所以，只要寻找到一种体积足够小的冷冻载体，就极有希望在不添加冷冻保护剂情况下实现小体积的单细胞的理想冷冻，以避免冷冻过程中造成的细胞损伤。

微流控技术具有易操控、体系小、污染少等特点，而液滴微流控是微流控技术中的一大分支，在操作性、通量以及效率上有着巨大的优势。液滴微流控能够快速的对患者的精子样本进行冷冻保存剂的加载以及去除，以及对于解冻后单细胞的操控也是十分的方便。对比现有的的冷冻载体，由于微小的冷冻体系以及较大的比表面积能够实现超快速的冻融，大大减少了冰晶的形成，从而能够减小冷冻对精子等单细胞产生的伤害。且由于冷冻载体的芯片化，其体积大大减小，能够大大节省液氮的使用量，且便于规范化。目前使用的液滴生成装置包裹的单细胞液滴在低温的状态下存在不稳定、液滴融合的情况，给后续细胞的操控以及冻融状态下细胞的保存带来非常大的挑战。

为此，本申请实施例提供一种微坑锚定液滴阵列芯片，参阅图1-2，本实施例中的芯片包括自上而下依次贴合的上层芯片2和盖玻片1，上层芯片2靠近盖玻片1的表面为功能层，功能层设有第一水相进样口4、第二水相进样口5、油相进样口3和多条液滴排布通道；第一水相进样口4用于通入冷冻保护剂，第二水相进样口5用于通入细胞悬液，第一水相进样口4、第二水相进样口5和油相进样口3均与液滴排布通道连通；沿液滴排布通道均布有多个液滴捕获腔室，每个液滴捕获腔室内部设有微坑6，微坑6的开口朝向盖玻片1。

本申请实施例中通过微坑锚定液滴排布阵列，用含有冷冻保护剂的液滴包裹单细胞，将液滴固定在芯片中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冻融过程中液滴的稳定性，保证液滴在冷冻过程中不会发生融合，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。而且，由于本申请中的液滴阵列芯片为单细胞提供了极小的冷冻体系，能够大大降低精子等单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

在一个具体的实施方式中，芯片还包括第一水相管路8、第二水相管路7和油相管路；第一水相管路8的一端与第一水相进样口4连通，第二水相管路7的一端与第二水相进样口5连通，第一水相管路8的另一端与第二水相管路7的另一端汇聚形成一条总水相管路9；油相管路包括从油相进样口3分出的第一油相管路支路10和第二油相管路支路11，第一油相管路支路10和第二油相管路支路11对称设于总水相管路9的两侧；总水相管路9与第一油相管路支路10和第一油相管路支路11汇聚形成液滴生成区。

本实施例中，液滴生成处有三个进样口，分别为两个水相进样口和一个油相进样口。两个水相进样口可以分别通入细胞悬液和对应的细胞冷冻保护剂，以实现细胞冷冻保护剂的快速加载，冷冻保存剂在生成液滴的瞬间包裹单液滴，能够避免细胞损伤。除了能够实现单细胞高通量的冷冻保存之外，本申请实施例中的芯片还通过两个水相进样口，可以实现对于单细胞冻存最优的冷冻保护剂配方的调节，例如可以借助微纳平台制造出的微流控装置，实现包裹单细胞的液滴的连续生成，在连续生成的过程中改变两个水相进样口的压力比从而改变流量比，以调整水相即冷冻保护剂的配方来实现调节单细胞冻存的合适的冷冻保护剂配方的目的。

在一个具体的实施方式中，液滴生成区与液滴排布通道的入口之间设有液滴排布缓冲区13，液滴生成区与液滴排布缓冲腔13之间设有液滴喷口12。

在一个具体的实施方式中，液滴喷口12的直径设置为预设液滴直径的一半。

在一个具体的实施方式中，微坑6的直径设置为预设液滴直径的1/3～2/3；微坑6的高度设置为固定单个液滴。

在一个具体的实施方式中，液滴捕获腔室的高度与微坑6的高度的加和等于预设液滴直径。

在一个具体的实施方式中，上层芯片2的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或塑料。

本实施例中，冻融过程中，芯片用的玻璃衬底越薄，液滴的升降及温速度越快。考虑到在升降温的过程中，聚二甲基硅氧烷材质的上层芯片和玻璃的热膨胀系数不同，若使用常规的载玻片，在冷冻过程中玻璃片会被聚二甲基硅氧烷拉断，因此本实施例中使用盖玻片来作为衬底，盖玻片1的厚度不大于150μm，在该厚度下，玻璃呈现出一定的韧性，在快速升温及降温的情况下不会碎裂，从而避免造成冷冻样品的泄漏。

本实施例中，液滴阵列芯片的进样通道包括油相进样通道和水相进样通道，油相进样通道由第一油相管路支路和第二油相管路支路形成，水相进样通道由第一水相管路、第二水相管路和总水相管路形成，进样通道的尺寸设计过程具体如下：

对于离散度较好的细胞样本中，假设细胞之间没有聚团的现象，理论上液滴的尺寸可以设计成接近最大细胞尺寸的大小，设计液滴喷口的尺寸为液滴尺寸的一半，然后根据液滴排布通道的结构尺寸确定液滴的体积与周围油相的体积的比值来设计液滴生成通道的流阻，从而可以确定芯片进样通道的尺寸。

根据如下的流体阻力的公式来设计连续相以及分散相的通道，其中μ代表流体的粘度，l、w、h分别代表通道的长度、宽度以及高度；

流体阻力的公式：

其中，流量、压力以及流阻的关系为：P＝R*Q，

其中P代表芯片进样口处的进样压力，R代表流阻，Q代表进样口的流量。

根据液滴排布通道的结构来计算分散相以及连续相的体积比，用体积比代表流量比，当压力相等的情况下计算流阻比，得到通道流阻设计的相关参数。

本实施例用含有冷冻保护剂的液滴包裹单细胞，然后通过液滴排布阵列将液滴固定在芯片中保持稳定不动。具体地，参阅图3，在对芯片加压时，稳定生成液滴，由于快速的运动，液滴几乎始终保持一个压扁的状态，此时的液滴处于一个较高的表面势能状态。当压力停止的时候，液滴的运动逐渐停止，由于生成液滴的尺寸以及密度与芯片中微坑的直径和高度以及液滴捕获腔室的高度等结构参数相适配，因此当液滴要恢复成球形即表面势能最低的状态时，液滴会掉入微坑中。

本实施例中，通过液滴以及微流控结构能够稳定冷冻体系不受温度突变的影响，并能够高效地实现冷冻和冻融以及冷冻保护剂的快速加载。由于极小的冷冻体系，从而可以实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻，一片芯片完全能够存储十万以上的细胞。本申请实施例中的芯片，操作简单，易于使用，可以用作生殖发育实验室甚至临床上的通用装置。

本实施例中的芯片的制作方法具体如下：

S1、硅模具的制作，具体包括：

S11、根据芯片结构设计掩膜并以硅作为衬底进行相应的光刻并得到光刻胶为主体的掩膜；S12、使用反应离子刻蚀进行相应的刻蚀得到所需高度的结构；S13、将制作好的上层硅片模具进行硅烷化。

S2、上层最终模具的制作，具体包括：

S21、将第一材料浇注到上层硅片模具上并一起加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口得到中间模具；S22、将第二材料浇注到中间模具中，第二材料填充上层中间模具的打孔位置，并固化形成对应进样口、出样口，剥离固化的第二材料，得到上层最终模具。

S3、PDMS芯片的制作，具体包括：

S31、将第一材料浇注到上层最终模具中，使第一材料的液面没过上层最终模具上的柱子，随后加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口处打孔，得到上层芯片；S32、选用厚度不大于150μm的盖玻片作为芯片键合的衬底，盖玻片的长度和宽度根据上层芯片的尺寸确定；通过等离子键合，将上层芯片与盖玻片键合在一起，得到液滴阵列芯片。

在上述液滴阵列芯片的制作方法中，第一材料为PDMS，且第一材料是通过配置其预聚物和固化剂混合物并在搅拌均匀后抽真空直至气泡消失而得到的；第二材料为环氧树脂。

本申请的另一实施例提供一种上述的微坑锚定液滴阵列芯片在单细胞液滴生成的应用。

本申请的另一实施例还提供一种基于上述的微坑锚定液滴阵列芯片的液滴生成方法，参阅图4，该液滴生成方法包括：

从第一水相进样口或第二水相进样口通入水相样品，排出空气；

从油相进样口通入矿物油，将芯片预先浸润；

设定油相进样口、第一水相进样口和第二进样口在进样压力上相等，在油相进样口处通入矿物油，在第一水相进样口处通入冷冻保护剂，在第二水相进样口处通入细胞悬液，持续稳定生成具有预设直径的单细胞液滴，进入液滴排布通道；

停止加压后，单细胞液滴自动排布于微坑内，具体操作可以是停止微流体进样泵的压力，将枪头插在进样口处待液滴排布稳定；然后拔去枪头，周围涂敷矿物油密封。

本实施中，形成液滴排布阵列后，将芯片置于冷冻保存盒中然后置于-80℃冰箱中约两小时；再置于液氮罐中冷冻保存，即实现单细胞的冷冻，以精子为例，冷冻之后的液滴排布阵列如图5所示，可以看出，冷冻过程中液滴没有发生融合，表明液滴在冷冻过程中具有很好的稳定性。

上述冷冻单细胞在需要使用时，将芯片从液氮罐中取出，置于预热好的36℃热板上解冻约1min；解冻完成之后，在芯片进样口通入矿物油让液滴发生融合，并将液滴排出阵列；对于稀有的样本可以直接采用显微操作将细胞捕获；对于大量样本可以将排出的液滴收集后加入培养基中离心得到。

本领域技术人员可以理解的是，本申请实施例中的芯片以及液滴生成方法，除了用于精子的冷冻之外，还可以应用于干细胞、植物种子、单细胞化的癌症肿瘤组织等，当然，也可以应用与其他类型的单细胞，本申请实施例对此不做具体限定。

本申请的上述实施例，具有如下有益效果：

1、本申请实施例通过微坑锚定液滴，将单细胞液滴固定在芯片微坑中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冻融过程中液滴的稳定性，保证液滴在冷冻冻融过程中不会发生融合，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。

2、由于本申请中的液滴阵列芯片为单细胞提供了极小的冷冻体系，能够大大降低精子等单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

3、本申请中的液滴阵列芯片具有两个水相进样口和一个油相进样口，两个水相进样口分别通入细胞悬液和对应的冷冻保存剂的成分，可以实现冷冻保护剂的快速加载，冷冻保护剂在生成液滴的瞬间包裹单细胞，能够避免细胞损伤，还可以通过调整冷冻保存剂的流量来实现调节单细胞冷冻保存剂配方的目的。

以上所述是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种微坑锚定液滴阵列芯片，其特征在于，包括自上而下依次贴合的上层芯片（2）和盖玻片（1），所述上层芯片（2）靠近所述盖玻片（1）的表面为功能层，所述功能层设有第一水相进样口（4）、第二水相进样口（5）、油相进样口（3）和多条液滴排布通道；

所述第一水相进样口（4）用于通入冷冻保护剂，所述第二水相进样口（5）用于通入细胞悬液，所述第一水相进样口（4）、所述第二水相进样口（5）和所述油相进样口（3）均与所述液滴排布通道连通；

从所述第一水相进样口（4）通入的冷冻保护剂与从所述第二水相进样口（5）通入的细胞悬液混合后，与从所述油相进样口（3）通入的液体混合；沿所述液滴排布通道均布有多个液滴捕获腔室，每个所述液滴捕获腔室内部设有微坑（6），所述微坑（6）的开口朝向所述盖玻片（1），所述微坑（6）的高度和所述液滴捕获腔室的高度的加和等于预设液滴的直径，通过对所述芯片施压和释压，利用所述液滴的表面势能，使得液滴掉入所述微坑；

所述微坑（6）的直径设置为预设液滴直径的1/3~2/3；所述微坑（6）的高度设置为固定单个液滴。

2.根据权利要求1所述的微坑锚定液滴阵列芯片，其特征在于，还包括第一水相管路（8）、第二水相管路（7）和油相管路；

所述第一水相管路（8）的一端与所述第一水相进样口（4）连通，所述第二水相管路（7）的一端与所述第二水相进样口（5）连通，所述第一水相管路（8）的另一端与所述第二水相管路（7）的另一端汇聚形成一条总水相管路（9）；

所述油相管路包括从所述油相进样口（3）分出的第一油相管路支路（10）和第二油相管路支路（11），所述第一油相管路支路（10）和所述第二油相管路支路（11）对称设于所述总水相管路（9）的两侧；

所述总水相管路（9）与所述第一油相管路支路（10）和所述第一油相管路支路（11）汇聚形成液滴生成区。

3.根据权利要求2所述的微坑锚定液滴阵列芯片，其特征在于，所述液滴生成区与所述液滴排布通道的入口之间设有液滴排布缓冲区（13），所述液滴生成区与所述液滴排布缓冲区 （13）之间设有液滴喷口（12）。

4.根据权利要求3所述的微坑锚定液滴阵列芯片，其特征在于，所述液滴喷口（12）的直径设置为预设液滴直径的一半。

5.根据权利要求1所述的微坑锚定液滴阵列芯片，其特征在于，所述上层芯片（2）的材质为聚二甲基硅氧烷或塑料。

6.根据权利要求1所述的微坑锚定液滴阵列芯片，其特征在于，所述盖玻片（1）的厚度不大于150μm。

7.一种权利要求1-6任一项所述的微坑锚定液滴阵列芯片在单细胞液滴生成的应用。

8.一种基于权利要求1-6任一项所述的微坑锚定液滴阵列芯片的液滴生成方法，其特征在于，包括：

从第一水相进样口（4）或第二水相进样口（5）通入水相样品，排出空气；

从油相进样口（3）通入矿物油，将芯片预先浸润；

设定油相进样口（3）、第一水相进样口（4）和第二进样口（5）在进样压力上相等，在油相进样口（3）处通入矿物油，在第一水相进样口（4）处通入冷冻保护剂，在第二水相进样口（5）处通入细胞悬液，持续稳定生成具有预设直径的单细胞液滴，所述液滴以压扁的状态进入液滴排布通道；

停止加压后，利用所述液滴的表面势能，使得所述液滴从扁形恢复成球形，掉入所述微坑（6）并自动排布于所述微坑（6）内。

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