CN108940387A - 一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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张晓庆
姜雷
苏文涛
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Abstract

本发明提供了一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片及其制备方法。该芯片由两层组成，上层为液滴生成单元，下层为液滴捕获单元；液滴生成单元设置有下述结构：分散相入口(1)、连续相入口(2)、分散相进液通道(3)、连续相进液通道(4)、液滴生成十字通道(5)、液体流出通道(6)、出液口(7)、储液池(8)。该芯片采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU‑8芯片模板，经过聚二甲基硅氧烷(PDMS)反模得到PDMS芯片。该芯片具备灵活的液滴生成单元，具有高通量的单细胞捕获单元，本发明结构结构简单，操作方便，效率高，细胞和试剂用量少，应用范围广泛。

Description

一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于微流控技术和聚合物芯片的加工、制作等领域，具体涉及一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片及其制备方法。
背景技术
微流控芯片实验室早期致力于芯片电泳的研究，并提出了微全分析系统(μ-TAS)的概念，研究工作主要集中在连续流微流控系统。近年来，微流控芯片领域出现了一个新的分支-非连续流微流控系统，即液滴微流控系统。液滴微流控系统使用不相溶的两相流体在微孔道界面处形成液滴，这类液滴的体积通常在纳升至皮升(10-9～10-12L)范围。相对于连续流系统，液滴具有体积小、低扩散、无交叉污染、快速的反应动力学等特点，并且具有高通量分析的潜力。经过几年的发展，液滴的制备技术已日趋成熟；同时，液滴的分裂、融合、混合、分选、存储和编码等丰富多样的操控技术也都有广泛的报道。
近几年的生物学和医学研究发现，针对单个细胞的细胞生物学研究有着重要的意义。同一种细胞，不同细胞个体之间也可能有很大的差异，而变异最显著的细胞往往能够揭示重要生物学现象或者提示重大疾病的发生，揭示癌症发病机制，懂得细胞分化与组织发育原理，识别基因表达特性与细胞特征。因此，准确捕获差异显著的单细胞群体并进行精确鉴定是生物医学研究中急需的关键技术。
近年来，随着液滴微流控技术的迅速发展，其在单细胞分析中的应用引起了越来越多的关注。液滴作为单细胞微反应器，能够有效控制扩散，提高检测灵敏度，已被成功应用于多种单细胞分析中。然而，在微流控系统内研究单细胞，首要解决的问题就是如何对单细胞进行捕获，以实现单细胞的移动、固定等，然后才能对其进行分析和检测。目前，已发展出多种单细胞捕获技术，其驱动力主要包括流体压力、电动力、磁力、光学陷阱以及机械力等。其中，由于外部电学原件、磁力控制部件、光学传感器和机械控制器结构复杂，成本偏高，不便广泛应用。利用物理屏障捕获单细胞简单且成本低廉，但容易造成细胞损伤且不便于加载动态生化信号刺激。因此迫切需要一种能够长期捕获悬浮培养单细胞、减少细胞损伤且便于表征单细胞生物学行为的单细胞分离芯片。
本发明利用微流控和聚合物芯片的加工、制作技术制备了一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，整个装置结构简单，无需任何复杂和昂贵的设备，可实现高通量，操作方便，可快速分离悬浮培养的单细胞、减少细胞损伤且便于表征单细胞的生物学行为。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片及其制备方法，以解决以往单细胞分离过程中存在的操作步骤繁琐复杂、容易造成细胞损伤、捕获效率低等局限，本发明制备过程稳定，操作简单，集成度高。
一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，所述芯片由两层组成，上层为液滴生成单元，下层为液滴捕获单元；
所述芯片液滴生成单元具体设置有下述结构：分散相入口、连续相入口、分散相进液通道、连续相进液通道、液滴生成十字通道、液体流出通道、出液口、储液池；所述芯片下层由液滴捕获单元组成；
所述芯片的分散相入口连接分散相进液通道；
所述芯片的连续相入口连接连续相进液通道；
所述芯片的两个进液通道交汇处呈“十”字交叉，形成液滴生成十字通道；
所述芯片的液体流出通道连接液滴生成十字通道和出液口；
所述芯片包含一个开放式储液池，储液池连接出液口，位于液滴捕获单元上方；
所述芯片的上层通道宽度为50～100μm，高度为50～100μm；
所述芯片的下层结构为圆柱形的凹陷小坑结构，共有5000～10000个；
所述芯片的液滴捕获单元的直径为100～300μm，高度为100～200μm，每个单元间距为50～100μm；
所述芯片的开放式储液池是一个长方体，长15～35mm，宽15～35mm，高5～10mm。
所述PDMS芯片制备步骤如下：
(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板：SU-8模板的制备经过甩胶、前烘、曝光、后烘后，一次显影、坚膜得到；
(2)基于SU-8模板制得得的PDMS模块：将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于两个SU-8模板，75～85℃烘箱固化30～60min，将PDMS与SU-8模板剥离，分别得到带有结构的上、下层芯片；
(3)将上层PDMS模板沿着储液池边缘切割成通透的正方形大坑，将上层芯片的分散相入口和连续相入口打孔，与下层芯片经过氧等离子体处理1～4min后封接。
所述芯片的分散相成分为水相；所述芯片的连续相成分为油相；
所述芯片制备出的包裹单细胞的液滴为油包水乳化液滴，液滴直径为20～300μm。
所述芯片的水相单细胞悬液从分散相入口流经分散相进液通道，油相液体从连续相入口流经连续相进液通道，两相液体与十字通道交叉处汇合，当分散相被施加的流体驱动力大于其界面张力时,该处微量液体会突破界面张力进入连续相中形成油包水液滴；单细胞截留于液滴中，成功分离单细胞，液滴经过液体流出通道，从出液口流入到储液池；随着大量包裹单细胞的液滴生成，液滴流经液滴捕获单元上方，由于重力作用，慢慢沉降入液滴捕获单元，随后进行单细胞的生物学行为观察与检测。
所述芯片可用作高通量单细胞捕获，可进行单细胞原位培养、给药、增殖、诱导分化、单细胞测序等研究。
本发明的优点在于：
1、操作简便、快捷；
2、细胞与试剂用量少，实验成本低廉；
3、高度集成化；
4、应用范围广泛；
附图说明
图1为芯片结构示意图整体结构图，
图2为微流控芯片上层结构图；
图3为微流控芯片下层结构图；
图4为十字通道处为局部放大图；
图5为微流控芯片的前视图；
其中：1为分散相入口、2为连续相入口、3为分散相进液通道、4为连续相进液通道、5为液滴生成十字通道、6为液体流出通道、7为出液口、8为储液池、9为液滴捕获单元。
图6为微流控芯片实物图。
具体实施方式
一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示；所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；
所述芯片液滴生成单元具体设置有下述结构：分散相入口1、连续相入口2、分散相进液通道3、连续相进液通道4、液滴生成十字通道5、液体流出通道6、出液口7、储液池8；
所述芯片的分散相入口1连接分散相进液通道3；
所述芯片的连续相入口2连接连续相进液通道4；
所述芯片的两个进液通道交汇处呈“十”字交叉，形成液滴生成十字通道5；
所述芯片的液体流出通道6连接液滴生成十字通道5和出液口7；
所述芯片包含一个开放式储液池8，储液池连接出液口7，位于液滴捕获单元9上方。
实施例1
一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片的上层结构SU-8模板的制备
微流控芯片采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板；首先，在硅片上甩一层SU-8胶，厚度为100μm，95℃前烘20min，自然降温，将掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光30s，95℃后烘20min，自然降温；采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影10min，180℃坚膜2h，自然降温备用。
实施例2
一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片的下层结构SU-8模板的制备
首先，在硅片上甩一层SU-8胶，厚度为150μm，95℃前烘30min，自然降温，将掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光45s，95℃后烘30min，自然降温；采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影10min，180℃坚膜2h，自然降温备用。
实施例3
用于单细胞分离的PDMS芯片的制备
将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于前期制备的两个SU-8模板，80℃烘箱固化30min，将PDMS与SU-8模板剥离，得到带有结构的上层芯片和下层芯片；将上层PDMS芯片沿着储液池边缘切割成通透的正方形大坑，用打孔器在分散相入口和连续相入口打孔；将芯片上下层带结构一侧经等离子处理120s，键合封接备用。
所述芯片的水相单细胞悬液从分散相入口1流经分散相进液通道3，油相液体从连续相入口2流经连续相进液通道4，两相液体与十字通道5交叉处汇合，当分散相被施加的流体驱动力大于其界面张力时,该处微量液体会突破界面张力进入连续相中形成油包水液滴；单细胞截留于液滴中，成功分离单细胞，液滴经过液体流出通道6，从出液口7流入到储液池8；随着大量包裹单细胞的液滴生成，液滴流经液滴捕获单元9上方，由于重力作用，慢慢沉降入液滴捕获单元，随后进行单细胞的生物学行为观察与检测。

Claims (7)

1.一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，其特征在于：所述芯片由两层组成，上层为液滴生成单元，下层为液滴捕获单元(9)；
所述芯片液滴生成单元具体设置有下述结构：分散相入口(1)、连续相入口(2)、分散相进液通道(3)、连续相进液通道(4)、液滴生成十字通道(5)、液体流出通道(6)、出液口(7)、储液池(8)；
所述芯片的分散相入口(1)连接分散相进液通道(3)；
所述芯片的连续相入口(2)连接连续相进液通道(4)；
所述芯片的两个进液通道交汇处呈“十”字交叉，形成液滴生成十字通道(5)；
所述芯片的液体流出通道(6)连接液滴生成十字通道(5)和出液口(7)；
所述芯片包含一个开放式储液池(8)，储液池连接出液口(7)，位于液滴捕获单元(9)上方。
2.按照权利要求1所述一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，其特征在于：所述芯片液滴生成单元的通道宽度为50～100μm，高度为50～100μm。
3.按照权利要求1所述一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，其特征在于：所述芯片的下层液滴捕获单元为圆柱形的凹陷小坑结构，共有5000～10000个。
4.按照权利要求3所述一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，其特征在于：所述芯片的液滴捕获单元的直径为100～300μm，高度为100～200μm，每个单元间距为50～100μm。
5.按照权利要求1所述一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片，其特征在于：所述开放式储液池是一个长方体，长15～35mm，宽15～35mm，高5～10mm。
6.按照权利要求1所述一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板：SU-8模板的制备经过甩胶、前烘、曝光、后烘后，一次显影、坚膜得到；
(2)基于SU-8模板制得得的PDMS模块：将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于两个SU-8模板，75～85℃烘箱固化30～60min，将PDMS与SU-8模板剥离，分别得到带有结构的上、下层芯片；
(3)将上层PDMS模板沿着储液池边缘切割成通透的正方形大坑，将上层芯片的分散相入口和连续相入口打孔，与下层芯片经过氧等离子体处理1～4min后封接。
7.按照权利要求1所述一种用于单细胞分离的液滴微流控芯片的应用，其特征在于：所述芯片可用作高通量单细胞捕获，可进行单细胞原位培养、给药、增殖、诱导分化、单细胞测序等研究。
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