CN112675935B - 用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用，所述芯片包括自上而下依次贴合的上层芯片和盖玻片，上层芯片靠近盖玻片的表面为功能层，功能层设有第一水相进样口、第二水相进样口、油相进样口和多条液滴排布通道；第一水相进样口用于通入冷冻保护剂，第二水相进样口用于通入细胞悬液，第一水相进样口、第二水相进样口和油相进样口均与液滴排布通道连通；每条液滴排布通道由若干个液滴存储腔相互串联形成，多条液滴排布通道在功能层平行排列。本申请能够为单细胞提供皮升级别的冷冻体系，保证冷冻冻融过程中液滴的稳定性，还能够大大降低单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

Description

用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用

技术领域

本申请涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用。

背景技术

随着卵泡浆单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection，简称ICSI)的发展，使严重稀少精子患者生育子代成为可能。对于严重少弱精子症或精液中间歇存在活动精子，以备ICSI技术；对于梗阻性与非梗阻性输精管手术治疗，输精管缺如患者输精管切除术后还想要生育孩子，以及患有肿瘤患者需要接触放射线治疗的男性，在生育力丧失之前来进行精液采集和存储，能够给予储存者未来做父母的希望。

在ICSI技术中，附睾和睾丸精子数量不足，质量较差，冷冻复苏率低，活力弱，冷冻保存后则体外受精结果差，依赖于ICSI辅助受精获成功；精子冷冻保存后与卵子融合的能力不会丢失，而且ICSI技术只需要选择一条活动精子，故解冻后只要存在数量有限的活动精子，仍可满足ICSI技术对精子数的要求。因此，提供一种单细胞的冷冻技术，以实现稀少精子的冷冻，在辅助生殖临床治疗上是非常有必要的。

发明内容

本申请的目的在于提供一种用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用，通过由液滴存储腔形成的液滴排布阵列，将单细胞液滴固定在液滴存储腔中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冷冻冻融过程中液滴的稳定性，大大降低单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

本申请是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本申请提供一种用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，包括自上而下依次贴合的上层芯片和盖玻片，所述上层芯片靠近所述盖玻片的表面为功能层，所述功能层设有第一水相进样口、第二水相进样口、油相进样口和多条液滴排布通道；所述第一水相进样口用于通入冷冻保护剂，所述第二水相进样口用于通入细胞悬液，所述第一水相进样口、所述第二水相进样口和所述油相进样口均与所述液滴排布通道连通；每条所述液滴排布通道由若干个液滴存储腔相互串联形成，多条所述液滴排布通道在所述功能层平行排列。

进一步地，还包括第一水相管路、第二水相管路和油相管路；所述第一水相管路的一端与所述第一水相进样口连通，所述第二水相管路的一端与所述第二水相进样口连通，所述第一水相管路的另一端与所述第二水相管路的另一端汇聚形成一条总水相管路；所述油相管路包括从所述油相进样口分出的第一油相管路支路和第二油相管路支路，所述第一油相管路支路和所述第二油相管路支路对称设于所述总水相管路的两侧；所述总水相管路与所述第一油相管路支路和所述第二油相管路支路汇聚形成液滴生成区。

进一步地，所述液滴生成区与所述液滴排布通道的入口之间设有液滴排布缓冲区，所述液滴生成区与所述液滴排布缓冲区之间设有液滴喷口。

进一步地，所述液滴喷口的直径设置为预设液滴直径的一半。

进一步地，所述液滴存储腔的尺寸设置为容纳单个单细胞液滴，所述液滴存储腔的宽度值设置为等于预设液滴直径值，所述液滴排布通道的高度值设置为等于预设液滴直径值。

进一步地，所述液滴排布通道上非液滴存储腔区域的宽度为所述液滴存储腔的宽度的一半。

进一步地，所述盖玻片的厚度不大于150μm。

进一步地，所述上层芯片的材质为聚二甲基硅氧烷。

第二方面，本申请提供一种上述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片在单细胞液滴生成的应用。

第三方面，本申请提供一种基于上述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片的液滴生成方法，包括：

从第一水相进样口或第二水相进样口通入水相样品，排出空气；

从油相进样口通入矿物油，将芯片预先浸润；

设定油相进样口、第一水相进样口和第二进样口在进样压力上相等，在油相进样口处通入矿物油，在第一水相进样口处通入冷冻保护剂，在第二水相进样口处通入细胞悬液，持续稳定生成具有预设直径的单细胞液滴，进入液滴排布通道；

停止加压后，所述单细胞液滴自动排布于液滴存储腔内。

实施本申请的上述技术方案，具有如下有益效果：

1、本申请通过由液滴存储腔形成的液滴排布阵列，能够将单细胞液滴固定在液滴存储腔中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冷冻冻融过程中液滴的稳定性，保证液滴在冷冻过程中不会发生融合，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。

2、由于本申请中的液滴阵列芯片为单细胞提供了极小的冷冻体系，能够大大降低精子等单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

3、本申请中的液滴阵列芯片具有两个水相进样口和一个油相进样口，两个水相进样口分别通入细胞悬液和对应的冷冻保存剂的成分，可以实现冷冻保护剂的快速加载，冷冻保护剂在生成液滴的瞬间包裹单细胞，能够避免细胞损伤，还可以通过调整冷冻保存剂的流量来实现调节单细胞冷冻保存剂配方的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本申请实施例提供的液滴阵列芯片的俯视示意图；

图2为本申请实施例提供的液滴阵列芯片的侧视示意图；

图3为本申请实施例中的液滴存储腔的结构示意图；

图4为本申请实施例中在液滴存储腔内排布液滴的结构示意图；

图5为基于本申请实施例的液滴阵列芯片生成液滴的流程示意图；

图6为本申请实施例中的单精子液滴排布阵列；

图7为本申请实施例中冷冻前液滴融合的显微镜表征示意图；

图8为本申请实施例中冷冻后液滴融合的显微镜表征示意图；

附图标记对应为：1-盖玻片、2-上层芯片、3-油相进样口、4-第一水相进样口、5-第二水相进样口、6-液滴排布通道、7-液滴存储腔、8-出样口、9-液滴排布缓冲区、10-液滴喷口、11-第一油相管路支路、12-第二油相管路支路、13-第一水相管路、14-第二水相管路、15-总水相管路。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本申请作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

实施例

细胞冷冻过程中，首先胞外溶液形成冰晶，造成活细胞外高渗透压环境，驱动水分从胞内转移至胞外，这种冷冻方法容易导致细胞损伤。目前精子常使用慢速冷冻法进行冻存，其最理想的冷冻速率是既要保证胞内尽可能少的形成冰晶，也要保证细胞不为胞外高渗环境损伤。现有研究表明，从理论上，冷冻保护剂的浓度与冷冻速率之间负相关，即冷冻速率越快，所需要的冷冻保护剂浓度越低，可以设想，当冷冻速率接近极限快时，所需的冷冻保护剂浓度接近于零，这便是无冷冻保护剂却达到理想冷冻效果的理论基础。由于精子在自身结构上具有体积小、胞浆少的特点，从而有可能在不添加冷冻保护剂以及极快降温速率的情况下，瞬间形成玻璃样固体，却不形成冰晶。所以，只要寻找到一种体积足够小的冷冻载体，就极有希望在不添加冷冻保护剂情况下实现小体积的单细胞的理想冷冻，以避免冷冻过程中造成的细胞损伤。

微流控技术具有易操控、体系小、污染少等特点，而液滴微流控是微流控技术中的一大分支，在操作性、通量以及效率上有着巨大的优势。液滴微流控能够快速的对患者的精子样本进行冷冻保存剂的加载以及去除，以及对于解冻后单细胞的操控也是十分的方便。对比现有的的冷冻载体，由于微小的冷冻体系以及较大的比表面积能够实现超快速的冻融，大大减少了冰晶的形成，从而能够减小冷冻对精子等单细胞产生的伤害。且由于冷冻载体的芯片化，其体积大大减小，能够大大节省液氮的使用量，且便于规范化。目前使用的液滴生成装置包裹的单细胞液滴在低温的状态下存在不稳定、液滴融合的情况，给后续细胞的操控以及冻融状态下细胞的保存带来非常大的挑战。

为此，本申请实施例提供一种用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，参阅图1-2，本实施例中的液滴阵列芯片包括自上而下依次贴合的上层芯片2和盖玻片1，上层芯片2靠近盖玻片1的表面为功能层，功能层设有第一水相进样口4、第二水相进样口5、油相进样口3和多条液滴排布通道6；第一水相进样口4用于通入冷冻保护剂，第二水相进样口5用于通入细胞悬液，第一水相进样口4、第二水相进样口5和油相进样口3均与液滴排布通道6连通；每条液滴排布通道6由若干个液滴存储腔7相互串联形成，液滴排布通道6的形状类似葫芦形，如图3所示，多条液滴排布通道6在功能层平行排列。

本申请实施例中通过由液滴存储腔形成的液滴排布阵列，将单细胞液滴固定在芯片液滴存储腔中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冷冻冻融过程中液滴的稳定性，保证液滴在冷冻过程中不会发生融合，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。而且，由于本申请中的液滴阵列芯片为单细胞提供了极小的冷冻体系，能够大大降低精子等单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

在一个具体的实施方式中，液滴阵列芯片还包括第一水相管路14、第二水相管路13和油相管路；第一水相管路14的一端与第一水相进样口4连通，第二水相管路13的一端与第二水相进样口5连通，第一水相管路14的另一端与第二水相管路13的另一端汇聚形成一条总水相管路15；油相管路包括从油相进样口3分出的第一油相管路支路11和第二油相管路支路12，第一油相管路支路11和第二油相管路支路12对称设于总水相管路15的两侧；总水相管路15与第一油相管路支路11和第二油相管路支路12汇聚形成液滴生成区。

本实施例中，液滴生成处有三个进样口，分别为两个水相进样口和一个油相进样口。两个水相进样口可以分别通入细胞悬液和对应的细胞冷冻保护剂，以实现细胞冷冻保护剂的快速加载，冷冻保存剂在生成液滴的瞬间包裹单细胞，能够避免细胞损伤。除了能够实现单细胞高通量的冷冻保存之外，本申请实施例中的芯片还通过两个水相进样口，可以实现对于单细胞冻存最优的冷冻保护剂配方的调节，例如可以借助微纳平台制造出的微流控装置，实现包裹单细胞的液滴的连续生成，在连续生成的过程中改变两个水相进样口的压力比从而改变流量比，以调整水相即冷冻保护剂的配方来实现调节单细胞冻存的合适的冷冻保护剂配方的目的。

在一个具体的实施方式中，液滴生成区与液滴排布通道6的入口之间设有液滴排布缓冲区9，液滴生成区与液滴排布缓冲区9之间设有液滴喷口10。

在一个具体的实施方式中，液滴喷口10的直径设置为预设液滴直径的一半。

在一个具体的实施方式中，液滴存储腔7的尺寸设置为容纳单个单细胞液滴，液滴存储腔7的宽度值设置为等于预设液滴直径值，液滴排布通道6的高度值设置为等于预设液滴直径值。

在一个具体的实施方式中，在液滴处于液滴排布通道6较窄的非液滴存储腔区域时，液滴呈长条形，液滴排布通道6上非液滴存储腔区域的宽度为液滴存储腔7的宽度的一半。

在一个具体的实施方式中，上层芯片2的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

本实施例中，冻融过程中，芯片用的玻璃衬底越薄，液滴的升降温速度越快。考虑到在升温及降温的过程中，聚二甲基硅氧烷材质的上层芯片与玻璃的热膨胀系数不同，若使用常规的载玻片，在冷冻过程中玻璃片会被PDMS拉断，因此本实施例中使用盖玻片作为衬底，盖玻片1的厚度不大于150μm，在该厚度下，玻璃呈现出一定的韧性，在快速升温及降温的情况下不会碎裂，从而避免造成冷冻样品的泄漏。

本实施例中，液滴阵列芯片的进样通道包括油相进样通道和水相进样通道，油相进样通道由第一油相管路支路和第二油相管路支路形成，水相进样通道由第一水相管路、第二水相管路和总水相管路形成，进样通道的尺寸设计过程具体如下：

对于离散度较好的细胞样本，假设细胞之间没有聚团的现象，理论上液滴的尺寸可以设计成接近最大细胞尺寸的大小，设置液滴喷口的直径为液滴直径的一半，然后根据液滴排布通道的结构尺寸确定液滴的体积与周围油相的体积比值，来设计液滴生成通道的流阻，从而可以确定芯片进样通道的尺寸。

例如，以男性生殖细胞精子作为冷冻的测试对象，该细胞的形态为，头部的直径约为2-3um，而长度可达40um，因此设计的液滴尺寸可以为直径50um，分散相的成分为精子培养基，连续相使用含有表面活性剂的矿物油。根据液滴的尺寸，可以确定液滴排布通道的高度为50μm，液滴存储腔的宽度为50μm，非液滴存储腔区域的宽度为25μm。

再根据如下的流体阻力的公式来设计连续相以及分散相的通道尺寸，其中μ代表流体的粘度，l、w、h分别代表通道的长度、宽度以及高度；

流体阻力的公式：

其中，流量、压力以及流阻的关系为：P＝R*Q，

其中P代表芯片进样口处的进样压力，R代表流阻，Q代表进样口的流量。

根据液滴排布通道的结构来计算分散相以及连续相的体积比，用体积比代表流量比，当压力相等的情况下计算流阻比，得到通道流阻设计的相关参数。

本实施例用含有冷冻保护剂的液滴包裹单细胞，然后通过液滴存储腔将液滴固定在液滴存储腔中保持稳定不动，形成液滴排布阵列。具体地，当液滴不断通过葫芦形的液滴排布通道6时，液滴会不断地发生形变，在液滴处于液滴排布通道6较窄的非液滴存储腔区域时，液滴呈长条形，此时液滴的表面势能是最大的，当液滴停止生成时，整体液滴慢慢降低了运动的速度，此时形变了的液滴表面势能较高，需要恢复球型的尺寸来降低表面的势能，因此当整个系统处于稳定状态时候，绝大多数的液滴都是处于球形的状态，固定于液滴存储腔7内，如图4所示，其中A表示液滴，B表示连续相。

本实施例中，通过液滴以及微流控结构能够保证冷冻体系不受温度突变的影响，并能够高效地实现冷冻和冻融以及冷冻保护剂的快速加载。由于极小的冷冻体系，从而可以实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻，一片芯片完全能够存储十万以上的细胞。本申请实施例中的液滴阵列芯片，操作简单，易于使用，可以用作生殖发育实验室甚至临床上的通用装置。

本实施例中，本实施例中的液滴阵列芯片的制作方法具体如下：

S1、硅模具的制作，具体包括：

S11、根据芯片结构设计掩膜并以硅作为衬底进行相应的光刻并得到光刻胶为主体的掩膜；S12、使用反应离子刻蚀进行相应的刻蚀得到所需高度的结构；S13、将制作好的上层硅片模具进行硅烷化。

S2、上层最终模具的制作，具体包括：

S21、将第一材料浇注到上层硅片模具上并一起加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口得到中间模具；S22、将第二材料浇注到中间模具中，第二材料填充上层中间模具的打孔位置，并固化形成对应进样口、出样口，剥离固化的第二材料，得到上层最终模具。

S3、PDMS芯片的制作，具体包括：

S31、将第一材料浇注到上层最终模具中，使第一材料的液面没过上层最终模具上的柱子，随后加热至固化，剥离固化的第一材料，并在进样口、出样口处打孔，得到上层芯片；S32、选用厚度不大于150μm的盖玻片作为芯片键合的衬底，盖玻片的长度和宽度根据上层芯片的尺寸确定；通过等离子键合，将上层芯片与盖玻片键合在一起，得到液滴阵列芯片。

在上述液滴阵列芯片的制作方法中，第一材料为PDMS，且第一材料是通过配置其预聚物和固化剂混合物并在搅拌均匀后抽真空直至气泡消失而得到的；第二材料为环氧树脂。

本申请的另一实施例提供一种上述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片在单细胞液滴生成的应用。

本申请的另一实施例还提供一种基于上述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片的液滴生成方法，参阅图5，该液滴生成方法包括：

从第一水相进样口或第二水相进样口通入水相样品，排出空气；

从油相进样口通入矿物油，将芯片预先浸润；

设定油相进样口、第一水相进样口和第二进样口在进样压力上相等，在油相进样口处通入矿物油，在第一水相进样口处通入冷冻保护剂，在第二水相进样口处通入细胞悬液，持续稳定生成具有预设直径的单细胞液滴，进入液滴排布通道；

停止加压后，单细胞液滴自动排布于液滴存储腔内，具体操作可以是停止微流体进样泵的压力，将枪头插在进样口处待液滴排布稳定；然后拔去枪头，周围涂敷矿物油密封。

本实施中，以单精子为例，通过上述方法，形成如图6所示的液滴排布阵列，形成液滴排布阵列后，将芯片置于冷冻保存盒中然后置于-80℃冰箱中约两小时；再置于液氮罐中冷冻保存，即实现单细胞的冷冻。

上述冷冻单细胞在需要使用时，将芯片从液氮罐中取出，置于预热好的36℃热板上解冻约1min；解冻完成之后，在芯片进样口通入矿物油让液滴发生融合，并将液滴排出阵列；对于稀有的样本可以直接采用显微操作将细胞捕获；对于大量样本可以将排出的液滴收集后加入培养基中离心得到。以精子为例，图7-8的显微镜照片示出了在冷冻前后液滴融合的状态，可以看出液滴在冷冻过程中没有发生融合，在冷冻冻融过程中液滴具有良好的稳定性。

本领域技术人员可以理解的是，本申请实施例中的芯片以及液滴生成方法，除了用于精子的冷冻之外，还可以应用于干细胞、植物种子、单细胞化的癌症肿瘤组织等，当然，也可以应用与其他类型的单细胞，本申请实施例对此不做具体限定。

本申请的上述实施例，具有如下有益效果：

1、本申请实施例通过由液滴存储腔形成的液滴排布阵列，能够将单细胞液滴固定在液滴存储腔中保持稳定不动，在为单细胞提供皮升级别的冷冻体系的同时，还能够实现冷冻冻融过程中液滴的稳定性，保证液滴在冷冻过程中不会发生融合，具有高通量、体系小、可操控性佳的优点。

2、由于本申请实施例中的液滴阵列芯片为单细胞提供了极小的冷冻体系，能够大大降低精子等单细胞在冷冻过程中造成的损伤，有利于实现无冷冻保护剂的单细胞超快速冷冻。

3、本申请实施例中的液滴阵列芯片具有两个水相进样口和一个油相进样口，两个水相进样口分别通入细胞悬液和对应的冷冻保存剂的成分，可以实现冷冻保护剂的快速加载，冷冻保护剂在生成液滴的瞬间包裹单细胞，能够避免细胞损伤，还可以通过调整冷冻保存剂的流量来实现调节单细胞冷冻保存剂配方的目的。

以上所述是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，包括自上而下依次贴合的上层芯片(2)和盖玻片(1)，所述上层芯片(2)靠近所述盖玻片(1)的表面为功能层，所述功能层设有第一水相进样口(4)、第二水相进样口(5)、油相进样口(3)和多条液滴排布通道(6)；

所述第一水相进样口(4)用于通入冷冻保护剂，所述第二水相进样口(5)用于通入细胞悬液，所述第一水相进样口(4)、所述第二水相进样口(5)和所述油相进样口(3)均与所述液滴排布通道(6)连通；

每条所述液滴排布通道(6)由若干个液滴存储腔(7)相互串联形成，多条所述液滴排布通道(6)在所述功能层平行排列。

2.根据权利要求1所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，还包括第一水相管路(14)、第二水相管路(13)和油相管路；

所述第一水相管路(14)的一端与所述第一水相进样口(4)连通，所述第二水相管路(13)的一端与所述第二水相进样口(5)连通，所述第一水相管路(14)的另一端与所述第二水相管路(13)的另一端汇聚形成一条总水相管路(15)；

所述油相管路包括从所述油相进样口(3)分出的第一油相管路支路(11)和第二油相管路支路(12)，所述第一油相管路支路(11)和所述第二油相管路支路(12)对称设于所述总水相管路(15)的两侧；

所述总水相管路(15)与所述第一油相管路支路(11)和所述第二油相管路支路(12)汇聚形成液滴生成区。

3.根据权利要求2所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，所述液滴生成区与所述液滴排布通道(6)的入口之间设有液滴排布缓冲区(9)，所述液滴生成区与所述液滴排布缓冲区(9)之间设有液滴喷口(10)。

4.根据权利要求3所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，所述液滴喷口(10)的直径设置为预设液滴直径的一半。

5.根据权利要求1所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，所述液滴存储腔(7)的尺寸设置为容纳单个单细胞液滴，所述液滴存储腔(7)的宽度值设置为等于预设液滴直径值，所述液滴排布通道(6)的高度值设置为等于预设液滴直径值。

6.根据权利要求5所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，所述液滴排布通道(6)上非液滴存储腔区域的宽度为所述液滴存储腔(7)的宽度的一半。

7.根据权利要求1所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，所述盖玻片(1)的厚度不大于150μm。

8.根据权利要求1所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片，其特征在于，所述上层芯片(2)的材质为聚二甲基硅氧烷。

9.一种权利要求1-8任一项所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片在单细胞液滴生成的应用。

10.一种基于权利要求1-8任一项所述的用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片的液滴生成方法，其特征在于，包括：

从第一水相进样口(4)或第二水相进样口(5)通入水相样品，排出空气；

从油相进样口(3)通入矿物油，将芯片预先浸润；

设定油相进样口(3)、第一水相进样口(4)和第二进样口(5)在进样压力上相等，在油相进样口(3)处通入矿物油，持续稳定生成具有预设直径的单细胞液滴，进入液滴排布通道(6)；

停止加压后，所述单细胞液滴自动排布于液滴存储腔(7)内。

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