CN114223650A - 一种生物材料的冷冻保存方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物材料的冷冻保存方法及装置。本发明的生物材料的冷冻保存方法包括：采用油包水技术将待冷冻保存的生物材料包封于油相材料中，形成生物材料油滴；其中，所述生物材料包括来自人或动物的体细胞、精子、卵子、D1‑D6胚胎或植物细胞；所述油相材料包括甘油、矿物油、植物油中的一种或多种；将生物材料油滴进行冷冻保存。本发明的生物材料的冷冻保存装置包括油包水液滴形成芯片。本发明可提升生物材料保存密封性和牢固性。
Description
技术领域
本发明是关于一种生物材料的冷冻保存的方法及装置，具体而言，是关于一种对生物材料及例如精子、卵子、胚胎等进行冷冻保存的方法，以及该方法中用到的冷冻载杆及形成芯片等装置。
背景技术
在生育技术领域，一些生物材料例如体细胞、精子、卵子、第1-6天胚胎等通常需要冷冻保存。例如，在试管婴儿治疗中，许多取卵后的患者由于不宜进行鲜胚植入，需将受精卵或者胚泡冷冻处理，以便在患者恢复到适宜植入的状态时，择机植入。此外，为防止一次植入的失败，将同时取出的暂时不用的卵子进行冷冻保存，防止出现对女性需再次取卵的情况发生等等，这些情况都涉及到了胚胎的冷冻和解冻。
冷冻胚胎是被证实了的保存生育功能的唯一成熟方法。冷冻胚胎将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过慢速(第2-3天的胚胎)和快速(第5-6天的囊胚)两种降温方式使胚胎能静止下来并可在零下196度的液氮中保存的一种方法。它的主要作用是，待以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内，增加备孕女性的受孕的机会。据统计，冷冻胚胎复苏临床妊娠率48.28％，囊胚冷冻复苏临床妊娠率为63.48％。
快速冷冻相较慢速冷冻更有优势。常规冷冻是指缓慢冷却胚胎直至其最终冻结的慢速法，这种方式的主要问题是在冷冻过程中形成可能产生损坏胚胎的冰晶。而快速方法又称为玻璃化冷冻法，玻璃化冷冻法能避免出现冰晶，可以提高胚胎植入的成功率，有效地保护胚胎在冷冻过程中不受损伤。玻璃化冷冻法正在逐渐取代传统方法。
冷冻载杆是胚胎冷冻环节必不可少的耗材，且与胚胎的冷冻-复苏效果密切相关。目前大多数生殖中心主要使用开放式、半封闭式和封闭式三种玻璃化冷冻载杆。其中，开放式载杆和半封闭式载杆在胚胎冷冻保存时均使胚胎要与液氮直接接触，可能存在胚胎间的交叉污染，或是由于液氮存在微生物污染导致的胚胎污染，使胚胎存在安全隐患。对于生殖中心而言，胚胎的安全性非常重要，因此封闭式冷冻载杆使用尤为必要。
CN112674076A公开了一种封闭式冷冻载杆，包括内管、外管、管盖、气囊、锥形收口和软质封闭圈。使用时，利用气囊配合锥形收口吸纳或导出精子及卵子；吸纳后移动外管，利用外观将设置于锥形收口处的软质封闭圈一部分向前推动，并配合外观向内挤压收缩，实现锥形收口的封闭；反之则打开，软质封闭圈复位。然而，此类冷冻载杆，载杆杆体及盖帽材料不一致，表面张力不统一，容易由热胀冷缩导致出现缝隙，很难实现真正意义上的“封闭”。
CN209882898U公开了一种玻璃化冷冻麦管，包括相同材料制成的载杆和封闭套管，通过在载杆设置台阶状堵头结构，实现载杆与套管之间的封堵。然而，这类即便载杆杆体及封闭盖帽材料相同的情况，也很难保证两者完全紧密贴合，仍存在泄露风险。
此外，现有技术的载杆上通常没有固定放置胚胎的位点，而是根据医生习惯放置在载杆某个位置，观察时需要寻找胚胎位置；也有一些载杆上会简单设置凹坑作为放置胚胎的载物槽，然而，由于载杆通常较长，操作时需特别谨慎平稳，否则容易因载杆的倾斜或震动将胚胎弹出或碰落胚胎，在解冻时有可能会造成胚胎无法找回的不良结果。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种生物材料的冷冻保存方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于生物材料冷冻保存的装置。
一方面，本发明提供了一种生物材料的冷冻保存方法，该方法包括：
采用油包水技术将待冷冻保存的生物材料包封于油相材料中，形成生物材料油滴；其中，所述生物材料包括来自人或动物的体细胞、精子、卵子、D1-D6胚胎或植物细胞；所述油相材料包括甘油、矿物油、植物油中的一种或多种；
将生物材料油滴进行冷冻保存。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述冷冻保存可以采用常规冷冻法、程序冷冻法或玻璃化冷冻法等所有可行的生物材料冷冻保存方法。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，采用油包水技术将待冷冻的生物材料包封于油相材料中的过程利用一种油包水液滴形成芯片进行；
所述油包水液滴形成芯片包括开设在芯片内部的生物材料流通主管道、冷冻保存剂支管道、油相材料支管道；其中：所述生物材料流通主管道的一端为生物材料进口，另一端为生物材料油滴出口；在生物材料流通主管道上，沿生物材料流经路径先后开设冷冻保存剂支管道连通口、油相材料支管道连通口；冷冻保存剂支管道的一端通过冷冻保存剂支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为冷冻保存剂进口；油相材料支管道的一端通过油相材料支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为油相材料进口；所述生物材料进口、生物材料油滴出口、冷冻保存剂进口、油相材料进口开设在芯片表面。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述采用油包水技术将待冷冻的生物材料包封于油相材料中的过程包括：
分别向油包水液滴形成芯片的冷冻保存剂支管道注入冷冻保护剂向油包水液滴形成芯片的油相材料支管道注入油相材料，使得冷冻保护剂与油相材料在油包水液滴形成芯片的主管道内混合形成油包水液滴；
将待冷冻保存的生物材料从芯片的生物材料进口注入(可根据情况待冷冻保护剂与油相材料可以稳定形成大小均一的油包水液滴后再注入生物材料)，使得生物材料进入冷冻保护剂与油相材料形成的油包水液滴中，形成生物材料油滴。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述冷冻保护剂可包括蔗糖(水溶液)、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，利用所述油包水液滴形成芯片借助微流控技术可实现添加冷冻保存剂及生成油包水液滴的自动化形成，减少人为操作、提升效率。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片的生物材料流通主管道上还可设置有一个或多个(例如2、3、4或5个)备用支管道连通口，可设置在冷冻保存剂支管道连通口的上游或下游。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片中，所述一个或多个备用支管道连通口可设置在油相材料支管道连通口的上游。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片整体为聚二甲基硅氧烷(PDMS)板状微流控芯片。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片的长度为20-40mm，宽度10-20mm，厚度4-10mm。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片中，所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口的尺寸各自独立地为口径1.5-2.5mm、深度2.5-3.5mm；各支管道的进口的尺寸各自独立地为口径1.5-2.5mm、深度2.5-3.5mm。所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口、各支管道的进口尺寸可相同或不同。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片中，所述生物材料流通主管道、各支管道的尺寸各自独立地为宽度0.4-0.6mm、深度1.5-2.5mm(即，各管道的断截面为长方形)。所述生物材料流通主管道、各支管道的尺寸可相同或不同。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片中，所述生物材料流通主管道的长度为15-25mm，冷冻保存剂支管道的长度为3-8mm、油相材料支管道的长度为3-8mm。各支管道的长度可相同或不同。本发明中，所述各管道的长度不包括管口深度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片中，所述冷冻保存剂支管道连通口与生物材料进口之间的流向距离为3-5mm，油相材料支管道连通口与生物材料油滴出口之间的流向距离为3-5mm，冷冻保存剂支管道连通口与油相材料支管道连通口之间的流向距离为3-15mm。本发明中，所述冷冻保存剂支管道连通口与生物材料进口之间的流向距离、油相材料支管道连通口与生物材料油滴出口之间的流向距离不包括管口深度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片中，各支管道优选分别与主管道垂直设置。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片，包括四条支管道，各支管道与与主管道的连通口沿主管道流向均匀分布。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻保护剂的注入速度为5-15μl/s；油相材料的注入速度为3-8μl/s；待冷冻保存的生物材料的注入速度为1.5-2.5μl/s。所有试剂的注入可通过包括但不限于毛细管、移液枪、注射器手动注入或通过电子泵液装置自动控制注入。通过调控冷冻保护剂及油相材料的注入速度，可以调节油包水液滴的大小。具体注入速度可根据显微镜的实际观察结果灵活调整。最终油包水液滴大小应在可以完全包裹待保存生物材料的情况下尽可能小，以减少试剂损耗。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述油包水液滴形成芯片，整体尺寸为长30mm、宽15mm、厚5mm；所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口、各支管道的进口的尺寸均为口径2mm、深度3mm；各管道的宽度均为0.5mm、深度均为2mm；主管道长度为20mm，各支管道长度为5mm。优选地，该芯片包括四条支管道，各支管道与主管道的连通口相邻之间的距离(沿主管道流向)均为4mm。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻保护剂的注入速度为10μl/s；油相材料的注入速度为5μl/s；待冷冻保存的生物材料的注入速度为2μl/s。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，将生物材料油滴进行冷冻保存时，是将生物材料油滴置于冷冻载杆上，并于生物材料油滴上覆盖惰性油进行封闭，进行液氮冷冻保存。其中，所述惰性油可以为甘油、矿物油、植物油等中一种或多种混合而成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述冷冻载杆上设有用于容置生物材料油滴的载物凹槽。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述冷冻载杆的载物凹槽与油包水液滴形成芯片的生物材料油滴出口可拆卸地相连通，即，可将冷冻载杆与油包水液滴形成芯片分开，以便于将载有生物材料油滴的冷冻载杆进行冷冻保藏。
在本发明的一些具体实施方案中，冷冻载杆上的载物凹槽与油包水液滴形成芯片的生物材料油滴出口之间，通过柔性导管相连通。柔性导管用于将生物材料油滴引出油包水液滴形成芯片后引入冷冻载杆的载物凹槽中。所述柔性导管是可拆卸的。
根据本发明的具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，所述冷冻载杆的载物凹槽的开口为圆形或椭圆形，凹槽底部为生物材料存贮仓，生物材料存贮仓具有圆形或椭圆形的上开口，并且，生物材料存贮仓开口面积小于凹槽开口面积，从凹槽的开口至生物材料存贮仓上开口之间形成倾斜的凹槽侧壁，凹槽侧壁的倾斜坡度为50-70度，凹槽侧壁在倾斜方向的长度为3-7mm，从凹槽开口至生物材料存贮仓底部的垂直深度为3-7mm。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆在应用时，生物材料油滴沿凹槽侧壁滑落至底部的生物材料存贮仓中，于生物材料油滴上再覆盖惰性油进行封闭，即可液氮冷冻保存。其中，生物材料存贮仓中也可预先填充部分生物材料保护液或惰性油。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的载物凹槽的开口直径为2-8mm，生物材料存贮仓开口直径为0.5-3mm。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，当冷冻载杆的载物凹槽的开口或生物材料存贮仓开口为椭圆形时，所述直径是指椭圆形的长轴与短轴，即，椭圆形的长轴与短轴尺寸均在所述直径尺寸范围内。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的生物材料存贮仓为直径1-3mm的球形腔或半球形腔。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的生物材料存贮仓开口面积小于生物材料存贮仓最大横截面积。该设计将利于更好地在生物材料存贮仓内的生物材料油滴上覆盖惰性油进行封闭。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的倾斜的凹槽侧壁与生物材料存贮仓上开口连接处为圆滑倒角设计，倒角的半径小于等于2mm，例如可以为0.05-2mm。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的载物凹槽的开口为直径6mm的圆形，凹槽侧壁的倾斜坡度为60度，从凹槽开口至生物材料存贮仓底部的垂直深度约为5mm。所述生物材料存贮仓为直径3mm的半球形腔。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的载物凹槽内壁为PPO聚苯醚、F-4聚四氟乙烯或P1聚酰亚胺材质形成的内壁，将有利于生物材料油滴的保存。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的冷冻载杆整体为采用PPO聚苯醚、F-4聚四氟乙烯或P1聚酰亚胺制成的冷冻载杆。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆整体为圆柱体，长度为10-20cm，直径为5-25mm；所述载物凹槽设置在冷冻载杆头部距离前端1-3cm的位置处。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的尾部为手持端，设置有生物材料样本信息条码区域。
本发明中，除特别注明外，所采用的术语具有与所属领域基本相同的含义。
举例而言，本发明中，所述冷冻载杆的“头部”、“尾部”为采用本领域中的惯用描述，“尾部”是指手持端，另一端为头部(或称为前端)。
举例而言，本发明中，所述的“底部”是指凹槽开口向上的位置而言。
举例而言，本发明中，所述“球形”意指基本上为球形，例如可包括高度在完整球体高度3/4以上的球缺；“半球形”意指基本上为半球形，例如可包括高度在完整球体高度3/4-1/4的球缺。
举例而言，本发明中，所述凹槽侧壁的“倾斜坡度”，是指凹槽开口向上时，侧壁倾斜方向与水平面的夹角。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的生物材料的冷冻保存方法中，冷冻载杆的头部前端设置凹洞作为载物凹槽，且该凹洞的开孔端可拆卸地套设在油包水液滴形成芯片的生物材料油滴出口上。生物材料油滴从生物材料油滴出口流出后直接进入冷冻载杆的载物凹槽。
根据本发明的具体实施方案，将生物材料油滴置于冷冻载杆上的载物槽内后，于生物材料油滴上可再覆盖油相材料(惰性油)进行封闭，之后再进行液氮冷冻保存。
另一方面，本发明还提供了一种用于实现所述的生物材料的冷冻保存方法的装置，该装置包括油包水液滴形成芯片，所述油包水液滴形成芯片包括开设在芯片内部的生物材料流通主管道、冷冻保存剂支管道、油相材料支管道；其中：
所述生物材料流通主管道的一端为生物材料进口，另一端为生物材料油滴出口；在生物材料流通主管道上，沿生物材料流经路径先后开设冷冻保存剂支管道连通口、油相材料支管道连通口；冷冻保存剂支管道的一端通过冷冻保存剂支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为冷冻保存剂进口；油相材料支管道的一端通过油相材料支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为油相材料进口；所述生物材料进口、生物材料油滴出口、冷冻保存剂进口、油相材料进口开设在芯片表面。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于实现所述的生物材料的冷冻保存方法的装置，优选还包括冷冻载杆，该冷冻载杆上设有用于容置生物材料油滴的载物凹槽，该载物凹槽与油包水液滴形成芯片的生物材料油滴出口可拆卸地相连通。
更具体地，所述油包水液滴形成芯片、所述冷冻载杆的结构如前面所描述的。
综上所述，本发明提供了提出一种基于油包水技术的封闭式冷冻方法及装置。即将生物材料封存在油滴中，整个油包水体系进行冷冻保存。该方法由于使用惰性油完全包裹生物材料的液滴，大大提升密封性，可以实现真正意义上的“封闭”，避免了由于接触液氮导致的胚胎污染风险。此外，本发明可借助微流控技术可实现添加冷冻保存剂及生成油包水液滴的自动化，减少人为操作、提升效率，且可避免传统冷冻胚胎技术因步骤繁多存在胚胎混淆弄错的可能。
附图说明
图1为本发明的一具体实施方案中所用到的油包水液滴形成芯片的结构示意图。
图2为本发明的一具体实施方案中所用到的生物材料的冷冻保存装置的结构示意图。
图3为本发明的一具体实施方案中所用到的生物材料的冷冻保存装置的冷冻载杆的载物凹槽的剖面结构示意图。
图4为本发明的另一具体实施方案中所用到的生物材料的冷冻保存装置的结构示意图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种对胚胎例如第5-6天的囊胚进行冷冻保存方法，该方法利用一种油包水液滴形成芯片来制备形成冷冻保存生物材料的油包水液滴。本发明的方法适用于常规冷冻法、程序冷冻法、玻璃化冷冻法等所有生物材料冷冻保存方法，以下以玻璃化冷冻法为例进行描述。
如图1所示，本实施例的油包水液滴形成芯片10包括生物材料流通主管道、冷冻保存剂支管道、油相材料支管道：该生物材料流通主管道的一端为生物材料进口101，另一端为生物材料油滴出口102；在生物材料流通主管道上，沿生物材料流经路径先后开设冷冻保存剂支管道连通口、油相材料支管道连通口；冷冻保存剂支管道的一端通过冷冻保存剂支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为冷冻保存剂进口104；油相材料支管道的一端通过油相材料支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为油相材料进口103。所述油包水液滴形成芯片的生物材料流通主管道上还设置有多个备用支管道，图1中所示备用支管道为2个，各备用支管道在芯片表面分别开设物料进口105、106，备用支管道设置在冷冻保存剂支管道的下游、油相材料支管道的上游，备用或是用作胚胎冷冻所需其他试剂如蔗糖等的进液，可根据实际需要选择使用或不使用。所述油包水液滴形成芯片整体为PDMS板状微流控芯片，所述主管道与各支管道开设在芯片内部，各管道进口及主管道出口开设在芯片表面(优选在芯片同一侧表面)。所有试剂的注入可通过注射器手动注入或通过电子泵液装置自动控制注入。
本实施例中，芯片整体尺寸为长30mm、宽15mm、厚5mm；所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口、各支管道的进口的尺寸均为口2mm、深度3mm；各管道的宽度均为0.5mm、深度均为2mm；主管道长度为20mm，各支管道长度为5mm。各支管道与主管道的连通口相邻之间的距离均为4mm。
具体应用时，可通过进口104、进口105和/或进口106向芯片10中预装好冷冻保护剂(可以是蔗糖、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)等其中单独一种或多种的混合物，本实施例中采用丙二醇，仅通过进口104注入)；通过进口103向芯片注入油相材料(可使用甘油、矿物油、植物油等单独一种或多种混合，本实施例中采用甘油)；本实施例中，冷冻保护剂注入速度为10μl/s，油相材料注入速度为5μl/s；
待冷冻保护剂与油相材料可以稳定形成大小均一的油包水液滴后，将待冷冻保存的生物材料从进口101注入；生物材料注入速度为2μl/s；在注入生物材料的过程中通过显微镜观察油包水液滴形成芯片10中的油包水液滴，未包裹生物材料的油包水液滴从出口102流出后可弃置于培养皿中，包裹有生物材料的油包水液滴则通过出口102收集保存。
本实施例中，如图2所示，包裹有生物材料(第5-6天的囊胚)的油包水液滴从生物材料油滴出口102流出后，可通过透明柔性导管30进入胚胎冷冻载杆20。
本实施例中，冷冻载杆20整体为采用PPO聚苯醚制成的冷冻载杆。冷冻载杆20的头部设有用于容置生物材料的载物凹槽201(载物凹槽201的开口基本上为圆形)。冷冻载杆20的尾部为手持端，设置有生物材料样本信息条码区域202。
本实施例中，冷冻载杆20整体为圆柱体，长度为15cm，直径为25mm；所述载物凹槽201设置在冷冻载杆头部距离前端2cm的位置处，生物材料样本信息条码区域202设置在距离尾端2cm的位置处。
再请结合参见图3所示，本实施例中，所述载物凹槽201的开口为直径6mm的圆形，凹槽底部为生物材料存贮仓2011，生物材料存贮仓2011为直径3mm的多半球形腔，具有圆形的上开口，从凹槽的开口至生物材料存贮仓上开口之间形成开口渐缩的倾斜凹槽侧壁2012，凹槽侧壁2012的倾斜坡度为60度，从凹槽开口至生物材料存贮仓底部的垂直深度约为5mm。倾斜的凹槽侧壁与生物材料存贮仓上开口连接处(如图2中箭头所指示位置)可以为圆滑倒角设计，倒角的半径例如可以为0.1mm。
包裹有生物材料的油包水液滴导入胚胎冷冻载杆20的载物凹槽201后，可再覆盖适量油相材料(惰性油)进行封闭。之后将柔性导管30拆卸，将载有生物材料油滴的冷冻载杆进行液氮冷冻保存。
经检测，本实施例的方法对第5-6天的囊胚进行保存，密封性良好，可以实现真正意义上的“封闭”，避免了由于接触液氮导致的胚胎污染风险。此外，效率高，且可避免传统冷冻胚胎技术因步骤繁多存在胚胎混淆弄错的可能。
实施例2
本实施例提供了另一种对胚胎例如第5-6天的囊胚进行冷冻保存的装置，其结构如图4所示，该生物材料的冷冻保存装置包括油包水液滴形成芯片10和冷冻载杆30。其中油包水液滴形成芯片10的结构基本同实施例1。冷冻载杆30的头部前端设置凹洞作为载物凹槽301，且载物凹槽301的开孔端可拆卸地套设在油包水液滴形成芯片的生物材料油滴出口102上。冷冻载杆30的尾部为手持端，设置有生物材料样本信息条码区域302。
利用油包水液滴形成芯片10形成的生物材料油滴A从生物材料油滴出口102流出后直接进入冷冻载杆30的载物凹槽301，再于生物材料油滴A上覆盖油相材料(惰性油)B进行封闭。之后将冷冻载杆30与油包水液滴形成芯片10拆卸分开，将载有生物材料油滴A的冷冻载杆30进行液氮冷冻保存。
Claims (10)
1.一种生物材料的冷冻保存方法，该方法包括：
采用油包水技术将待冷冻保存的生物材料包封于油相材料中，形成生物材料油滴；其中，所述生物材料包括来自人或动物的体细胞、精子、卵子、D1-D6胚胎或植物细胞；所述油相材料包括甘油、矿物油、植物油中的一种或多种；
将生物材料油滴进行冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，所述冷冻保存采用常规冷冻法、程序冷冻法或玻璃化冷冻法。
3.根据权利要求1所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，采用油包水技术将待冷冻的生物材料包封于油相材料中的过程利用一种油包水液滴形成芯片进行；
所述油包水液滴形成芯片包括开设在芯片内部的生物材料流通主管道、冷冻保存剂支管道、油相材料支管道；其中：所述生物材料流通主管道的一端为生物材料进口，另一端为生物材料油滴出口；在生物材料流通主管道上，沿生物材料流经路径先后开设冷冻保存剂支管道连通口、油相材料支管道连通口；冷冻保存剂支管道的一端通过冷冻保存剂支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为冷冻保存剂进口；油相材料支管道的一端通过油相材料支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为油相材料进口；所述生物材料进口、生物材料油滴出口、冷冻保存剂进口、油相材料进口开设在芯片表面；
所述采用油包水技术将待冷冻的生物材料包封于油相材料中的过程包括：
分别向油包水液滴形成芯片的冷冻保存剂支管道注入冷冻保护剂向油包水液滴形成芯片的油相材料支管道注入油相材料，使得冷冻保护剂与油相材料在油包水液滴形成芯片的主管道内混合形成油包水液滴；优选地，所述冷冻保护剂包括蔗糖、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜中的一种或多种；
将待冷冻保存的生物材料从芯片的生物材料进口注入，使得生物材料进入冷冻保护剂与油相材料形成的油包水液滴中，形成生物材料油滴。
4.根据权利要求3所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，所述油包水液滴形成芯片的长度为20-40mm，宽度10-20mm，厚度4-10mm；
所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口的尺寸各自独立地为口径1.5-2.5mm、深度2.5-3.5mm；各支管道的进口的尺寸各自独立地为口径1.5-2.5mm、深度2.5-3.5mm；所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口、各支管道的进口尺寸相同或不同；
所述生物材料流通主管道、各支管道的尺寸各自独立地为宽度0.4-0.6mm、深度1.5-2.5mm；所述生物材料流通主管道、各支管道的尺寸相同或不同；
所述生物材料流通主管道的长度为15-25mm，冷冻保存剂支管道的长度为3-8mm、油相材料支管道的长度为3-8mm；
所述冷冻保存剂支管道连通口与生物材料进口之间的流向距离为3-5mm，油相材料支管道连通口与生物材料油滴出口之间的流向距离为3-5mm，冷冻保存剂支管道连通口与油相材料支管道连通口之间的流向距离为3-15mm。
5.根据权利要求3或4所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，
冷冻保护剂的注入速度为5-15μl/s；
油相材料的注入速度为3-8μl/s；
待冷冻保存的生物材料的注入速度为1.5-2.5μl/s。
6.根据权利要求3或4所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，
所述油包水液滴形成芯片的整体尺寸为长30mm、宽15mm、厚5mm；所述生物材料流通主管道的生物材料进口、生物材料油滴出口、各支管道的进口的尺寸均为口径2mm、深度3mm；各管道的宽度均为0.5mm、深度均为2mm；主管道长度为20mm，各支管道长度为5mm；
冷冻保护剂的注入速度为10μl/s；
油相材料的注入速度为5μl/s；
待冷冻保存的生物材料的注入速度为2μl/s。
7.根据权利要求1所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，将生物材料油滴进行冷冻保存时，是将生物材料油滴置于冷冻载杆上，并于生物材料油滴上覆盖惰性油进行封闭，进行液氮冷冻保存。
8.根据权利要求7所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，所述冷冻载杆上设有用于容置生物材料油滴的载物凹槽；
优选地，所述载物凹槽的开口为圆形或椭圆形，凹槽底部为生物材料存贮仓，生物材料存贮仓具有圆形或椭圆形的上开口，并且，生物材料存贮仓开口面积小于凹槽开口面积，从凹槽的开口至生物材料存贮仓上开口之间形成倾斜的凹槽侧壁，凹槽侧壁的倾斜坡度为50-70度，凹槽侧壁在倾斜方向的长度为3-7mm，从凹槽开口至生物材料存贮仓底部的垂直深度为3-7mm。
9.根据权利要求8所述的生物材料的冷冻保存方法，其中，所述冷冻载杆上设有用于容置生物材料油滴的载物凹槽；
优选地，所述载物凹槽的开口为圆形或椭圆形，凹槽底部为生物材料存贮仓，生物材料存贮仓具有圆形或椭圆形的上开口，并且，生物材料存贮仓开口面积小于凹槽开口面积，从凹槽的开口至生物材料存贮仓上开口之间形成倾斜的凹槽侧壁，凹槽侧壁的倾斜坡度为50-70度，凹槽侧壁在倾斜方向的长度为3-7mm，从凹槽开口至生物材料存贮仓底部的垂直深度为3-7mm；
更优选地，载物凹槽的开口直径为2-8mm，生物材料存贮仓开口直径为0.5-3mm；所述生物材料存贮仓为直径1-3mm的球形腔或半球形腔。
10.一种用于实现权利要求1-9任一项所述的生物材料的冷冻保存方法的装置，该装置包括油包水液滴形成芯片，所述油包水液滴形成芯片包括开设在芯片内部的生物材料流通主管道、冷冻保存剂支管道、油相材料支管道；其中：
所述生物材料流通主管道的一端为生物材料进口，另一端为生物材料油滴出口；在生物材料流通主管道上，沿生物材料流经路径先后开设冷冻保存剂支管道连通口、油相材料支管道连通口；冷冻保存剂支管道的一端通过冷冻保存剂支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为冷冻保存剂进口；油相材料支管道的一端通过油相材料支管道连通口与生物材料流通主管道连通，另一端为油相材料进口；所述生物材料进口、生物材料油滴出口、冷冻保存剂进口、油相材料进口开设在芯片表面；
优选地，所述装置还包括冷冻载杆，该冷冻载杆上设有用于容置生物材料油滴的载物凹槽，该载物凹槽与油包水液滴形成芯片的生物材料油滴出口可拆卸地相连通。
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