JP6475493B2 - 生殖細胞保存用具及び生殖細胞のガラス化保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、生殖細胞をガラス化し冷凍保存するための生殖細胞保存用具及び生殖細胞のガラス化保存方法に関する。

牛の胚移植に使用される胚は、液体窒素中で凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて融解し、移植が行われる。胚の冷凍保存には、ガラス化保存法が多く使用されている。ガラス化保存法は、エチレングリコール、グリセリン等の凍結防止剤を多量に含む水溶液（ガラス化保存液）中に胚を入れ、液体窒素中で急速冷却し、固体化させ保存する方法である。

ガラス化保存法を利用した胚移植においては、凍結及び融解に時間を要すると胚の生存率が低下するため、凍結及び融解を短時間で行うことが重要である。また胚、あるいは胚を含むガラス化保存液が液体窒素に直接接触すると、液体窒素に含まれる菌に汚染されるため胚等を液体窒素に直接接触させることなく保存すること、さらには取り扱いの容易性も重要である。

上記背景下、胚等を液体窒素に直接接触させることなく保存する方法が提案されている。特許文献１には、容器本体を外柄と内柄とで構成し、内柄に金属網のように胚は通過不能で、ガラス化保存液は通過可能なガラス化保存液除去材を設けることで胚を裸の状態で冷却可能としたガラス化保存用細管が開示されている。

また特許文献２には、先端近傍の上面をカットし開口部を設けた金属性筒状部材で形成された胚の付着保持具と付着保持具を収容する筒状の収容具とからなるガラス化保存用具が開示されている。このガラス化保存用具を使用することで液体窒素に直接接触させることなくガラス化保存が可能となる。

また特許文献３には、胚を含むガラス化保存液の微小液滴を、−１５０℃〜−１８０℃程度に冷却された伝熱性に優れるアルミニウム等の固体表面と直接接触させ、即時にガラス化させる方法が開示されている。

特許第５２７８９７８号公報 特開２００７−２６１９７３号公報 特表２００４−５０８００４号公報

特許文献１に記載の方法は、ガラス化保存液除去材上に胚を含むガラス化保存液を載置した容器本体を鞘管に収納し、これらを液体窒素に浸漬させ冷却する。この方法では、ガラス化保存液を載置した容器本体と鞘管とを同時に冷却するため冷却すべき熱容量が大きく、冷却速度を十分に早くすることが難しい。またガラス化保存液除去材が鞘管に接触しないため熱伝達性が悪い。

特許文献２に記載のガラス化保存用具は、予め液体窒素中で冷却された筒状収容具に、胚を含むガラス化保存液が載置された付着保持具を挿入し、これら全体を液体窒素に浸漬し冷凍保存する。このとき付着保持具は、筒状収容具と接触しないように取付けられているので熱伝達性が悪く、十分な冷却速度を得ることが難しい。

特許文献３に記載の方法は、従来のストローなど細管を用いたガラス化保存法では、十分に早い冷却速度が得られないとし、伝熱性に優れる固体上にガラス化保存液を滴下し冷却する。この方法は、冷却速度を十分に早くすることはできるが、長期保存の際には、ガラス化された液滴を、かん子等を用いて凍結バイアル中に移し保存する必要があるため紛失する恐れがある。また操作性もよいとは言えない。

以上のように特許文献１及び２に記載の方法は冷却速度に、特許文献３に記載の方法は、取扱い性に改善の余地がある。さらに胚の保存用具が、胚のガラス化保存と共に、胚を融解させた後に、直ちにガラス化保存液を希釈液で希釈し、そのまま受胚牛に移植することができる、いわゆるダイレクト移植を行うことが可能であればより好ましい。

本発明の目的は、急速冷却が可能で高い生存率を得ることができ取り扱いが容易な生殖細胞保存用具及び生殖細胞のガラス化保存方法を提供することである。

本発明は、生殖細胞をガラス化保存液を用いてガラス化し冷凍保存するための生殖細胞保存用具であって、生殖細胞を含むガラス化保存液を載置する載置部を備える生殖細胞保持具と、前記生殖細胞保持具を収容し、前記載置部に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液を急速冷却させる冷却器と、を含み、前記載置部には、外周面に先端部から基端部に向かう切欠き部及び／又は先端部が開口した先端開口部が設けられ、前記生殖細胞保持具を前記冷却器に挿入したとき、前記生殖細胞保持具の載置部の外壁面と前記冷却器の内壁面とが密着可能なことを特徴とする生殖細胞保存用具である。

本発明の生殖細胞保存用具は、生殖細胞を含むガラス化保存液を液体窒素に直接接触することなく凍結保存が可能なため、生殖細胞の液体窒素中での微生物汚染を防除できる。また生殖細胞保持具の載置部の外壁面と冷却器の内壁面とが密着可能なため、従来の保存用具に比較し熱伝達性に優れ、冷却速度を大きくすることができる。これらにより高い生存率を得ることができる。また生殖細胞を含むガラス化保存液を生殖細胞保持具内で保存するため紛失の恐れもなく、生殖細胞保存用具の取扱いも容易である。

本発明の生殖細胞保存用具において、前記載置部は、先細の円錐台形状又は円錐形状を有することを特徴とする。

載置部を先細の円錐台形状又は円錐形状とすれば、形状的に載置部の外壁面と冷却器の内壁面との密着が容易となる。また、載置部は先端部側ほど断面積が小さく、先端部側に生殖細胞を含むガラス化保存液を載置すれば、より大きな冷却速度を得ることができる。

また本発明の生殖細胞保存用具は、前記生殖細胞保持具を前記冷却器に押し込むと前記載置部が前記冷却器に接し、前記切欠き部及び／又は前記先端開口部が狭まり前記載置部が縮径し、前記載置部の外壁面と前記冷却器の内壁面とが密着することを特徴とする。

本発明によれば、生殖細胞保持具を冷却器に押し込むだけで、載置部の外壁面と冷却器の内壁面とを確実に密着させることができる。これにより大きな冷却速度、高い生存率が得られる。

また本発明の生殖細胞保存用具は、前記載置部には、外周面に先端部から基端部に向かう切欠き部が２か所設けられ、これらの位置が１８０°ずれていることを特徴とする。

載置部に設ける切欠き部を、相対する位置に設けることで大きな冷却速度を得ることができる。また載置部に容易にバネ弾性を付与することができる。

また本発明の生殖細胞保存用具において、前記生殖細胞保持具は、ストロー状の細管であり、前記載置部に続き、希釈液を収容可能な筒状部を備えることを特徴とする。

本発明によれば、生殖細胞保持具がストロー状の細管であり、載置部に続き、希釈液を収容可能な筒状部を備えるので、本生殖細胞保持具を使用することでガラス化保存液を希釈液で希釈し、そのまま受胚牛に移植することができる、いわゆるダイレクト移植が可能となる。

また本発明の生殖細胞保存用具において、前記冷却器は、先端部が閉止した先細の円錐台形状部又は円錐形状部を有することを特徴とする。

先細の円錐台形状部又は円錐形状部を有する冷却器を使用すれば、載置部外壁面との密着が容易となる。

また本発明は、前記生殖細胞保存用具を用いた生殖細胞のガラス化保存方法であって、前記冷却器は、筒状形状を有し、一端が封止され、他端部が開口しており、ガラス化保存液で平衡処理した生殖細胞を前記生殖細胞保持具の載置部に載置し、当該生殖細胞保持具を予め冷却した前記冷却器に挿入し、その後、当該冷却器を開口した端部を除き液体窒素に浸漬し、生殖細胞をガラス化し、保存することを特徴とする生殖細胞のガラス化保存方法である。

本ガラス化保存方法を用いることで、簡単にかつ迅速に生殖細胞をガラス化し、保存することができる。また本ガラス化保存方法は、急速冷却が可能なため高い生存率を得ることができる。

本発明によれば、急速冷却が可能で高い生存率を得ることができ取り扱いが容易な生殖細胞保存用具及び生殖細胞のガラス化保存方法を提供することができる。

本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１の構成図である。 図１の生殖細胞保存用具１を構成する生殖細胞保持具１１及び冷却器５１の構造を説明するための図である。 本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１を用いた胚の凍結保存要領を説明するための図である。 本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１を用いた他の胚の凍結保存要領を説明するための図である。 本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１を構成する生殖細胞保持具１１の第１変形例である。 本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１を構成する生殖細胞保持具１１の第２変形例である。 本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１を構成する生殖細胞保持具１１の第３変形例である。 本発明の第２実施形態の生殖細胞保存用具２を構成する生殖細胞保持具１５及び冷却器５５の構造を説明するための図である。 本発明の第３実施形態の生殖細胞保存用具３を構成する生殖細胞保持具１６及び冷却器５６の構造を説明するための図である。 本発明の第３実施形態の生殖細胞保存用具３を構成する生殖細胞保持具１６の変形例である。 本発明の第３実施形態の生殖細胞保存用具３を構成する生殖細胞保持具１６の変形例である。 本発明の実施例１で使用した生殖細胞保持具及び冷却器の外観図である。

図１は、本発明の第１実施形態の生殖細胞保存用具１の構成図である。図１の各図は、必ずしも同一縮尺ではない。図２は、図１の生殖細胞保存用具１を構成する生殖細胞保持具１１及び冷却器５１の構造を説明するための図である。図１及び図２において、冷却器５１の先端部を塗り潰して表示しているが、これは、先端部が閉止していることを明確にするためである。

生殖細胞保存用具１は、生殖細胞を、ガラス化保存液を用いてガラス化し冷凍保存するための器具であって、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置、保持する生殖細胞保持具１１と、生殖細胞保持具１１を収容し、生殖細胞保持具１１に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させる冷却器５１と、冷却器５１の末端を封止するキャップ８１と、を含む。

生殖細胞保持具１１は、大略的にはストロー状の細長い円筒形状を有し、先端に生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置する載置部２１を有する。生殖細胞保持具１１の大きさの代表例を示せば、長さが約１２０ｍｍ、外径が２ｍｍであり、この寸法は、０．２５ｍＬのストローと同程度である。生殖細胞保持具１１の厚さ（肉厚）は、高い熱伝熱性、さらには後述の載置部２１に設ける切欠き部３１の幅を大きくできる点から薄い方が好ましく、０．１ｍｍ程度の厚さが好ましい。但し、上記寸法は、代表的なものであり、本生殖細胞保持具１１の大きさがこの寸法に限定されるものではない。以下に示す寸法についても同様である。

載置部２１は、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置する部分であり、先細のテーパ管状（円錐台）で、先端は開口部（以下、先端開口部２８と記す）となっている。載置部２１の先細の円錐台のテーパ角度α１は、特定の角度に限定されるものではないが、冷却器５１の冷却部６１との関係において制約を受ける。この点については、後述する。ここでテーパ角度α１は、載置部２１を円錐形状とした場合の頂部の側面視の角度である（図２（ａ）参照）。

載置部２１の大きさは、特に限定されるものではないが、少なくとも後述の切欠き部３１を設けることができる大きさが必要である。載置部２１の大きさの一例を示せば、生殖細胞保持具１１の大きさが、長さ約１２０ｍｍ、外径２ｍｍ、肉厚が０．１ｍｍ程度の場合、載置部２１の長さＬ１は、２０ｍｍ程度、先端開口部２８の外径ｄ２は、１．５ｍｍ程度である。

載置部２１の側部３８には、所定の長さのスリット状の切欠き部３１が１８０°隔てて相対する位置に２箇所設けられている。切欠き部３１は、胚など生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを、載置部２１内に載置する入口となる部分である。よってパスツールピペット等、先端部が細く微小液滴を形成し易い器具を用い、ここから胚などの生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置部２１内に載置できる大きさが必要である。載置する胚などの生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇの量は、０．５〜１μＬ程度である。

切欠き部３１は矩形形状であり、生殖細胞保持具１１の大きさが、長さ約１２０ｍｍ、外径２ｍｍ、肉厚が０．１ｍｍ程度の場合、切欠き部３１の大きさは、長さＬ２が５〜１０ｍｍ程度、巾は０．８〜１ｍｍ程度である。

本実施形態の生殖細胞保持具１１では、切欠き部３１の先端が先端開口部２８に繋がるように設けられており、切欠き部３１の先端を先端開口部２８につなげることで載置部２１にバネ弾性を付与する。

生殖細胞保持具１１の載置部２１の後端部側は、円筒部４３となっており、載置部２１と円筒部４３とは一体的に形成されている。円筒部４３は、持ち手となる部分であり、末端部４４近傍にマーキング４５が施されている。

ガラス化保存液を用いた生殖細胞の凍結保存において、生殖細胞の生存率を高めるためには、ガラス化保存液の準備から急速冷却までの操作を迅速に行うことが重要である。円筒部４３の長さを極端に短くすると、生殖細胞保持具１１の冷却器５１への挿入などの操作が難しくなり、結果、時間を要するので好ましくない。一方、必要以上に長くしても不経済である。

なお、生殖細胞保持具１１をいわゆるダイレクト移植を行う器具として使用する場合には、円筒部４３を、ガラス化保存液を希釈する希釈液を保存する場所として使用することができる。この場合、希釈液の容量等に応じて円筒部４３の長さ、大きさを決定すればよい。

マーキング４５は、生殖細胞保持具１１を冷却器５１に挿入する際の目印である。マーキング４５の位置は、マーキング４５を冷却器５１の末端部７６に一致させるように挿入したとき、載置部２１と冷却部６１とが密接する位置に設けられている。マーキング４５は、生殖細胞保持具１１の冷却器５１に対する挿入位置を示すものであるが、生殖細胞保持具１１を冷却器５１に挿入し（図２（ｃ））、軽く押し込むと自動的に載置部２１と冷却部６１とが密接するので（図２（ｄ））、マーキング４５は、挿入の際の目印、確認用として使用すればよい。

本生殖細胞保存用具１では、後述のように生殖細胞保持具１１の載置部２１の外壁面２９を冷却器５１の冷却部６１の内壁面６９に接触させ、載置部２１に載置した生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させる。このため生殖細胞保持具１１の熱伝達性、特に載置部２１の熱伝達性は重要であり、生殖細胞保持具１１は、熱伝導度に優れる材料が好ましい。このような材料としては銅、アルミニウム、これらを含む合金などの金属材料が挙られる。なお、生殖細胞保持具１１の材質が、胚など生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇに悪影響を及ぼさない材質であることが必要なことは言うまでもない。

さらに載置部２１は、急速冷却の点から熱容量が小さいことが好ましい。よって生殖細胞保持具１１の材質としては、単位容積当たりの熱容量（比熱×密度）の小さいものが好ましい。このような材料としてはアルミニウム、プラスチックが挙られる。なお、載置部２１は、必ずしも単一の素材で形成する必要はなく、例えば金属とプラスチック等との複合材料であってもよい。

また載置部２１を透明あるいは半透明な材料で形成すれば、載置部２１への生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇの載置操作が容易となる。この場合、載置部２１の一部のみを透明あるいは半透明としてもよい。

生殖細胞保持具１１の製造方法は、特に限定されるものでない。製造方法の一例を示せばストロー状の細長い円筒体の先端部側を引張り、先端部側に先細りの円錐台を形成し、その後、切欠き部３１を設けてもよい。あるいは型に材料を流し込み製作することもできる。

冷却器５１は、生殖細胞保持具１１を収容し、生殖細胞保持具１１の載置部２１に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させるためのものである。また保管具としても機能する。冷却器５１は、生殖細胞保持具１１と同様に、ストロー状の細長い円筒体の先端部に生殖細胞保持具１１の載置部２１を冷却する冷却部６１、冷却部６１の後端部側に収容部７１、末端部にキャップ装着部７５を備える。

冷却部６１は、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置した生殖細胞保持具１１の載置部２１を密着させ、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却する部分であり、先細のテーパ管状（円錐台）で先端部６８は閉じている。本冷却器５１の冷却部６１は、円錐台形状であるが、先端部が尖った円錐形状であってもよい。

冷却部６１の先細の円錐台のテーパ角度α２は、載置部２１の先細の円錐台のテーパ角度α１に比較して小さい。ここでテーパ角度α２は、冷却部６１を円錐形状とした場合の頂部の側面視の角度である（図２（ｂ）参照）。冷却部６１の先細の円錐台のテーパ角度α２を載置部２１の先細の円錐台のテーパ角度α１に比較して小さくすることで、生殖細胞保持具１１を冷却器５１に押し込むだけで、載置部２１が変形し、冷却部６１の内壁面６９と載置部２１の外壁面２９とが簡単に密接する（図２（ｄ）参照）。

テーパ角度α２の好ましい角度は、冷却部６１に載置部２１を押し込んだとき、載置部２１が冷却部６１の内壁面６９に接し、押されて縮径するように変形し、載置部２１に設けられた切欠き部３１が閉じた状態で冷却部６１の内壁面６９と載置部２１の外壁面２９とが密接する角度である（図２（ｄ）参照）。冷却部６１の長さＬ３は、挿入された載置部２１全体を収容可能な長さに設定されている。

収容部７１は、円筒状であり、挿入された生殖細胞保持具１１を収容すべく、内径ｄ３は、生殖細胞保持具１１の円筒部４３の外径ｄ１よりも僅かに大きい。収容部７１の長さは、冷却器５１に生殖細胞保持具１１を挿入した状態で、生殖細胞保持具１１の末端部４４が収容部７１の末端部７６から２０〜３０ｍｍ程度突出する長さとなっている。これにより取扱いが容易となり、生殖細胞保持具１１を冷却器５１に簡単に挿入することができる。

キャップ装着部７５は、キャップ８１が嵌合する部分であり、キャップ８１の形態に対応し、末端側の口径が小さいテーパ状となっている。

冷却器５１の熱伝達性、特に冷却部６１の熱伝達性は可能な限り高いことが好ましい。冷却器５１は、生殖細胞保持具１１と異なり、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇと接触することはないが、冷却媒体である液体窒素中に浸漬されるためこれに耐え得る材料で形成する必要がある。これらの点から冷却器５１の材質としては、銅、アルミニウムが好ましい。

キャップ８１は、冷却器５１のキャップ装着部７５に着脱自在に取付けられ、冷却器５１内に収容された生殖細胞保持具１１及び生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを保護する。キャップ８１は、一端面が封止された円筒状のキャップであり、内壁面の先端部にキャップ装着部７５に嵌合するテーパ部８３が設けられている。

キャップ８１を冷却器５１のキャップ装着部７５に装着すると、キャップ装着部７５のテーパ部及びキャップ８１のテーパ部８３とが互いに係合し、キャップ８１がキャップ装着部７５に嵌合する。キャップ８１の長さは、キャップ装着部７５に装着したとき、冷却器５１に収容された生殖細胞保持具１１の末端４４に接しない長さとなっている。キャップ８１及びキャップ装着部７５の構造、形態は、本実施形態に限定されるものではなく、キャップを簡単にかつ確実に冷却器５１の末端に嵌合させることができるものであればよい。

次に生殖細胞保存用具１を用いて、胚を冷凍保存する要領を説明する。図３は、胚を冷凍保存する要領を示す模式図である。

（１）ガラス化保存液の準備
１．８Ｍエチレングリコール（ＥＧ）、０．３Ｍショ糖、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＭ−１９９液（１液）の７００μＬドロップを４つ、５ＭのＥＧ、１．０Ｍショ糖、４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む表１の組成のＭ２（２液）の３０μＬドロップを９つ、シャーレ上に作成する。ドロップの載ったシャーレは３８℃に保温する。上記をＤＷで５００ｍＬにメスアップする。

（２）胚の採取及びガラス化保存液との平衡
まず、通常の胚移植技術により胚を採取し、胚の正常性を検査する。次に、正常な１〜１０個、好ましくは５個の胚を、ピペット等で１液のドロップに移して２分間平衡する。ここで、ピペット等としては、パスツールピペットが好ましいが、先端部が細く微小滴を形成し易いものであればよい。

２液での平衡中に、冷却装置１０１を用いて冷却器５１を冷却しておく。その際、冷却器５１内に液体窒素１０９が浸入しないように注意する。冷却装置１０１は、液体窒素１０９を収容する上部が開口した魔法瓶１０３、金網で形成されたスタンド１０５及び液体窒素１０９で構成される。

魔法瓶１０３内にスタンド１０５を設置し、液体窒素１０９を充填する。その後、スタンド１０５に冷却器５１のみを立て掛け、冷却器５１のみを十分に冷却しておく。このとき冷却器５１は、冷却部６１を下向きとし、キャップ装着部７５は、液体窒素１０９の液面から突出させ、キャップ８１を装着しておく。なお、スタンド１０５に冷却器５１のみを立て掛け、後から魔法瓶１０３に液体窒素１０９を充填してもよい。

１液の平衡が終了した後、胚を２液のドロップに移し、直ちに次の２液のドロップに移す作業を７ドロップ移す。続いて、２液と共に胚をピペット等で吸い、切欠き部３１又は先端開口部２８から積載部２１内に胚の入ったガラス化保存液Ｇを薄く延ばして置く（図１及び図２（ａ）参照）。

（３）ガラス化保存
あらかじめ液体窒素１０９中で冷却しておいた冷却器５１を取出し、直ちに胚を載置した生殖細胞保持具１１を挿入する（図２（ｃ）参照）。このとき生殖細胞保持具１１に施されたマーキング４５が、冷却器５１の末端７６の位置となることを目安に、生殖細胞保持具１１を挿入する。生殖細胞保持具１１を押し込み、動きが止まった時点で挿入操作を終了し、直ちにキャップ８１を装着する（図２（ｄ）参照）。その後、これらを直ちに、冷却器５１の冷却部６１側から液体窒素１０９中に浸漬させ、胚を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させる。

これにより、胚を含むガラス化保存液Ｇは、冷却器５１に保持された状態で凍結する。なお、上記（２）において胚を２液に移してから、冷却器５１内に胚を含むガラス化保存液Ｇを載置した生殖細胞保持具１１を挿入するまでの操作は、１分以内に行う。その後、凍結した胚を使用するときまでは、冷却器５１ごと超低温下で保存することができる。

上記のガラス化保存方法によって超低温下に保存されている胚は、以下に例示した方法で融解し、所定のプロセスを経た後、胚の移植に供することができる。以下に、ガラス化保存胚の融解方法の１例を示す。

希釈溶液（融解液）の準備
０．３Ｍショ糖、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＭ２液を調製し、希釈溶液（融解液）とする。この融解液を３５ｍｍディッシュに２ｍＬ取り、３８．５℃に保温する。

ガラス化保存胚の融解及びガラス化保存液の希釈方法
液体窒素を入れた容器に、凍結胚を入れた冷却器５１を移す。次いで、冷却器５１を液体窒素に入れたままの状態で、胚を載置した生殖細胞保持具１１を冷却器５１から素早く抜き取る。さらに、胚の置いてある載置部２１を、直ちに２ｍｌの融解液が入ったディッシュに入れて胚を融解する。胚が融解した後、２分間稀釈する。さらに、Ｍ２液で数回洗浄し、ガラス化保存液を完全に除去する。このようにして融解した胚は生存率が高く、胚の移植に利用される。

次に生殖細胞保存用具１を用いて胚を冷凍保存する他の要領を説明する。図４は、胚を冷凍保存する要領を示す模式図である。図３の模式図と同一の構成には同一の符号を付し、説明を省略する。胚を冷凍保存する基本操作は、先に示した冷凍保存要領と同じであるが、冷却装置１０２が異なり、特に冷却装置１０２に銅のブロック１０７（１０７ａ、１０７ｂ）を使用した点に特徴がある。

ブロック１０７ａ、１０７ｂは左右に分割可能な構造であり、左右のブロック１０７ａ、１０７ｂを付合せた状態で冷却器５１が隙間なく嵌り込む挿入孔が中心部に設けられている。左右のブロック１０７ａ、１０７ｂを連結後、魔法瓶１０３内に設置し、冷却器５１を支持するスタンドとする。この冷却装置１０２を使用する場合は、ブロック１０７の挿入孔に冷却器５１を挿入した状態で魔法瓶１０３内に液体窒素１０９を充填する。

冷却器５１に生殖細胞保持具１１を挿入するときも、冷却器５１をブロック１０７から取外すことなく行う。ブロック１０７は、冷却器５１及び生殖細胞保持具１１に比較して熱容量が圧倒的に大きいので、生殖細胞保持具１１を挿入しても温度が殆ど低下せず、胚を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却することができる。

上記の通り、第１実施形態に示す生殖細胞保存用具１は、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを液体窒素に直接接触することなく凍結保存が可能なため、生殖細胞の液体窒素中での微生物汚染を防除できる。また生殖細胞保持具１１を冷却器５１に挿入し、載置部２１と冷却部６１とを密着させ冷却する本方法は、主たる熱伝達機構が伝導伝熱となるため、主たる熱伝達機構が放射伝熱である従来の保存用具に比較して大きな冷却速度を得ることができる。結果、従来の保存用具に比較し高い生存率を得ることができる。この点は、後述の実施例で実証済である。また生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを生殖細胞保持具１１内で保存するため紛失の恐れもない。さらに上記説明のように生殖細胞保存用具１の取扱いも容易である。

特に載置部２１を先細の円錐台形状とし、載置部２１に切欠き部３１を設けることでバネ弾性を付与しているので、生殖細胞保持具１１を冷却器５１に挿入し、軽く押し込むだけで載置部２１と冷却部６１とを確実に密着させることができる。

載置部２１の外壁面２９と冷却部６１の内壁面６９との密着は、熱伝達性の点において、載置部２１全体の外壁面２９が冷却部６１の内壁面６９と密着することが好ましいが、載置部２１の一部の外壁面２９が冷却部６１の内壁面６９と密着する場合であっても、従来の生殖細胞保存用具に比較して大きな冷却速度を得ることができる。特に生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置した部分が冷却部６１と密着すれば、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速に冷却することができる。この点は、他の実施形態、変形例においても同じである。

本明細書において、載置部２１の外壁面２９と冷却部６１の内壁面６９との密着は、両者が隙間なく接していること以外に、実質的に密着とみなされる状態を含む。このため載置部２１の外壁面２９と冷却部６１の内壁面６９とが殆ど隙間なく接している場合も含まれる。この点は、他の実施形態、変形例においても同じである。

また載置部２１が先細の円錐台形状であるので先端部側ほど断面積が小さく載置部２１の熱容量も小さい。よって先端部側に生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置すれば、非常に大きな冷却速度を得ることができる。

第１実施形態の生殖細胞保存用具１を用いて説明したように本発明の生殖細胞保存用具の最大の特徴は、生殖細胞保存用具を生殖細胞保持具と冷却器とで構成し、生殖細胞保持具に設けた、生殖細胞を含むガラス化保存液を載置、保持する載置部の外壁面と冷却部の内壁面とを密接させ、急速冷却する点にある。以下に、載置部と冷却部とを密接可能な他の生殖細胞保存用具を示す。

図５は、本発明の第１実施形態の生殖細胞保持具１１の第１変形例である生殖細胞保持具１２の構造を説明するための図である。図１から図３に示す第１実施形態の生殖細胞保持具１１と同一の構成には同一の符号を付して説明を省略する。

生殖細胞保持具１２は、生殖細胞保持具１１と比較して、切欠き部３２の形状が異なるのみである。切欠き部３２の基本構成は切欠き部３１と同じである。第１実施形態の生殖細胞保持具１１の載置部２１の切欠き部３１が、矩形形状を有するに対して、第１変形例である生殖細胞保持具１２の載置部２２の切欠き部３２は、基端部から先端部に向って広がっており、側面視において三角形となっている。生殖細胞保持具１２の使用方法及び載置部２２の作用効果は、生殖細胞保持具１１の載置部２１と同じである。

図６は、本発明の第１実施形態の生殖細胞保持具１１の第２変形例である生殖細胞保持具１３の構造を説明するための図である。図１から図３に示す第１実施形態の生殖細胞保持具１１と同一の構成には同一の符号を付して説明を省略する。

生殖細胞保持具１３は、生殖細胞保持具１１と比較して、載置部２３の構成、より具体的には、載置部２３に設けられる切欠き部３３の個数が異なるのみであり、生殖細胞保持具１３の使用方法及び載置部２３の作用効果は、生殖細胞保持具１１の載置部２１と同じである。

第１実施形態の生殖細胞保持具１１の載置部２１の切欠き部３１が、側部３８に１８０°隔てて相対する位置に２箇所設けられているのに対して、生殖細胞保持具１３の載置部２３には、切欠き部３３は一カ所しか設けられていない。なお、図５に示す生殖細胞保持具１２において、載置部２２に設けられる切欠き部３２の数を１つとしてもよい。

図７は、本発明の第１実施形態の生殖細胞保持具１１の第３変形例である生殖細胞保持具１４の構造を説明するための図である。図１から図３に示す第１実施形態の生殖細胞保持具１１と同一の構成には同一の符号を付して説明を省略する。

生殖細胞保持具１４は、生殖細胞保持具１１と比較して、載置部２４の構成、より具体的には、載置部２４の先端部に閉止板３９が取り付けられている。生殖細胞保持具１１、１２、１３は、先端部が完全に開口しているが、生殖細胞保持具１４では、先端部に部分的に閉止板３９が取り付けられている。この閉止板３９は、冷却器５１に挿入し載置部２４が縮径したとき、先端部を閉止させるように設けられている。なお、第１及び第２変形例の生殖細胞保持具１２、１３においても、同じ要領で載置部２２、２３の先端部に閉止板３９を設けることができる。

図１から図７に示す生殖細胞保存用具１は、生殖細胞保持具１１、１２、１３、１４の先端部側にバネ弾性を有する先細の載置部２１、２２、２３、２４を設けることで、冷却器５１と冷却部６１との密着性を確保している。載置部にバネ弾性を付加し、冷却部との密着性を確保する形態は、上記生殖細胞保存用具１の形態に限定されるものではない。以下に他の実施形態を示す。

図８は、本発明の第２実施形態の生殖細胞保存用具２を構成する生殖細胞保持具１５及び冷却器５５の構造を説明するための図である。図１から図３に示す第１実施形態の生殖細胞保存用具１と同一の構成には同一の符号を付して説明を省略する。図８において、冷却器５５の先端部を塗り潰して表示しているが、これは、先端部が閉止していることを明確にするためである。

生殖細胞保存用具２の基本構成は、第１実施形態の生殖細胞保存用具１と同一であり、使用方法、作用効果も、第１実施形態の生殖細胞保存用具１と基本的に同じである。生殖細胞保存用具２は、生殖細胞を含むガラス化保存液を載置、保持する生殖細胞保持具１５と、生殖細胞保持具１５を収容し、生殖細胞保持具１５に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させる冷却器５５と、冷却器５５の末端を封止するキャップ８１と、を含む。

生殖細胞保持具１５は、載置部２５の形態が第１実施形態の生殖細胞保持具１１の載置部２１の形態と異なる点を除き、構成、大きさ、材質等は、生殖細胞保持具１１と同じである。

載置部２５は、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置する部分であり、先端部が基端部に比較して拡大したラッパ管形状となっている。先端開口部２８に繋がるように切欠き部３１を設け、載置部２５にバネ弾性を付与する点などは第１実施形態の載置部２１と同じである。さらに切欠き部３１には、上記第１変形例及び第２変形例で示す切欠き部３２、３３を適用することもできる。

冷却器５５は、載置部２５に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させる点において冷却器５１と同じであるが、生殖細胞保持具１５の形態に対応した形態となっている。冷却器５５は、ストロー状の細長い円筒体の先端部に生殖細胞保持具１５の載置部２５を冷却する冷却部６５、冷却部６５の後端部側に案内部７２、さらに案内部７２に続き収容部７１、末端部にキャップ装着部７５を備える。

冷却部６５の役割、機能は、第１実施形態の冷却器５１の冷却部６１と同じである。冷却部６５は、円筒状であり、内径ｄ６は、生殖細胞保持具１５の円筒部４３の外径ｄ１よりも僅かに大きく設定されている。冷却部６５の先端部には、先細りの傾斜面７８が設けられ、先細りの傾斜面７８の先端部６８は閉じている。この傾斜面７８は、生殖細胞保持具１５を冷却器５５に挿入したときのストッパーとして機能する。

案内部７２は、生殖細胞保持具１５の載置部２５を冷却部６５に導くガイトとして機能する。このため案内部７２は、先細りのテーパ状となっており、先端部の内径は、冷却部６５の内径ｄ６と同一であり、後端部の内径ｄ７は、生殖細胞保持具１５の先端部の外径ｄ４よりも大きく設定されている。なお収容部７１の内径もｄ７である。案内部７２の長さは、特に限定されるものではないが、不必要に長くする必要もない。

上記構成からなる生殖細胞保存用具２において、載置部２５に生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置し、生殖細胞保持具１５を冷却器５５に挿入すると、生殖細胞保持具１５の先端部が、案内部７２の壁面に摺動し、さらに縮径しながら進み、先端部が冷却部６５の先端に設けられた傾斜面７８に衝突するまで進む。

生殖細胞保存用具２では、冷却器５５に先細りテーパ状の案内部７２を設けることで、生殖細胞保持具１５の載置部２５をスムーズに冷却部６５に導くことが可能であり、載置部２５の外壁面２９は、冷却部６５の内壁面６９に密着するので、急速冷却が可能となる。

生殖細胞保存用具２は、載置部２５の容積が第１実施形態の載置部２１に比較して大きいので、切欠き部３１の巾を大きくすることが可能であり、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置し易い利点がある。また載置部２５の容積が大きいので、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを多く保存することができる。一方で、第１実施形態の生殖細胞保持具１１の載置部２１に比較して熱容量が大きくなるデメリットもある。使用目的に応じて、好ましい生殖細胞保存用具１、２を選択して使用すればよい。

図１から図８に示す生殖細胞保存用具１、２は、載置部２１、２２、２３、２４、２５にバネ弾性を付加し、冷却器５１、５５に挿入し、冷却部６１、６５で載置部２１、２２、２３、２４、２５を縮径させ、冷却部６１、６５と載置部２１、２２、２３、２４、２５とを密着させることで急速冷却を実現している。以下に、載置部を縮径させる方法とは異なる方法で、冷却部と載置部とを容易に密着させる生殖細胞保存用具を示す。

図９は、本発明の第３実施形態の生殖細胞保存用具３を構成する生殖細胞保持具１６及び冷却器５６の構造を説明するための図である。図１から図３に示す第１実施形態の生殖細胞保存用具１と同一の構成には同一の符号を付して説明を省略する。図９において、冷却器５６の先端部を塗り潰して表示しているが、これは、先端部が閉止していることを明確にするためである。

生殖細胞保存用具３の基本構成は、第１実施形態の生殖細胞保存用具１と同一であり、使用方法、作用効果も、第１実施形態の生殖細胞保存用具１と基本的に同じである。生殖細胞保存用具３は、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置、保持する生殖細胞保持具１６と、生殖細胞保持具１６を収容し、生殖細胞保持具１６に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを急速冷却させる冷却器５６と、冷却器５６の末端を封止するキャップ８１と、を含む。

生殖細胞保持具１６は、先細りテーパ状の載置部２６に生殖細胞保持具１１と同様の切欠き部３１が設けられているが、載置部２６はバネ弾性を有していない。このため生殖細胞保持具１６を冷却器５６に挿入し、載置部２６が冷却部６６に達しても縮径することはなく、切欠き部３１の形状も変化しない。この点を除き、生殖細胞保持具１６の全体構成、大きさ、材質等は、生殖細胞保持具１１と同じである。

冷却器５６は、冷却部６６の傾斜角度α２が、生殖細胞保持具１６の載置部２６の傾斜角度α１と同一に設定されている点を除き、全体構成、大きさ、材質等は、生殖細胞保存用具１の冷却器５１と同一である。

上記構成からなる生殖細胞保存用具３において、載置部２６に生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置し、生殖細胞保持具１６を冷却器５６に挿入すると、載置部２６の外壁面２９が冷却部６６の内壁面６９に接した時点で停止する。このとき生殖細胞保持具１６の載置部２６の傾斜角度α１と冷却部６６の傾斜角度α２とが同一に設定されているので、載置部２６の外壁面２９は、冷却部６６の内壁面６９に密着し、急速冷却が可能となる。

上記のように第３実施形態の生殖細胞保存用具３は、載置部２６を先細りテーパ状とし、この傾斜角度α１と冷却部６６の傾斜角度α２とを同一とすることで、載置部２６にバネ弾性を付加することなく載置部２６と冷却部６６との密着を実現する。

載置部にバネ弾性を付加しない図９に示す生殖細胞保持具１６の場合、図１０、図１１のように変形して使用することができる。図１０、図１１において、生殖細胞保持具１７、１８の先端部を塗り潰して表示しているが、これは、当該部分が閉止していることを明確にするためである。

図１０は、先端部が完全に閉じられた生殖細胞保持具１７である。図１１の生殖細胞保持具１８は、載置部２７の先端部側の上部に切欠き部３７が設けられ、先端の下半分は閉じられている。なお、図９〜図１１では、載置部２６、２７を先細りテーパ状としているが、載置部を円筒状としてもよい。この場合は冷却部を載置部が隙間なく嵌合する円筒状とすればよい。

先端部が完全に閉じられた生殖細胞保持具１７の場合、生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇが載置部２６から飛び出し難い長所がある。一方で、融解液を用いた、ガラス化保存された生殖細胞を融解、洗浄液で洗浄しガラス化保存液を完全に除去する、ガラス化保存液の希釈が、先端部が開口した生殖細胞保持具に比較して難しくなる。

以上、種々の生殖細胞保存用具を示したが、使用目的、用途に応じて適宜好ましい生殖細胞保存用具を選択し使用すればよい。

本発明に係る生殖細胞保存用具及び生殖細胞のガラス化保存方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、要旨を変更しない範囲で変更してもよい。例えば上記実施形態では、生殖細胞保持具の載置部と円筒部とが一体的に製作されているが、載置部と円筒部とを別々に製造し、それらを接合してもよい。このとき載置部と円筒部とを別材料としてもよい。

また上記実施形態では、切欠き部の形状を矩形形状、三角形状としたが、他の形状であってもよい。また切欠き部の数、大きさも載置部の形態に応じて適宜変更することができる。

また上記実施形態では、載置部にバネ弾性を有する生殖細胞保存用具、さらに載置部が変形しない生殖細胞保存用具を示したが、生殖細胞保存用具は、載置部がバネ弾性を有していないが可撓性を有し、冷却器に押込まれることで塑性変形し密着する生殖細胞保存用具であってもよい。

先端部が全面開口している生殖細胞保持具において、切欠き部を設けることなく先端開口部２８から生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置部に載置してもよい。このような生殖細胞保持具は、安価に、また容易に製作できる利点がある。但し、切欠き部を設ける方が生殖細胞を含むガラス化保存液Ｇを載置部に載置し易い。

上記実施形態では、冷却媒体に液体窒素を使用する例を示したが、液体窒素と同等以上に冷却可能であれば、液体窒素以外の冷却媒体を使用してもよい。

本発明において保存可能な胚は、特定の胚に限定されるものではなく、本発明は、牛、豚などの動物、ヒトなどの胚の保存に好適に使用することができる。また卵子、組織細胞等の保存にも使用することができる。

実施例１
生殖細胞保持具には、次の要領で製作した生殖細胞保持具を使用した。材料には、０．２５ｍｌストロー（商品名：精液凍結用ミニストロー、プラスチック製、ＩＶＭ社 フランス）を用いた。はじめに、ストローに高温蒸気を吹き付け柔らかくし，左右に牽引することにより，吹き付け部分をテーパ状に細くした。次に、テーパ状部をストローカッターで切断し、テーパ状部の両側面をメス刃で１／４ずつ切り落とすことにより図５に示す生殖細胞保持具１２と同等の生殖細胞保持具を得た（図１２参照）。

冷却器には、次の要領で製作した冷却器を使用した。材料には，ピペットチップ（商品名Ｚａｐ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ、プラスチック製、Ｌａｂｃｏｎ、アメリカ）、０．５ｍｌストロー（商品名：ストロー精液管，プラスチック製，富士平工業株式会社、東京都）及びシリコンを使用し、図１に示す冷却器５１を得た。先端部には、がん玉を取付けシリコン樹脂で固めて封止した（図１２参照）。

本明細書の段落００５３〜００６４の手順により、牛の胚のガラス化保存及びガラス化後の融解・希釈を行った。その後、以下要領で胚の体外培養試験を行った。

融解後の胚の体外培養試験
ガラス化後融解・希釈した胚は、Ｍ２液で７回洗浄した後、５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、３８．５℃のインキュベーター内で、Ｇｌｙｃｉｎ、Ｔａｕｒｉｎを添加したｍＳＯＦ液を用いた微小滴培養法で培養した。培養開始から２４時間、４８時間後の胚の発育状態（生存率、胚の孵化率、生存胚の総細胞数）を調べた。

実施例２
実施例１と同様の生殖細胞保持具を製作し、同じ要領で試験を行った。但し、生殖細胞保持具には、図６に示す生殖細胞保持具１３と同様に切欠き部３３が１つの生殖細胞保持具を使用した。この生殖細胞保持具の載置部がバネ弾性を有する点、生殖細胞保持具の載置部が冷却器の内壁面と密着する点は、実施例１と同じである。

比較例１
冷却器と生殖細胞保持具とが接触しない生殖細胞保存用具として、一端が封鎖された筒状のストローを予め液体窒素内で冷却し、冷却器に対して載置部が非接触状態で挿入される生殖細胞保持具を挿入して冷却する生殖細胞保存用具を使用し、実施例１と同じ要領で試験を行った。

比較例２
対照として、胚を含むガラス化保存液を載置した付着保持具（生殖細胞保持具）を液体窒素内に直接沈めて凍結するクライオトップ法によりガラス化保存した胚についても、同様に融解・希釈して培養し、発育状態を調べた。

結果を表２〜表５に示した。

表２は、凍結融解後の胚の生存率を示す。実施例１では、２５個試験に供し、４８時間後に２４個（９６.０％）が生存し、実施例２では、１１個試験に供し、４８時間後に１０個（９０．９％）が生存していた。これに対して、比較例１の４８時間後の生存率は、９０．０％、比較例２の４８時間後の生存率は、９４．１％であった。このことから、本発明の方法でガラス化保存した胚は、４８時間培養後にも高い生存率を示すことが分かる。

表３は、融解後の胚の孵化率を示す。生存した胚が透明帯から脱出した孵化数は、実施例１で７６．０％、実施例２で７２．７％であるのに対して、比較例１では７０．０％、比較例２では、７０．６％であり、本発明の方法でガラス化保存した胚は、高い孵化率を示した。

表４は、生存胚の総細胞数を示す。総細胞数は、実施例１で１２２．０個、実施例２で１２２．５個、比較例１で８０．２個、比較例２で１１５．８個であり、本方法は、融解後の胚の品質も悪化しないことが分かった。

融解後の胚の移植
受胚牛は、発情日齢８日目の雌牛を用いた。牛体外受精後７日齢胚２個を実施例１の要領でガラス化保存した。ガラス化保存後、同日に融解しＭ２液で７回洗浄し、子宮経管経由法で受胚牛の黄体側子宮角に移植した。移植液はＭ２液を用いた。

結果を表５に示した。受胚牛２頭は受胎した。したがって、本発明の方法によりガラス化保存した胚は、保存後にも高い生存率を有しており、しかもガラス化保存胚に由来する産子を作出する能力を保持していることが明らかとなった。

１、２、３ 生殖細胞保存用具
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ 生殖細胞保持具
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７ 載置部
２８ 先端開口部
２９ 載置部の外壁面
３１、３２、３３、３６、３７ 切欠き部
３８ 側部
４３ 円筒部
５１、５２、５３、５４、５５、５６ 冷却器
６１、６２、６３、６４、６５、６６ 冷却部
６９ 冷却部の内壁面
１０１、１０２ 冷却装置
１０３ 魔法瓶
１０５ スタンド
１０７、１０７ａ，１０７ｂ ブロック
１０９ 液体窒素
Ｇ 生殖細胞のガラス化保存液

Claims (7)

1. 生殖細胞をガラス化保存液を用いてガラス化し冷凍保存するための生殖細胞保存用具であって、
   生殖細胞を含むガラス化保存液を載置する載置部を備える生殖細胞保持具と、
   前記生殖細胞保持具を収容し、前記載置部に載置された生殖細胞を含むガラス化保存液を急速冷却させる冷却器と、を含み、
   前記載置部には、外周面に先端部から基端部に向かう切欠き部及び／又は先端部が開口した先端開口部が設けられ、
   前記生殖細胞保持具を前記冷却器に挿入したとき、前記生殖細胞保持具の載置部の外壁面と前記冷却器の内壁面とが密着可能なことを特徴とする生殖細胞保存用具。
2. 前記載置部は、先細の円錐台形状又は円錐形状を有することを特徴とする請求項１に記載の生殖細胞保存用具。
3. 前記生殖細胞保持具を前記冷却器に押し込むと前記載置部が前記冷却器に接し、前記切欠き部及び／又は前記先端開口部が狭まり前記載置部が縮径し、前記載置部の外壁面と前記冷却器の内壁面とが密着することを特徴とする請求項１又は２に記載の生殖細胞保存用具。
4. 前記載置部には、外周面に先端部から基端部に向かう切欠き部が２か所設けられ、これらの位置が１８０°ずれていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の生殖細胞保存用具。
5. 前記生殖細胞保持具は、ストロー状の細管であり、前記載置部に続き、希釈液を収容可能な筒状部を備えることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の生殖細胞保存用具。
6. 前記冷却器は、先端部が閉止した先細の円錐台形状部又は円錐形状部を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の生殖細胞保存用具。
7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の生殖細胞保存用具を用いた生殖細胞のガラス化保存方法であって、
   前記冷却器は、筒状形状を有し、一端が封止され、他端部が開口しており、
   ガラス化保存液で平衡処理した生殖細胞を前記生殖細胞保持具の載置部に載置し、当該生殖細胞保持具を予め冷却した前記冷却器に挿入し、
   その後、当該冷却器を開口した端部を除き液体窒素に浸漬し、生殖細胞をガラス化し、保存することを特徴とする生殖細胞のガラス化保存方法。