KR20220020895A - 동결 보존용 지그의 고정구 및 당해 고정구를 이용한 동결 융해 방법 - Google Patents
동결 보존용 지그의 고정구 및 당해 고정구를 이용한 동결 융해 방법 Download PDFInfo
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Abstract
상면, 측면 및 저면을 갖는 기재(基材)의 상면에, 적어도 한쪽 끝이 기재의 측면부에 개구된 슬릿부를 갖거나, 혹은 기재의 상면에 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부와 당해 삽입부의 측면부에 한쪽 끝이 개구된 슬릿부를 갖는 동결 보존용 지그의 고정구 및 당해 고정구를 이용한 세포 또는 조직의 동결 융해 방법.
Description
본 발명은, 동결한 세포 또는 조직의 융해 시에 있어서 적합하게 이용되는 동결 보존용 지그의 고정구, 및 당해 고정구를 이용한 동결 융해 방법에 관한 것이다.
세포 또는 조직의 우수한 보존 기술은, 다양한 산업 분야에서 요구되고 있다. 예를 들면, 소의 배이식 기술에 있어서는, 배를 동결 보존하고, 수배(受胚) 소의 발정 주기에 맞춰 배를 융해하여, 이식하는 것이 행해지고 있다. 또, 사람의 불임 치료에 있어서는, 모체로부터 난자 또는 난소를 채취 후, 이식에 적합한 타이밍에 맞추기 위해 동결 보존해 두어, 이식 시에 융해하여 이용하는 것이 이루어지고 있다.
일반적으로, 생체 내에서 채취된 세포 또는 조직은, 설령 배양액 중이어도, 점차 활성이 소실되거나, 형질의 변화가 발생한다는 점에서, 생체 외에서의 세포 또는 조직의 장기간의 배양은 바람직하지 않다. 그 때문에, 생체 활성을 유지한 상태로 장기간 보존하기 위한 기술이 중요하다. 우수한 보존 기술에 의해, 채취된 세포 또는 조직을 보다 정확하게 분석하는 것이 가능해진다. 또 우수한 보존 기술에 의해, 보다 높은 생체 활성을 유지한 채로 세포 또는 조직을 이식에 이용하는 것이 가능해져, 이식 후의 생착률이 향상되는 것을 기대할 수 있다. 나아가서는, 생체 외에서 배양한 배양 피부, 생체 외에서 구축한 이른바 세포 시트와 같은 이식을 위한 인공 조직을, 순차적으로 생산하여 보존해 두고, 필요한 때에 사용하는 것도 가능해져, 의료적인 면뿐만 아니라, 산업면에 있어서도 큰 메리트를 기대할 수 있다.
세포 또는 조직의 동결 보존 방법으로서, 예를 들면 완만 동결법이 알려져 있다. 이 방법에서는, 우선, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제를 함유시킴으로써 얻어진 보존액에, 세포 또는 조직을 침지한다. 당해 내동제로서는, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 디메틸술폭시드 등의 화합물이 이용된다. 당해 보존액에, 세포 또는 조직을 침지 후, 비교적 느린 냉각 속도(예를 들면 0.3~0.5℃／분의 속도)로, -30~-35℃까지 냉각함으로써, 세포 내외 또는 조직 내외의 용액이 충분히 냉각되어, 점성이 높아진다. 이러한 상태에서, 당해 보존액 중의 세포 또는 조직을 액체 질소의 온도(-196℃)까지 더 냉각하면, 세포 내 또는 조직 내와 그 바깥 주위의 미소 용액이 모두 비결정인 채로 고화되는 현상인 유리화가 일어난다. 유리화에 의해, 세포 내외 또는 조직 내외가 고화되면, 실질적으로 분자의 움직임이 없어지므로, 유리화된 세포 또는 조직을 액체 질소 중에 보존함으로써, 반영구적으로 보존할 수 있다고 생각된다.
또, 세포 또는 조직의 동결 보존 방법으로서, 유리화 동결법도 알려져 있다. 유리화 동결법이란, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 디메틸술폭시드 등의 내동제를 다량으로 포함하는 보존액의 응고점 강하에 의해, 빙점 아래여도 빙정이 생기기 어려워지는 원리를 이용한 것이다. 이 보존액을 급속히 액체 질소 중에서 냉각시키면, 빙정을 발생시키지 않은 채로 고화시킬 수 있다. 이와 같이 고화되는 것을 유리화 동결이라고 한다. 또, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액은, 유리화액으로 호칭된다.
상술한 완만 동결법에서는, 비교적 느린 냉각 속도로 냉각할 필요가 있기 때문에, 동결 보존을 위한 조작에 시간을 요한다. 또, 냉각 속도를 제어하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하는 문제가 있다. 덧붙여, 상기 완만 동결법에서는, 세포 바깥 또는 조직 바깥의 보존액 중에 빙정이 형성되므로, 세포 또는 조직이 당해 빙정에 의해 물리적으로 손해를 입을 우려가 있다. 이에 반해, 상기한 유리화 동결법에서는, 조작의 시간은 단시간이며, 특별한 장치 또는 지그를 필요로 하지 않는 프로세스이다. 덧붙여, 유리화 동결법은, 빙정을 발생시키지 않음으로써 높은 생존율이 얻어진다.
유리화 동결법을 이용한 세포 또는 조직의 동결 보존 방법에 대해서는, 다양한 방법으로, 다양한 종류의 세포 또는 조직을 이용한 예가 나타나 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에서는, 동물 또는 사람의 생식 세포 또는 체세포에 유리화 동결법을 적용하는 것이, 동결 보존 및 융해 후의 생존율의 점에서, 극히 유용하다는 것이 나타나 있다.
유리화 동결법은, 주로 사람의 생식 세포를 이용하여 발전해 온 기술인데, 최근에는, iPS 세포나 ES 세포에 응용하는 것도 널리 검토되고 있다. 또, 비특허문헌 1에서는, 초파리의 배의 보존에 유리화 동결법이 유효한 것이 나타나 있다. 또한, 특허문헌 2에서는, 식물 배양 세포나 조직의 보존에 있어서, 유리화 동결법이 유효한 것이 나타나 있다. 이와 같이, 유리화 동결법은 널리 다양한 종의 세포 및 조직의 보존에 유용한 것이 알려져 있다.
적절한 유리화 동결을 이루기 위해, 동결 속도는 빠르면 빠를수록 바람직한 것이 알려져 있다. 또한, 동결 보존 후의 융해 공정 시에 있어서도, 세포 또는 조직 중으로의 재빙정 형성을 억제하는 관점에서, 융해 속도는 빠르면 빠를수록 바람직한 것이 알려져 있다.
적절한 유리화 동결을 이루기 위한 중요한 인자인 동결 속도와 융해 속도 중, 특히 중요한 것은, 융해 속도로 되어 있다. 예를 들면, 비특허문헌 2에 기재되는 바와 같이, 신속히 동결된 세포여도, 융해 속도가 느린 경우에는 생존율이 낮아지는 것이 알려져 있다. 또 특허문헌 3에는, 동결한 샘플을 급속 융해법에 의해 융해함으로써, 융해 후의 사람 iPS 세포 유래 신경 간세포(幹細胞)/전구 세포의 생존율이 향상되는 것이 기재되어 있다.
일반적으로, 유리화 동결법에 관련된 동결 방법으로서는, 특허문헌 4에 있어서, 포유동물 배 또는 난자를 동결 스트로, 동결 바이알 또는 동결 튜브 등의 동결 보존용 용기의 내면에, 이들 배 또는 난자를 포피(包被)하기에 충분한 최소량의 유리화액으로 붙이고, 이 용기를 액체 질소에 접촉시켜 급속히 냉각하는 방법이 제안되고 있다. 당해 동결 방법 후에 행해지는 융해 방법은, 상기한 방법으로 보존한 동결 보존용 용기를 액체 질소로부터 취출(取出)하여, 용기의 일단부를 개구하고, 이 용기 내에 33~39℃의 희석액을 주입하여, 동결한 배 또는 난자를 융해 희석하는 것이다. 이 방법에 의하면, 포유동물 배 또는 난자를 바이러스나 세균에 감염될 우려가 없이 높은 생존율로 보존 및 융해 희석할 수 있다고 되어 있다. 그러나, 동결 스트로, 동결 바이알 또는 동결 튜브 등의 동결 보존용 용기의 내면에, 배 또는 난자를 붙이는 작업의 난이도는 높고, 또 확실하게 배 또는 난자가 동결 보존용 용기 내에 재치(載置)된 것을 확인하는 것이 어려웠다.
특허문헌 5에서는, 열전도성 부재를 가진 세포 유지 부재와 통 형상 수납 부재를 가진 세포 동결 보존 용구가 기재되어 있으며, 특허문헌 4의 동결 융해 방법에 있어서의 문제가 어느 정도 해결되고 있다. 특허문헌 5에 기재되어 있는 동결 보존 용구의 사용 방법으로서, 현미경 하에 있어서, 난자를 세포 유지 부재에 부착시켜, 세포 유지 부재를 통 형상 수납 부재에 수납한 후에, 액체 질소에 침지하여 유리화 동결한다. 그 후에, 통 형상 수납 부재의 개구부에 덮개 부재를 장착하여, 액체 질소 탱크 내에서 보관하는 방법이 기재되어 있다. 또 특허문헌 6에서는, 난(卵) 부착 유지용 스트립 상에 난자를 소량의 유리화액과 함께 재치하고, 동결 보존용 지그 전체를 통 형상의 수납 용기에 수납한 후에 액체 질소에 침지함으로써, 유리화 동결이 행해진다.
보다 프로세스가 적은 유리화 동결법에 관련된 동결 방법으로서, 특허문헌 7 및 특허문헌 8에 기재되는 바와 같은, 사람의 불임 치료 분야에서 사용되고 있는 이른바 크라이오탑(Cryotop)(등록상표)법이라는 방법이 개시되어 있다. 이들 방법에 있어서의 동결 조작에서는, 난 부착 유지용 스트립으로서 길쭉한 형상의 가요성이며 무색 투명한 필름을 구비한 난 동결 보존 용구를 사용하여, 현미경 관찰 하에서 당해 필름 상에 극소량의 보존액과 함께 난자 또는 배를 재치하고, 난자가 부착된 필름을 액체 질소에 침지함으로써, 유리화 동결이 행해진다. 그리고 동결한 난자 또는 배가 재치된 난 부착 유지용 스트립은 캡 등으로 보호된 후, 액체 질소 탱크 내에서 보존된다.
또 크라이오탑법에 적합한 동결 보존용 지그로서, 예를 들면 특허문헌 9~11에서는, 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 보존액을 제거하는 흡수 성능을 구비한 동결 보존용 지그에 의해, 우수한 생존율로 이들 생식 세포를 동결 보존시키는 방법이 제안되고 있다.
이들 방법에 따라 동결된 난자나 배 등의 융해는, 난 부착 유지용 스트립을 보온된 융해액에 침지함으로써 행해지고, 당해 융해액 중에서 스트립 상에 재치된 난자나 배 등은 회수된다.
한편, 동결 보존 방법에 있어서의 융해 조작의 작업성을 높이기 위해, 특허문헌 12에 기재되는 바와 같은 액체 질소 용기가 알려져 있다. 당해 액체 질소 용기는 덮개부에 슬릿부가 형성되어 있으며, 통 형상 수납 부재에 수납된 동결 보존용 지그는, 당해 슬릿부에 일단 기대어 세워 놓아진다.
이와 같이 하여 동결된 세포 또는 조직을 액체 질소의 액면보다 아래에 위치하는 상태가 되도록 일단 유지해 두면, 예를 들면 특허문헌 5나 특허문헌 6에 기재되는 방법에 있어서는, 액체 질소의 액면보다 위에 위치하는 덮개 부재를 용이하게 떼어내는 것이 가능해져, 세포 또는 조직을 융해액 중에 신속히 이동시킴으로써, 융해 속도의 저하를 막을 수 있다. 또 특허문헌 7이나 특허문헌 8, 및 특허문헌 9~11에 기재되는 방법에 있어서는, 당해 캡으로부터 동결 보존용 지그를 빼냄으로써, 세포 또는 조직을 융해액 중으로 신속히 이동시킬 수 있어, 융해 속도의 저하를 막을 수 있다.
Steponkus et al., Nature 345：170-172(1990)
Hiroshi SOUZU 저(著) 「생세포의 동결에 의한 장애와 보호의 기구」 화학과 생물 제18권(1980) 2호 P.78~87 일본 농예 화학회 발행
그러나 상기한 특허문헌 12에 기재되는 액체 질소 용기를 이용한 방법에서는, 덮개부에 형성된 슬릿부에 동결 보존용 지그를 기대어 세워 놓았을 때, 당해 동결 보존용 지그를 안정적으로 유지하는 것은 가능해도, 동결 보존용 지그의 재치부가 액체 질소의 액면보다 아래에 위치하여, 확실하게 세포 또는 조직의 동결 상태가 유지되고 있는지를 확인하는 것이 곤란했다. 또 통 형상 수납 부재의 길이는, 액체 질소 용기의 저부로부터 덮개부가 설치된 위치까지의 길이보다 길 필요가 있으며, 이러한 경우, 당해 통 형상의 수지 부재의 내부로부터 세포 유지 부재 본체부를 취출하는 작업은 번잡하고, 신속한 융해 조작을 행하는 관점에서 개선이 요망되고 있었다.
또 상술한 특허문헌 7 및 특허문헌 8에서는, 난자 또는 배를 재치하는 필름의 폭을 제한함으로써, 또 특허문헌 9~11에서는 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 보존액을 제거하는 흡수 성능을 구비한 동결 보존용 지그에 의해, 적은 양의 보존액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하여, 우수한 생존율을 얻는 방법이 제안되고 있다. 그러나, 이들 방법에서는, 배 또는 난자를 융해·회수하는 융해 조작 시에, 필름 상에 기포가 부착되어, 현미경 관찰 하에 있어서 재치된 배 또는 난자와 기포가 구별되기 어렵다는 문제가 있었다. 나아가서는, 필름 상에 부착된 기포가 난자 또는 배에 부착되어, 이들의 시인(視認)이 저해되는 것 이외에, 기포의 부력에 의해 난자 또는 배가 갑자기 현미경 시야로부터 벗어나 버린다는 문제가 있어, 배 또는 난자의 회수 작업을 저해한다는 문제도 있었다.
본 발명은, 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존의 융해 조작 시에 있어서, 적합한 작업성을 실현하기 위한 고정구를 제공하는 것을 주된 과제로 한다. 보다 구체적으로는, 동결 보존용 지그를 안정적으로 유지하는 것이 가능하고, 동결된 세포 또는 조직을 융해액으로 옮기는 조작에 앞서, 당해 세포 또는 조직이 확실하게 냉각된 상태에 있는 것을 확인할 수 있으며, 동결된 세포 또는 조직을 보온된 융해액 중으로 신속히 옮기는 것이 가능한 동결 보존용 지그의 고정구를 제공하는 것을 과제로 한다.
또 본 발명은, 번잡한 작업을 필요로 하지 않고, 세포 또는 조직을 동결 후에 융해할 때에, 세포 또는 조직의 회수 조작이 용이한 동결 융해 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 이하의 구성을 갖는 동결 보존용 지그의 고정구(이하, 「본 발명의 고정구」라고도 한다.)에 의해 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견했다. 또 이하에 기재하는 세포 또는 조직의 동결 융해 방법에 의해 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견했다.
[1] 상면, 측면 및 저면을 갖는 기재(基材)의 상면에, 적어도 한쪽 끝이 기재의 측면부에 개구된 슬릿부를 갖거나, 혹은 기재의 상면에 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부와 당해 삽입부의 측면부에 한쪽 끝이 개구된 슬릿부를 갖는 동결 보존용 지그의 고정구로서, 당해 슬릿부는 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 고정 구조부를 갖고, 당해 고정 구조부가 하기 (I)~(III)의 구조부 중 적어도 1개의 구조부인 것을 특징으로 하는, 동결 보존용 지그의 고정구.
(I) 슬릿부의 내부의 측면에 형성된 요철 구조부.
(II) 슬릿부의 내부의 측면간의 거리가, 슬릿부의 안으로 나아갈수록 서서히 좁아진 테이퍼 구조부.
(III) 슬릿부가 슬릿 개구부로부터 기재의 내부를 향해 직진한 후에, 당해 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 굴곡 구조부.
[2] 고정 구조부로서, 상기한 (II)의 테이퍼 구조부, 및/또는 상기한 (III)의 굴곡 구조부 중 어느 하나를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 [1]에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구.
[3] 고정 구조부로서 상기한 (II)의 테이퍼 구조부를 갖고, 당해 테이퍼 구조부가 하기 식 (1)의 요건을 만족하는 것을 특징으로 하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구.
(T21-T22)/T11≤0.03 식 (1)
(식 중, T21은 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분에 있어서의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내고, T22는 슬릿 개구부로부터 가장 떨어진 부분에 있어서의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내며, T11은 테이퍼 구조부의 안쪽 길이를 나타낸다.)
[4] 고정 구조부로서, 상기한 (III)의 굴곡 구조부를 갖고, 슬릿부가 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 후에 상기한 (II)의 테이퍼 구조부를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구.
[5] 기재의 상면 또는 측면에, 당해 기재의 상면보다 상방으로 신장된 액면 게이지부를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구.
[6] 재치부를 갖는 본체 부재 및 당해 본체 부재에 착탈이 자유로운 캡 부재를 적어도 갖는 동결 보존용 지그의 재치부에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하고, 당해 재치부를 캡 부재로 밀폐하는 밀폐 공정과, 당해 밀폐한 재치부를 냉각 용매에 의해 냉각하여, 세포 또는 조직을 동결하는 동결 공정과, 당해 동결 공정에 있어서 동결된 세포 또는 조직의 동결 상태를 유지하는 보냉 공정과, 동결 상태가 유지되어 있던 세포 또는 조직을 융해하는 융해 공정을 적어도 갖고, 당해 융해 공정의 개시 전에 있어서, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직을, 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구가 갖는 고정 구조부에 고정하여, 당해 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 본체 부재와 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태로 일단 유지하고, 당해 융해 공정에서는 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 본체 부재가 갖는 재치부를 융해액에 침지하여 세포 또는 조직을 융해하는 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 융해 방법.
[7] 상기한 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 [6]에 기재된 세포 또는 조직의 동결 융해 방법.
본 발명에 의하면, 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존의 융해 조작 시에 있어서, 적합한 작업성을 실현하기 위한 고정구를 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는, 동결 보존용 지그를 안정적으로 유지하는 것이 가능하고, 동결된 세포 또는 조직을 융해액으로 옮기는 조작에 앞서, 당해 세포 또는 조직이 확실하게 냉각된 상태에 있는 것을 확인할 수 있으며, 동결된 세포 또는 조직을 보온된 융해액 중에 신속히 옮기는 것이 가능한 동결 보존용 지그의 고정구를 제공할 수 있다.
또 본 발명에 의하면, 번잡한 작업을 필요로 하지 않고, 세포 또는 조직을 동결 후에 융해할 때에, 세포 또는 조직의 회수 조작이 용이한 동결 융해 방법을 제공할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 2는, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 3은, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 나타내는 측면 단면도이다.
도 4는, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 개구부측에서 본 측면도이다.
도 5는, 본체 부재와 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 6은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 7은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 후에, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 8은, 본 발명의 고정구의 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 9는, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 10은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 11은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 12는, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 13은, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 14는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 15는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 16은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 17은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 18은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 19는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 20은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 21은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 22는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 23은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 24는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 25는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 26은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 27은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 28은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 29는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 30은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 31은, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 개략도이다.
도 32는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 다른 개략도이다.
도 33은, 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 재치부를 융해액에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다.
도 2는, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 3은, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 나타내는 측면 단면도이다.
도 4는, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 개구부측에서 본 측면도이다.
도 5는, 본체 부재와 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 6은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 7은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 후에, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태를 나타내는 측면 개략도이다.
도 8은, 본 발명의 고정구의 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 9는, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 10은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 11은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 12는, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 13은, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 14는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 15는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 16은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 17은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 18은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 19는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 20은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 21은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 22는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 23은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 24는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 25는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 26은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 27은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 28은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 29는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다.
도 30은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다.
도 31은, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 개략도이다.
도 32는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 다른 개략도이다.
도 33은, 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 재치부를 융해액에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 고정구(이하, 본 발명의 고정구로 기재)는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 고정하기 위해 이용되는 것이다. 또 본 발명의 고정구는, 세포 또는 조직을 이른바 유리화 동결 보존법으로 동결 보존할 때에, 적합하게 이용되는 것이다. 본 발명에 있어서 세포란, 단일 세포뿐만 아니라, 복수의 세포로 이루어지는 생물의 세포 집단을 포함하는 것이다. 복수의 세포로 이루어지는 세포 집단이란 단일 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 되고, 복수의 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 된다. 또, 조직이란, 단일 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 복수의 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 세포 이외에 세포 바깥 매트릭스와 같은 비세포성 물질을 포함하는 것이어도 된다. 본 발명의 고정구는 난자 또는 배의 동결 보존에 있어서, 특히 적합하게 이용할 수 있다.
본 발명의 고정구는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 고정구, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 고정 용구, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 고정 기구, 세포 또는 조직의 동결 보존 용구의 고정구, 세포 또는 조직의 동결 보존 기구의 고정구로 바꿔 말할 수 있다.
이하에 본 발명의 고정구에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명의 고정구는 상면(윗면), 측면 및 저면을 갖는 기재로 이루어지는 동결 보존용 지그의 고정구로서, 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 슬릿부를 기재의 상면에 갖는다. 혹은 기재의 상면에 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부와 당해 삽입부의 측면부에 한쪽 끝이 개구된 슬릿부를 갖는다. 본 발명에 있어서 당해 슬릿부는, 기재의 상면에 1개소 갖고 있으면 되고, 복수 개소에 갖고 있어도 된다.
본 발명의 고정구를 이용하여 동결 보존용 지그를 고정함에 있어서, 당해 동결 보존용 지그가 갖는 통 형상 수납 부재의 선단부, 혹은 캡 부재의 선단부를, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부에 삽입한 후, 당해 슬릿부를 따라 동결 보존용 지그를 슬릿 안쪽으로 이동시킨다. 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 폭은, 동결 보존용 지그를 이동시킬 때의 조작성과, 동결 보존용 지그의 고정 안정성을 양립시키는 관점에서, 통 형상 수납 부재의 선단부의 폭 혹은 캡 부재의 선단부의 폭에 대해, 90~110%인 것이 바람직하다. 또한, 통 형상 수납 부재로서는 특허문헌 5에 기재된 바와 같은, 세포 유지 부재를 수납 가능하며 또한 내한성 재료에 의해 형성된 일단(一端)이 폐색된 통 형상 수납 부재를 사용할 수 있다.
본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부는, 삽입된 동결 보존용 지그를 강고하게 고정·유지하기 위해 고정 구조부를 갖고, 당해 고정 구조부로서 하기 (I)~(III)의 구조부 중 적어도 1개의 구조부를 갖는다.
(I) 슬릿부의 내부의 측면에 형성된 요철 구조부.
(II) 슬릿부의 내부의 측면간의 거리가, 슬릿부의 안으로 나아갈수록 서서히 좁아진 테이퍼 구조부.
(III) 슬릿부가 슬릿 개구부로부터 기재의 내부를 향해 직진한 후에, 당해 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡되는 굴곡 구조부.
슬릿부의 내부의 측면에 형성된 요철 구조부에 대해서 설명한다. 당해 슬릿부의 내부의 측면에 형성된 요철 구조부는, 동결 보존용 지그가 갖는 선단부(통 형상 수납 부재의 선단부, 혹은 캡 부재의 선단부)가 요철 구조를 갖는 경우, 고정구가 갖는 요철 구조부와 동결 보존용 지그가 갖는 요철 구조부가 끼워짐으로써, 동결 보존용 지그를 고정구에 확실하게 고정할 수 있다. 슬릿부가 갖는 요철 구조부는, 슬릿부의 내부의 측면에 있어서, 고정구의 저면에 평행한 방향으로 요철 구조부의 오목부 및/또는 볼록부가 연장된 형상인 것이 바람직하다.
본 발명의 고정구가, 슬릿부의 내부의 측면에 요철 구조부를 갖는 경우, 고정되는 동결 보존용 지그의 선단부의 형상, 바람직하게는 캡 부재의 선단부의 형상에 맞춰, 임의의 형상의 오목형 구조 및/또는 볼록형 구조를 가질 수 있다. 또, 고정구가 갖는 요철 구조부의 단면 형상은, 고정되는 동결 보존용 지그의 선단부의 요철 구조부의 단면 형상과 같은 형상인 것이 바람직하다.
본 발명의 고정구가, 슬릿부의 내부의 측면에 요철 구조부를 갖는 경우, 슬릿부의 내부의 측면 중 적어도 1개소에 갖고 있으면 된다. 동결 보존용 지그의 고정 안정성을 높이는 관점에서, 당해 슬릿부의 내부의 서로 마주 본 측면의 양면에 요철 구조부를 갖고 있는 것이 보다 바람직하다. 여기서 서로 마주 본 측면의 양면이란, 본 발명의 고정구를 상방에서 보았을 때의 상면 개략도에 있어서, 서로 마주 보고 있는 측면의 양면을 의미한다. 또한 이들 측면의 양면에 위치하는 요철 구조부는 슬릿부의 안쪽에서 연속해서 이어져 있어도 된다.
본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부가 고정 구조부로서 테이퍼 구조부를 갖는 경우, 당해 슬릿부는, 동결 보존용 지그를 삽입하는 슬릿 개구부로부터, 삽입함에 따라 슬릿부의 내부의 측면간의 거리가 짧아진다. 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부가 테이퍼 구조부를 가지면, 삽입된 동결 보존용 지그는 테이퍼 구조부에 끼워짐으로써, 동결 보존용 지그를 고정구에 확실하게 고정할 수 있어 바람직하다. 테이퍼 구조의 형상은, 고정되는 동결 보존용 지그의 선단부의 형상, 구체적으로는 통 형상 수납 부재의 선단부의 형상, 혹은 캡 부재의 선단부의 형상에 맞춰, 임의의 형상의 테이퍼 구조를 가질 수 있는데, 당해 테이퍼 구조부가 하기의 식 (1)을 만족하는 경우, 동결 보존용 지그의 고정 안정성에 특히 우수한 고정구가 얻어지므로 바람직하다.
(T21-T22)/T11≤0.03····식 (1)
(식 중, T21은 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분에 있어서의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내고, T22는 슬릿 개구부로부터 가장 떨어진 부분에 있어서의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내며, T11은 테이퍼 구조부의 안쪽 길이를 나타낸다.)
본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부가 고정 구조부로서, 굴곡 구조부를 갖는 경우, 당해 슬릿부는, 동결 보존용 지그를 삽입하는 슬릿 개구부로부터, 기재의 내부를 향해 일정 거리 직진한 후에, 당해 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 구조를 갖는다. 당해 슬릿부가 굴곡 구조부를 갖는 경우에는, 슬릿 개구부로부터 삽입된 동결 보존용 지그는 굴곡 구조부를 거쳐, 개구부로부터 직진한 방향과는 다른 방향으로 더욱 직진 삽입되어, 고정되기 때문에, 개구부측으로 갑자기 탈락하는 것을 방지할 수 있어 바람직하다. 또한 기재의 내부를 향해 직진하는 일정 거리는, 고정되는 캡 부재의 외형 길이(캡 부재 외형의 삽입 방향 길이)의 3배 이상인 것이 바람직하다.
상술한 (I)~(III)의 고정 구조부 중에서도, 동결 보존용 지그를 확실하게 고정할 수 있으며, 또한 고정할 때의 조작성이 우수한 (II)의 테이퍼 구조부가 바람직하다. 또 개구부측으로 동결 보존용 지그가 갑자기 탈락하는 것을 방지할 수 있는 (III)의 굴곡 구조부가 바람직하다. 나아가서는, 상술한 (III)의 굴곡 구조부를 갖고, 슬릿부가 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 후에, 상기한 (II)의 테이퍼 구조부를 갖는 고정구는, 동결 보존용 지그가 개구부측으로 갑자기 탈락하는 것을 방지할 수 있음과 더불어, 동결 보존용 지그의 고정 안정성과 고정할 때의 조작성이 우수하기 때문에, 특히 바람직하다.
본 발명의 고정구의 형상(기재에 슬릿부가 형성되지 않은 것으로 간주하거나, 혹은 기재의 상방에 동결 보존용 지그를 삽입하기 위한 삽입부가 설치되지 않은 것으로 간주하고, 또 후술하는 액면 게이지부가 부설되지 않은 것으로 간주했을 때의 개략 형상)은, 삼각기둥, 사각기둥, 육각기둥 등의 각기둥 구조 이외에, 상면을 형성한 삼각뿔, 사각뿔 등의 각뿔의 부분 구조를 들 수 있다. 바람직하게는, 각기둥 구조이고, 보다 바람직하게는 사각기둥 구조이다. 또, 상기한 것 이외에도 원기둥 구조나 원뿔의 부분 구조도 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서 기재는 액체 질소 내성 재료로 형성되는 것이 바람직하다. 이러한 소재로서는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 합금 등의 각종 금속, ABS 수지, 아크릴 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리스티렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 불소계 수지나 각종 엔지니어링 플라스틱, 나아가서는 유리, 고무 소재 등을 적합하게 이용할 수 있다. 특히 금속은, 우수한 내구성을 갖는 것에 더하여, 자중이 크고, 동결 보존용 지그를 양호하게 고정할 수 있는 관점에서 바람직하다. 그 중에서도 가공성의 관점에서 알루미늄이 바람직하다. 본 발명의 고정구는, 한 종류의 소재로 구성되어 있어도 되고, 복수의 소재로 구성되어 있어도 된다.
본 발명의 고정구는 기재의 상면 또는 측면에, 당해 기재의 상면보다 상방으로 신장된 액면 게이지부를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 고정구가 갖는 액면 게이지부는, 냉각 용매의 액면을 관리하기 위해 이용하는 구조체이다. 액면 게이지부가 있음으로써, 냉각 용매의 액면이 용이하게 조정 가능하다. 바꾸어 말하면, 세포 또는 조직이 재치된 동결 보존용 지그를 본 발명의 고정구에 고정했을 때에, 동결 보존용 지그에 재치된 세포 또는 조직이 확실하게 냉각된 상태에 있는 것을 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명의 고정구가 바람직하게 갖는 액면 게이지부는, 용기의 바닥으로부터 냉각 용매의 액면 방향으로 연장된 굴뚝형(사각기둥 등의 각기둥형 또는 원기둥형)의 형상인 것이 바람직하다. 또 액면 게이지부는 상술한 기재(基材)와 마찬가지로, 액체 질소 내성 재료로 형성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 고정구가 갖는 액면 게이지부는, 기재의 상면보다 상방으로 신장되고, 냉각 용매의 액면을 관리하는 기준이 될 수 있는 것이면, 특별히 형태는 상관없지만, 작업자가 용이하게 액면의 위치를 시인할 수 있는 관점에서, 냉각 용매의 액면으로부터 나와 있거나, 혹은, 조금 액면에 가려진 정도인 것이 바람직하다.
본 발명의 고정구가 갖는 액면 게이지부가, 냉각 용매의 액면으로부터 돌출하는 높이를 갖는 경우, 당해 액면 게이지부는 마킹부를 갖는 것이 바람직하다. 마킹부의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 냉각 용매의 액면에 평행한 선분인 것이 바람직하다. 마킹부는, 냉각 용매의 액면의 높이의 기준이 되는 관점에서, 높이 방향에 대해 1개소 갖고 있으면 되고, 2개소 이상 갖고 있어도 된다.
본 발명의 고정구는, 세포 또는 조직의 동결 보존~융해의 일련의 프로세스에 있어서, 특히, 액체 질소로 대표되는 냉각 용매가 투입된 탱크로부터, 동결된 세포 또는 조직이 일단 취출된 후의 보냉 조작, 및 세포 또는 조직을 융해할 때의 융해 조작에 있어서 적합하게 이용할 수 있다. 일반적으로, 세포 또는 조직을 이른바 유리화 동결법으로 보존할 때, 길쭉한 형상의 스트립을 갖는 동결 보존용 지그를 이용하여 동결 보존이 행해진다. 이러한 동결 보존용 지그는, 상술한 특허문헌 7~11 이외에도, 예를 들면 국제 공개 제2011/070973호에 개시되어 있다.
동결 보존~융해의 일련의 프로세스로서는, 첫째, 동결 보존용 지그의 스트립에, 평형화 처리가 이루어진 세포 또는 조직을 보존액과 함께 적하(滴下) 부착시키고, 이어서 냉각 용매(바람직하게는 액체 질소)를 이용하여 세포 또는 조직을 냉각하여, 동결 조작을 행한다. 둘째, 동결 조작을 행한 세포 또는 조직을, 냉각 용매 탱크의 내부에서 극저온의 환경을 유지한 채로 장기간 보존한다. 셋째, 동결된 세포 또는 조직을, 극저온의 환경으로부터 이른바 융해액으로 불리는 용액 중으로 옮겨, 융해액 중에서 융해·해동하는 융해 조작을 행한다. 본 발명의 고정구는, 상기한 냉각 용매 탱크로부터 세포 또는 조직을 취출한 후의 보냉 조작 및 융해 조작에 있어서, 동결 보존용 지그를 고정·유지하기 위해 적합하게 이용할 수 있다.
본 발명의 고정구를 이용한 동결 보존~융해의 프로세스에 있어서의 융해 조작에서는, 냉각 용매 탱크 내에서 유리화 상태가 유지된 동결 보존용 지그를, 당해 탱크 내로부터 취출하여, 세포 또는 조직을 융해액으로 옮기는 조작에 앞서, 본 발명의 고정구를 이용하여 냉각 용매 중에서 보냉한다. 그 때, 본 발명의 고정구에 의해, 동결 보존용 지그가 갖는 통 형상 수납 부재의 선단부, 혹은 캡 부재의 선단이(동결된 세포 또는 조직이), 냉각 용매의 액면 하에 위치하며, 또한 당해 동결 보존용 지그의 일부가 냉각 용매의 액면 상에 위치하도록 유지해 두면, 세포 또는 조직을 융해액 중에 신속히 이동시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 의해, 동결된 세포 또는 조직의 융해 속도의 저하를 막을 수 있다.
본 발명의 고정구는, 세포 또는 조직의 동결 보존~융해의 일련의 프로세스에서, 세포 또는 조직이 냉각 용매에 접촉하지 않는, 이른바 폐쇄형 동결 보존~융해의 프로세스에 바람직하게 이용할 수 있다.
폐쇄형 동결 보존~융해의 프로세스에서는, 동결 조작 시에, 스트립에 대해 세포 또는 조직을 보존액과 함께 적하 부착시킨 후에, 단부가 완전히 폐색된 통 형상 수납 부재에 의해 동결 보존용 지그를 피포하여, 외계로부터 차단한다. 혹은 스트립에 대해 세포 또는 조직을 보존액과 함께 적하 부착시킨 후에, 캡 부재에 의해 당해 스트립을 피포하여, 외계로부터 차단한다. 이러한 차단 후, 당해 동결 보존용 지그를 냉각 용매(바람직하게는 액체 질소)에 침지하여, 세포 또는 조직을 냉각·동결한다. 상기한 폐쇄형 동결 조작 및 보관 등에 있어서는, 통 형상 수납 부재 혹은 캡 부재를 개재하여, 세포 또는 조직 주변의 공기 및 보존액이 냉각되어, 유리화 상태가 유지된다.
유리화 상태가 유지된 후, 액체 질소의 액면 상에 위치하는 통 형상 수납 부재에 고정된 덮개를 떼어냄으로써, 세포 또는 조직이 재치된 동결 보존용 지그를, 액체 질소에 접촉시키지 않고 신속히 취출하여, 융해액 중에 침지할 수 있다. 혹은 본 발명의 고정구에 의해 고정되어 있는 캡 부재로부터, 세포 또는 조직이 재치된 스트립을 갖는 동결 보존용 지그를 빼냄으로써, 당해 스트립에 유지된 세포 또는 조직을 액체 질소에 접촉시키지 않고 신속히 취출하여, 융해액 중에 침지할 수 있다. 보다 신속한 조작이 가능해진다는 관점에서, 후자의 동결 보존용 지그가 바람직하다.
상기한 조작에 의해 융해액 중에 침지되는 세포 또는 조직은, 통 형상 수납 부재로부터 덮개 부재가 떼어내지고 나서 5분 이내에 융해액에 침지하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1분 이내이다. 또 캡 부재로부터 스트립을 갖는 동결 보존용 지그를 빼냄에 있어서, 일단 끼워맞춤이 느슨해지고 나서, 5분 이내에 융해액에 침지하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1분 이내이다. 통 형상 수납 부재로부터 덮개 부재를 떼어내고 나서, 혹은 동결 보존용 지그를 빼낼 때의 캡 부재와의 끼워맞춤이 느슨해지고 나서 등의, 이른바 밀폐 상태가 개방된 기간이 긴 경우, 공기 중의 질소나 산소 등의 기체가, 통 형상 수납 부재 내, 혹은 캡 부재 내에 들어가고, 이어서 냉각되어, 액화되는 경우가 있다. 액화된 기체는 재치부에 부착되어, 융해액 중에 들어가, 융해액의 온도를 내리는 경우가 있다. 융해액의 온도가 내려가면, 융해 속도가 느려져 버려, 바람직하지 않다.
본 발명의 고정구는, 세포 또는 조직의 동결 보존~융해의 일련의 프로세스에서, 세포 또는 조직이 액체 질소에 접촉하는, 이른바 개방형 동결 보존·융해의 프로세스에도 이용할 수 있다. 개방형 프로세스에 있어서도, 동결된 세포 또는 조직을 융해액으로 옮기는 조작에 앞서, 본 발명의 고정구를 이용하여, 동결 보존용 지그를 고정·유지해 두면, 세포 또는 조직을 액체 질소 중으로부터 융해액으로 신속히 옮길 수 있기 때문에 바람직하다.
그런데 상술한, 통 형상의 수납 용기에 동결 보존용 지그 전체를 수납하는 방법에서는, 융해 공정 시에 절단 기구나 취출 기구가 필요해지거나, 수납된 동결 보존용 지그를 취출하는 조작이 번잡해지는 경우가 있었다.
상기한 이유에서, 재치부를 갖는 본체 부재 및 당해 본체 부재에 착탈이 자유로운 캡 부재를 적어도 갖는 동결 보존용 지그가 적합하며, 또 당해 동결 보존용 지그의 재치부에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하고, 당해 재치부를 캡 부재로 밀폐하는 밀폐 공정과, 당해 밀폐한 재치부를 냉각 용매에 의해 냉각하여, 세포 또는 조직을 동결하는 동결 공정과, 당해 동결 공정에 있어서 동결된 세포 또는 조직의 동결 상태를 유지하는 보냉 공정과, 동결 상태가 유지되어 있던 세포 또는 조직을 융해하는 융해 공정을 적어도 갖고, 당해 융해 공정의 개시 전에 있어서, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직을, 상술한 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구가 갖는 고정 구조부에 고정하여, 당해 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 본체 부재와 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태로 일단 유지하고, 당해 융해 공정에서는 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 본체 부재가 갖는 재치부를 융해액에 침지하여 세포 또는 조직을 융해하는 세포 또는 조직의 동결 융해 방법이 바람직하다.
또 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우, 여분의 보존액을 효과적으로 제거할 수 있기 때문에, 높은 조작성이 얻어지는 것에 더하여, 세포 또는 조직의 주위에 존재하는 보존액을 보다 적은 것으로 할 수 있기 때문에, 높은 동결 속도와 융해 속도가 얻어지므로 바람직하다.
본 발명의 동결 융해 방법에서는, 첫째, 상기한 동결 보존용 지그가 갖는 재치부에 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치한다. 이러한 작업은 투과형 현미경 관찰 하(이하, 단순히 현미경 관찰 하라고도 기재)에 있어서 행하는 것이 바람직하다. 이 때, 동결 보존용 지그가 갖는 재치부가 보존액 흡수체를 가지면, 여분의 보존액을 효과적으로 제거할 수 있기 때문에, 높은 조작성이 얻어지는 것에 더하여, 세포 또는 조직의 주위에 존재하는 보존액을 보다 적은 것으로 할 수 있기 때문에, 높은 동결 속도와 융해 속도가 얻어지므로 바람직하다.
이어서, 둘째, 본체 부재의 재치부를 캡 부재에 삽입하여, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한다. 캡 부재에 재치부를 삽입하는 공정은, 현미경 관찰 하에서 행해도 된다. 재치부는, 캡 부재에 삽입 후, 캡 부재로 완전히 피복하고, 캡 부재를 본체 부재의 끼워맞춤 구조부에 끼워맞춤·고정함으로써 완전히 밀폐한다.
이어서, 캡 부재를 액체 질소 등의 냉각 용매에 침지하고, 재치부 상에 재치한 세포 또는 조직을 냉각·동결한다. 이 때, 캡 부재에 의해 피포되어, 완전히 밀폐된 재치부 및 재치부 상의 세포 또는 조직은 냉각 용매와 접촉하지 않고 냉각된다.
세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치부에 재치하고 나서, 밀폐 공정을 거쳐, 캡 부재로 밀폐된 본체 부재를 냉각 용매에 침지할 때까지의 시간은, 1분 이내인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 30초 이내이다.
냉각된 세포 또는 조직은, 그 유리화 동결 상태를 유지한 채로, 냉각 용매 등에 의해 극저온이 유지된 저온 보관 용기 안에서 보냉된다.
본 발명의 동결 융해 방법에서는, 융해 공정에 앞서, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직은, 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 동결 보존용 지그의 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태로 일단 유지된다. 이 때, 캡 부재의 고정 기능을 가진 고정구를 이용하여 동결 보존용 지그를 유지하면, 핸들링성이 향상되어, 바람직하다.
본 발명의 동결 융해 방법에서는, 융해 공정의 개시 전에 있어서, 동결 보존용 지그의 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직의 위치는 냉각 용매 중에 있지만, 본체 부재와 캡 부재의 접합부가 냉각 용매 중에 들어가지 않는 상태로 일단 유지한 후에, 이어서, 본체 부재와 캡 부재의 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하고, 그 후 캡 부재와 본체 부재를 분리한다. 그리고, 재치부를 융해액에 침지하는 융해 공정을 행한다. 융해 공정 전의 이들 조작에 의해, 본체 부재가 갖는 재치부는 액체 질소 등의 냉각 용매에 접촉하는 일 없이, 융해액 중에 신속히 침지할 수 있다. 본체 부재와 캡 부재의 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하고 나서, 재치부를 융해액에 침지할 때까지의 시간은 5분 이내인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 1분 이내이다. 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하여, 밀폐 상태가 개방된 상태가 긴 경우, 질소나 산소 등의 기체가, 캡 부재 내에 들어가고, 이어서 차갑게 되어, 액화되는 경우가 있다. 액화된 기체가 재치부에 부착되어, 융해 공정 시에 융해액 중에 들어가면, 융해액의 온도를 내릴 우려가 있어, 바람직하지 않다.
이상, 본 발명에 있어서의 동결 융해 방법에 대해서 설명했다. 다음에 본 발명에서 이용하는 동결 보존용 지그, 및 본 발명의 고정구에 대해서, 도면을 따라 더욱 상세하게 설명한다.
도 1은, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 1에 나타내는 본체 부재(2)는 재치부(4)를 갖고, 재치부(4)는 파지부(5)에 부설되어 있다. 파지부(5)는, 세포 또는 조직을 재치하는 측을 식별하기 위한 마킹부(6)를 갖는다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 재치부(4)에도 마킹부를 형성해도 된다. 또 본체 부재(2)는, 캡 부재를 본체 부재(2)에 고정하기 위한 끼워맞춤 구조부(7)를 갖는다. 도 1에 있어서, 끼워맞춤 구조부(7)는 테이퍼 구조를 갖고 있다.
본 발명에 있어서 파지부는, 파지의 용이성이나, 조작성의 향상을 목적으로 하여, 각기둥형인 것이 바람직하다. 당해 파지부는, 액체 질소 등의 냉각 용매에 내성이 있는 소재에 의해 형성된 부재인 것이 바람직하다. 이러한 소재로서는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 등의 각종 금속, ABS 수지, 아크릴 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 불소 수지나 각종 엔지니어링 플라스틱, 나아가서는 유리 등을 적합하게 이용할 수 있다.
도 2는, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 2에 나타내는 본체 부재(2)가 갖는 파지부(5)는 그 일부에 오목부를 형성함으로써, 조작자가 본체 부재(2)를 파지했을 때에, 재치부(4)의 표리의 식별, 즉 세포 또는 조직을 재치하는 측의 식별을 용이하게 하고 있다.
도 3은, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 나타내는 측면 단면도이며, 상세하게는, 상술한 본 발명의 고정구가, 고정 구조부로서 (I) 슬릿부의 내부의 측면에 형성된 요철 구조부를 갖는 경우에 적합한 캡 부재의 일례이다. 또 도 3은 캡 부재(3)의 내부 구조를 도시한 것이다. 캡 부재(3)는 그 일단만이 개구된 구조이며, 개구부의 근방에는, 본체 부재와 끼워맞춤하기 위한 끼워맞춤 접촉부(8)가 형성되어 있다. 또 당해 캡 부재(3)는, 융해 공정의 개시 전에 캡 부재(3)를 고정구에 고정하기 위한 고정 부위(9)를 갖는다.
또한 본 발명의 고정구가, 고정 구조부로서, (II) 슬릿부의 내부의 측면간의 거리가, 슬릿부의 안으로 나아갈수록 서서히 좁아진 테이퍼 구조부, 혹은 (III) 슬릿부가 슬릿 개구부로부터 기재의 내부를 향해 직진한 후에, 당해 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 굴곡 구조부를 갖는 경우, 캡 부재(3)는 고정 부위(9)를 갖지 않아도 된다.
도 4는, 본 발명의 고정구로 고정되는 동결 보존용 지그의 캡 부재의 일례를 개구부측에서 본 측면도이다. 도 4에 나타내는 바와 같이 캡 부재(3)는, 사각기둥형의 외형 형상에, 원뿔대의 내면형의 내강(內腔) 형상을 갖고 있다.
도 5는, 본체 부재와 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태의 일례를 나타내는 개략도이다. 또한, 이하의 도면도 포함하여, 캡 부재(3)에 피포되어 있는 재치부(4)의 모습을 알 수 있도록, 캡 부재(3)의 부분은 내부 구조를 도시하고 있다. 도 5에 나타내는 동결 보존용 지그(1)는, 본체 부재(2)가 갖는 본체 부재의 끼워맞춤 구조부(7)와 캡 부재(3)의 끼워맞춤 접촉부(8)에 의해, 캡 부재(3)가 본체 부재(2)에 완전히 끼워맞춤·고정되고, 재치부(4)는, 캡 부재(3)에 의해, 피포·밀폐되어, 보호되어 있다. 캡 부재(3)와 본체 부재(2)의 경계선이 접합부(10)이다.
상기한 통 형상 수납 부재 및 캡 부재는, 예를 들면, 각종 수지, 금속 등의 액체 질소 등의 냉각 용매에 내성이 있는 소재를 이용하여 형성할 수 있다. 캡 부재는 1종류의 소재로 이루어지는 것이어도 되고, 2종류 이상의 소재로 이루어지는 것이어도 된다. 그 중에서도 수지는 사출 성형 등의 프로세스에 의해, 테이퍼 구조나 나사골을 내는 구조를 용이하게 형성할 수 있기 때문에 바람직하다. 수지의 구체예로서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트나 폴리에틸렌나프탈레이트 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아크릴레이트 수지, 폴리염화비닐 수지, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지 등으로 이루어지는 수지를 들 수 있다. 또, 캡 부재의 전체 광선 투과율이 80% 이상이면, 캡 부재를 끼워맞춤 후에, 캡 부재의 내부의 재치부의 모습을 용이하게 확인할 수 있기 때문에 바람직하다.
도 6은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 상태를 나타내는 개략도이다. 본 발명의 동결 융해 방법에 있어서, 조작자는, 본체 부재(2)에 부설된 재치부(4) 상에, 세포(11)와 보존액(12)을 적하 부착하여, 세포(11)를 재치부(4) 상에 재치한다.
도 7은, 동결 보존용 지그에 세포와 보존액을 재치한 후에, 캡 부재를 끼워맞춤·고정한 상태를 나타내는 측면 개략도이다. 본체 부재(2)의 재치부(4) 상에 보존액(12)과 함께, 세포(11)를 적하 부착하여, 재치한 후에, 캡 부재(3)를 본체 부재(2)에 끼워맞춤·고정한다. 이로 인해, 재치부(4) 상에 재치된 세포(11)는, 캡 부재(3)에 의해 완전히 피포·밀폐되어, 외부 환경으로부터 완전히 보호된다.
상기한 본체 부재(2)가 갖는 재치부(4)는, 길쭉한 형상인 것이 바람직하다. 길쭉한 형상이면 재치부를 캡 부재에 의해 피포·보호하는 것이 용이하다. 또 본체 부재(2)가 갖는 재치부(4)의 형상은, 평탄한 평면 시트 형상, 곡률을 갖는 시트 형상, V자형 시트 형상 등으로 할 수 있다. 평탄한 평면 시트 형상은, 세포 또는 조직을 재치부 상에 재치하는 작업에 있어서, 작업성이 높아 바람직하다.
본 발명에 있어서 동결 보존용 지그가 갖는 재치부로서는, 예를 들면, 각종 수지 필름, 금속판, 유리판, 고무판 등을 들 수 있다. 재치부는 1종류의 소재로 이루어지는 것이어도 되고, 2종류 이상의 소재로 이루어지는 것이어도 된다. 그 중에서도 수지 필름은, 취급의 관점에서 적합하게 이용된다. 수지 필름의 구체예로서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트나 폴리에틸렌나프탈레이트 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아크릴레이트 수지, 폴리염화비닐 수지, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지 등으로 이루어지는 수지 필름을 들 수 있다. 또, 재치부의 전체 광선 투과율이 80% 이상이면, 재치부에 재치한 세포 또는 조직을, 투과형 현미경을 이용하여 용이하게 확인할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명에 있어서 동결 보존용 지그가 갖는 재치부로서, 열전도성이 우수하며, 급속한 동결을 가능하게 한다는 관점에서 금속판도 적합하게 이용할 수 있다. 금속판의 구체예로서는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 철, 스테인리스 등을 들 수 있다. 상기한 각종 수지 필름, 금속판, 유리판, 고무판 등의 두께는 10μm~10mm인 것이 바람직하다. 또 목적에 따라, 각종 수지 필름, 금속판, 유리판, 고무판 등의 표면을, 예를 들면 코로나 방전 처리와 같은 전기적인 방법이나, 혹은 화학적인 방법에 의해 친수화할 수도 있으며, 나아가서는 조면화하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 동결 보존용 지그가 갖는 재치부로서 보존액 흡수체를 이용할 수도 있다. 재치부에 보존액 흡수체를 이용하면, 당해 보존액 흡수체에 의해, 여분의 보존액을 효과적으로 제거할 수 있기 때문에, 세포 또는 조직을 재치하여 동결할 때의 조작성이 향상된다.
상기한 보존액 흡수체로서는, 예를 들면 철망, 종이 등이나 합성 수지로 이루어지는 필름 형상물에 관통 구멍을 가진 것이 예시된다. 그 외의 보존액 흡수체로서, 굴절률이 1.45 이하인 소재를 이용하여 형성된 다공질 구조체가 예시된다. 당해 다공질 구조체에 의해, 세포 또는 조직의 주위에 존재하는 보존액을 제거할 수 있다. 또, 투과형 광학 현미경 관찰 하에 있어서, 세포 또는 조직을 재치하여 동결하는 조작 및 동결 후에 융해하는 조작을, 양호한 시인성으로 용이하게 또한 확실하게 행할 수 있다.
상기한 다공질 구조체의 소재의 굴절률은, 예를 들면, 아베 굴절계(Na 광원, 파장：589nm)를 이용하여 JIS K 0062：1992, JIS K 7142：2014에 준하여 측정할 수 있다. 다공질 구조체를 형성하는 굴절률이 1.45 이하인 소재로서는, 폴리테트라플루오로에틸렌 수지, 폴리비닐리덴디플로라이드 수지, 폴리클로로트리플루오로에틸렌 수지 등의 불소 수지나 실리콘 수지와 같은 플라스틱 수지 재료, 이산화규소와 같은 금속 산화물 재료, 불화나트륨, 불화마그네슘, 불화칼슘과 같은 무기 재료를 들 수 있다.
다공질 구조체에 의한 보존액 흡수체의 세공(細孔) 지름은 5.5μm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.0μm 이하, 더 바람직하게는 0.75μm 이하이다. 이로 인해 광학 현미경 관찰 하에 있어서의 세포 또는 조직의 시인성을 높일 수 있다. 보존액 흡수체의 두께는, 10~500μm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 25~150μm이다. 또한, 보존액 흡수체의 세공 지름은, 플라스틱 수지 재료의 다공질 구조체의 경우에는, 버블 포인트 시험에 의해 측정되는 가장 큰 세공의 직경이다. 또 금속 산화물 혹은 무기 재료의 다공질 구조체의 경우에는, 당해 다공질 구조체의 표면 및 단면의 화상 관찰로부터 측정한 평균 세공 직경이다.
보존액 흡수체의 공극률은 30% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 70% 이상이다. 공극률이란, 이하의 식으로 정의된다. 여기서 공극 용량 V는 수은 포로시미터(측정기 명칭 Autopore II 9220 제조자 micromeritics instrument corporation)를 이용하여 측정·처리된, 보존액 흡수체에 있어서의 세공 반경 3nm에서 400nm까지의 누적 세공 용적(ml/g)에, 보존액 흡수체의 건조 고형분량(g/평방미터)을 곱함으로써, 단위면적(평방미터)당 수치로서 구할 수 있다. 또 보존액 흡수체의 두께 T는 보존액 흡수체의 단면을 전자 현미경으로 촬영하여 측정함으로써 얻을 수 있다.
P=(V/T)×100(%)
P：공극률(%)
V：공극 용량(ml/m2)
T：두께(μm)
도 8은, 본 발명의 고정구의 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 8에 있어서 고정구(13)는, 기재(25)의 상면에 동결 보존용 지그가 삽입되는 슬릿부(14)를 1개소 갖고 있다. 슬릿부(14)는 한쪽이 기재(25)의 측면부에 슬릿 개구부(16)를 갖고 있으며, 다른 한쪽은 도면 중의 상면의 중앙부측에서 폐색되어 있다. 도시하지 않은 동결 보존용 지그를 슬릿부(14)에 삽입할 때에는, 동결 보존용 지그를 슬릿 개구부(16)측으로부터 슬릿부(14)를 따라 도면 중의 상면의 중앙부를 향해 삽입한다.
도 8에 나타내는 T1은 고정구(13)의 슬릿부(14)의 길이(안쪽 길이)를 나타낸다. T1은, 동결 보존용 지그를 삽입 후에 유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 상술한 크라이오탑법에 의해 세포 또는 조직을 동결 및 융해하는 경우, T1은 3~50mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5~40mm이다. 또한 이하의 설명에 있어서 기재하는, 고정구(13)의 각 치수는 모두, 크라이오탑법에 의한 동결 및 융해 작업을 의도한 치수이다.
도 8에 나타내는 T2는 슬릿부(14)의 폭방향의 길이를 나타낸다. 본 발명에 있어서 T2는 동결 보존용 지그를 삽입하여, 고정·유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 1~10mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2~5mm이다.
도 9는, 본 발명의 고정구의 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 9에 있어서, 고정구(13)는, 기재(25)의 상면에 동결 보존용 지그가 삽입되는 홈 형상 구조인 슬릿부(14)를 1개소 갖고 있다. 슬릿부(14)는 한쪽이 기재(25)의 측면부에 슬릿 개구부(16)에서 개구되어 있으며, 다른 한쪽은 상면의 중앙부측에서 폐색되어 있다. 그리고, 슬릿부(14)는 동결 보존용 지그를 고정하기 위해, 그 내부의 측면에 요철 구조부(15)를 갖는다. 이와 같은 구조이면, 슬릿 개구부(16)로부터 도시하지 않은 캡 부재(3)를 삽입하고, 폐색부를 향해 슬라이드시키면서 꽂아, 폐색된 끝단에서 캡 부재(3)를 확실하게 고정할 수 있다. 또한, 도 9에는 볼록형 요철 구조부를 도시하고 있다. 도시하지 않은 동결 보존용 지그를 슬릿부(14)에 삽입할 때에는, 동결 보존용 지그를 슬릿 개구부(16)측으로부터 슬릿부(14)를 따라 기재 상면의 중앙부를 향해 삽입한다.
도 9에 나타내는 T1은 고정구(13)의 슬릿부(14)의 길이(안쪽 길이)를 나타낸다. T1은, 동결 보존용 지그를 삽입 후에 유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 상술한 바와 같이 T1은 3~50mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5~40mm이다.
도 9에 나타내는 T2는, 슬릿부(14)의 폭방향의 길이를 나타낸다. 본 발명에 있어서 T2는 동결 보존용 지그를 삽입하여, 고정·유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 1~10mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2~5mm이다.
도 9에 나타내는 T4는, 고정구(13)의 슬릿부(14)가 갖는 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이를 나타낸다. 본 발명에 있어서 T4는, 도시하지 않은 동결 보존용 지그를 고정·유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 0.5~5mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.5~4mm이다.
도 10은, 본 발명의 고정구(도 9의 고정구)가 갖는 요철 구조부의 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 10에 있어서 고정구(13)는, 기재(25)의 상면(윗면)에 동결 보존용 지그가 삽입되는 슬릿부(14)를 갖고, 슬릿부(14)는 동결 보존용 지그를 고정하기 위해, 그 내부의 측면에 요철 구조부(15)를 갖는다. 도 10의 고정구가 갖는 요철 구조부(15)는, 볼록형 구조이다. 도 9와 마찬가지로, 슬릿부(14)의 폭방향의 길이를 T2로 하고, 슬릿부(14)가 갖는 볼록형 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이를 T4로 하여 각각 나타냈다.
도 10에 나타내는 T3은, 고정구(13)의 슬릿부(14)의 깊이 방향의 길이를 나타낸다. 본 발명에 있어서 T3은, 도시하지 않은 동결 보존용 지그를 고정·유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 3~50mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5~20mm이다.
도 11은, 본 발명의 고정구가 갖는 요철 구조부의 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 11에 있어서 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 고정하기 위해, 슬릿부(14)의 내부의 한쪽의 측면에만, 볼록형 구조의 요철 구조부(15)를 1개소 갖는다. 도 11에 나타내는 T6은, 1개소의 볼록형 구조의 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 길이를 나타낸다. 이러한 형상의 고정구를 이용하면, 동결 보존용 지그를 고정구의 슬릿부(14)를 따라 삽입할 때의 작업이 용이하다. 또한, 도 10 및 도 11에 있어서는 기재 측면의 형상만을 나타내고 있으며, 슬릿부의 내부에 보이는 폐색면 등은 생략하고 있다.
도 12는, 본 발명의 고정구가 갖는 요철 구조부의 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 12에 있어서 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 고정하기 위해, 그 내부의 측면에 요철 구조부(15)를 갖는다. 도 12의 고정구가 갖는 요철 구조부(15)는 오목형이다.
도 12에 나타내는 T5는, 슬릿부(14)가 갖는 오목형 요철 구조부(15)에 의해 확장된 슬릿부의 폭방향의 길이를 나타낸다. 길이 T5는, 도시하지 않은 동결 보존용 지그를 고정·유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한되지 않지만, 2~11mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2.5~5.5mm이다. 도 12에 나타내는 바와 같이, 오목형 요철 구조부(15)를 갖는 경우, 오목형 요철 구조부(15)에 의해 확장된 폭방향의 길이 T5는, 상술한 슬릿부(14)의 폭방향의 길이 T2보다 커진다.
또한 본 발명에 있어서 슬릿부(14)가 갖는 요철 구조부로서는, 예를 들면 도 10에 나타낸 요철 구조부(슬릿부(14)의 내부의 양면에 볼록부가 형성된 볼록형 요철 구조부)를 복수 개소 가져도 되고, 혹은 도 12에 나타낸 요철 구조부(슬릿부(14)의 내부의 양면에 오목부가 형성된 오목형 요철 구조부)를 복수 개소 가져도 되며, 나아가서는 상기한 볼록형과 오목형 요철 구조부를 함께 갖는 것도 가능하다.
도 13은, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 13에 있어서 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 강고하게 고정하기 위한 고정 구조부로서, 테이퍼 구조부 및 요철 구조부를 갖는다.
도 13에 있어서, 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)의 폭방향의 길이 T2는, 슬릿 개구부(16)로부터 삽입 방향으로 나아감에 따라, 서서히 감소하는 구조로 되어 있다. 한편, 슬릿부(14)의 내부의 양측면에 형성된 볼록형 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 폭 T4는 일정하다. 도 13에 나타내는 고정구(13)를 이용하면 요철 구조부(15)를 따라 삽입된 동결 보존용 지그는, 요철 구조부(15)에 더하여, 안으로 삽입할수록 폭이 좁아지는 슬릿부(14)의 벽면에 의해서도 고정된다는 점에서, 보다 강고한 고정·유지가 가능해진다.
도 14는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 14에 있어서, 고정구(13)는, 요철 구조부(15)와 함께, 도중에 90도 구부러진 형상의 슬릿부(14)를 갖는다. 이러한 형상의 고정구를 이용하면, 슬릿 개구부(16)로부터 동결 보존용 지그를 슬릿부(14)에 삽입하고, 90도 구부러진 곳까지 동결 보존용 지그를 밀어 넣음으로써, 고정·유지한 동결 보존용 지그가 슬릿 개구부(16)로부터 갑자기 탈락하는 것을 방지할 수 있으므로 바람직하다.
도 15는, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 15에 있어서 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 강고하게 고정하기 위한 고정 구조부로서, 테이퍼 구조부를 갖는다.
도 15에 있어서, T21은 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내고, T22는 슬릿 개구부로부터 가장 떨어진 테이퍼 구조부의 폭을 나타내며, T11은 테이퍼 구조부의 안쪽 길이를 나타낸다.
도 15의 고정구(13)가 갖는 테이퍼 구조부는, 슬릿 개구부(16)로부터 기재(25)의 중앙부측을 향해, 슬릿부(14)의 측면간의 거리가 서서히 감쇠된 구조이며, 즉, T21＞T22이다. 도 15에 나타내는 고정구와 같이, 슬릿부(14)가 테이퍼 구조부를 갖는 경우, 슬릿 개구부(16)로부터 슬릿부(14)를 따라 삽입한 동결 보존용 지그를 강고하게 고정할 수 있어 바람직하다. 또 (T21-T22)/T11의 값이 0.03 이하인 경우, 동결 보존용 지그를 강고하게 유지하는 것이 가능하며, 또한 동결된 세포 또는 조직을 보온된 융해액 중에 신속히 옮기는 것이 가능해지기 때문에 바람직하다. 또한 상기한 (T21-T22)/T11의 값이 0.001 이상인 것은, 동결 보존용 지그의 고정 안정성의 관점에서 바람직하다.
또 도 15의 고정구(13)는, 슬릿부(14)가 테이퍼 구조부만으로 구성되는 예이기도 하다. 따라서 도 15에서는, 슬릿부의 폭(T2)은 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분의 테이퍼 구조부의 폭(T21)과 동일하고, 마찬가지로 슬릿부의 안쪽 길이(T1)는 테이퍼 구조부의 안쪽 길이(T11)와 동일하다.
도 16은, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 16에 있어서, 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 강고하게 고정하기 위한 고정 구조부로서, 굴곡 구조부를 갖는다. 굴곡 구조부를 갖는 도 16의 고정구의 슬릿부(14)는, 슬릿 개구부(16)로부터 기재(25)의 중앙부측을 향해, 일정 거리 직진한 후에, 도중에 90도 굴곡된 형상이다. 슬릿부가 굴곡된 형상의 고정구를 이용하면, 고정·유지한 동결 보존용 지그가 슬릿 개구부(16)로부터 갑자기 탈락하는 것을 방지할 수 있어 바람직하다.
도 17은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 17에 있어서 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 고정 구조부로서, 굴곡 구조를 갖는 슬릿부와, 당해 슬릿부의 안쪽에 테이퍼 구조부를 갖는다. 도 17의 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 슬릿 개구부(16)로부터 기재(25)의 중앙부측을 향해, 일정 거리(T1A) 직진하고, 도중에 도면 중의 우측으로 90도 굴곡된 형상을 갖고, 또 우측으로 90도 굴곡된 후에 테이퍼 구조를 갖는다. 또 도 17에 있어서, 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분의 테이퍼 구조부의 폭(T21)과, 슬릿 개구부로부터 가장 떨어진 테이퍼 구조부의 폭(T22)의 관계는, T21＞T22이다.
또, 도 17에 있어서, T1B는, 슬릿부(14)가 90도 굴곡된 지점으로부터, 슬릿 개구부(16)로부터 가장 떨어진 지점까지의 거리이다.
도 17의 형상을 갖는 고정구를 이용하는 경우, 슬릿 개구부(16)로부터 동결 보존용 지그를 슬릿부(14)에 삽입하여, 90도 굴곡된 위치를 통과시키고, 슬릿부의 폐색면 방향으로 동결 보존용 지그를 더 삽입시켜, 테이퍼 구조에 의해 고정할 수 있다. 고정 구조부로서, 굴곡 구조부와 테이퍼 구조부를 둘 다 가짐으로써, 동결 보존용 지그가 테이퍼 구조부로부터 벗어났을 때에도, 당해 동결 보존용 지그를 굴곡 구조부에 의해 유지하는 것이 가능해져 바람직하다.
도 18은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 18에 있어서, 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 고정 구조부로서, 굴곡 구조부와 테이퍼 구조부를 둘 다 갖는다. 도 18에 나타내는 고정구는 테이퍼를 가진 안내부와, 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 테이퍼 구조부를 갖는다. 이러한 경우, 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분의 테이퍼 구조부의 폭(T21)과, 슬릿 개구부로부터 가장 떨어진 테이퍼 구조부의 폭(T22)의 관계(T21＞T22)를 만족하는 테이퍼 구조부는, 당해 슬릿부의 안쪽에 위치하는 것이 바람직하고, 이 경우, 동결 보존용 지그를 강고하게 고정·유지함과 더불어, 실질 고정하는 테이퍼 구조부에 삽입할 때의 작업성을 양호하게 하는 것이 가능해져 바람직하다.
도 19는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 19에 있어서, 고정구(13)는, 기재(25)의 상면(윗면)에, 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부(26)를 갖고, 당해 삽입부(26)의 측면부에 슬릿 개구부(16)를 갖는다. 도 19와 같은 고정구에서는, 기재의 측면부에 개구부를 갖지 않기 때문에, 고정·유지한 동결 보존용 지그의 갑작스러운 탈락이 발생하기 어려운 구조로 되어 있다.
도 20은 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 20에 있어서 고정구(13)는, 기재(25)의 상면에 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부(26)와 당해 삽입부(26)의 측면에 한쪽 끝이 개구된 슬릿부(14)를 갖고, 당해 슬릿부(14)는 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 테이퍼 구조부를 갖는다. 이러한 형상의 고정구를 이용하면, 테이퍼 구조부에 의해 동결 보존용 지그를 강고하게 고정할 수 있으며, 또 고정·유지한 동결 보존용 지그가 슬릿 개구부로부터 탈락한 경우여도, 당해 동결 보존용 지그가 삽입부(26)에 머무는 것이 가능해져, 바람직하다.
도 21은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 21에 있어서, 고정구(13)가 갖는 슬릿 개구부(16)는, 슬릿부(14)의 폭보다 넓게 개구되어 있기 때문에, 동결 보존용 지그를 삽입할 때의 작업성이 우수하다. 도 21에는, 기재(25)의 상면(윗면)에 부설된 사각기둥 형상의 액면 게이지부(21)를 나타내고 있다.
도 22는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 22에 있어서, 고정구(13)는, 1개의 슬릿부(14)에 대해, 슬릿 개구부를 2개소(슬릿 개구부(16) 및 슬릿 개구부(16＇)) 갖는다. 또, 개개의 슬릿 개구부로부터 기재(25)의 중앙부측을 향해, 슬릿부(14)의 홈의 폭이 감쇠된 테이퍼 구조부를 갖는다. 도 22와 같은 형상이면, 도시하지 않은 동결 보존용 지그를 슬릿부(14)의 양단 어느 쪽에서도 삽입할 수 있기 때문에, 복수의 동결 보존용 지그를 동시에 보존 가능한 고정구가 얻어진다. 또, 고정된 동결 보존용 지그는, 슬릿부(14)가 폐색되어 있는 경우와 비교하여, 보다 많은 면적에서 냉각 용매에 접촉하기 때문에, 보다 효율적인 냉각이 이루어지는 것을 기대할 수 있다.
슬릿부(14)의 길이 T1은, 슬릿 개구부(16)에 있어서의 테이퍼 구조부의 안쪽 길이 T11과 슬릿 개구부(16＇)에 있어서의 테이퍼 구조부의 안쪽 길이 T11＇의 합계이다.
도 22에 나타낸 고정구에 있어서, 2개소에 형성된 슬릿 개구부의 형상(슬릿 개구부(16)에 있어서의 (T21-T22)/T11의 값과, 슬릿 개구부(16＇)에 있어서의 (T21＇-T22＇)/T11＇의 값)은, 같아도 되고 상이해도 되지만, 같은 것이 바람직하다.
상술한 도 22는, 1개의 슬릿부에 대해 슬릿 개구부를 2개소에 형성한 일례인데, 이 이외에도, 예를 들면 기재의 상면의, 각각 상이한 측면부에 슬릿 개구부를 갖는 슬릿부(각각 독립적인 슬릿부)를 형성하는 것(후술하는 도 29), 및 기재의 상면의, 동일한 측면부에 복수의 슬릿 개구부를 갖는 슬릿부(각각 독립적인 슬릿부)를 형성하는 것도 가능하다.
도 23은, 본 발명의 고정구가 갖는 슬릿부의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 23에 있어서 고정구(13)가 갖는 슬릿부(14)는, 동결 보존용 지그를 강고하게 고정하기 위한 고정 구조부로서, 그 내부의 측면에 요철 구조부(15)를 갖는다. 도 23의 고정구가 갖는 요철 구조부(15)는 볼록형이다(이러한 요철 구조부는 오목형인 것도 가능하다). 또 당해 동결 보존용 지그는 기재(25)의 상면(윗면)에 액면 게이지부(21)를 갖고 있다.
도 24는, 본 발명의 고정구의 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 24의 고정구(13)는 슬릿부(14)와 함께, 기재(25)의 측면에 부설되어, 당해 기재의 상면(윗면)보다 상방으로 신장된 구조인 액면 게이지부(21)를 갖는다.
도 25는, 본 발명의 고정구의 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 25의 고정구(13)는 슬릿부(14)와 함께, 기재(25)의 상면(윗면)에 부설된 사각기둥 형상의 액면 게이지부(21)를 갖는다. 도 25의 고정구(13)가 갖는 액면 게이지부(21)는 1개소의 마킹부를 갖고, 도 25에 도시하고 있는 마킹부는 상한 마킹부(22)이다. 상한 마킹부(22)는 도시하지 않은 액체 질소의 액면에 평행한 선분이다. 작업자는 이 위치를 기준으로 하여 액체 질소의 양을 관리함으로써, 동결된 세포 또는 조직이 확실하게 냉각되고 있는 것을 용이하게 확인할 수 있다.
도 26은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 26의 고정구(13)는 슬릿부(14)와 함께, 기재(25)의 상면(윗면)에 부설된 사각기둥 형상의 액면 게이지부(21)를 갖는다. 도 26의 고정구(13)가 갖는 액면 게이지부(21)는 상한 마킹부(22) 및 하한 마킹부(23)의 합계 2개소의 마킹부를 갖는다. 고정구(13)가 상한 마킹부(22) 및 하한 마킹부(23)를 가지면, 예를 들면 작업자는 상한 마킹부(22)와 하한 마킹부(23) 사이에, 액체 질소의 액면을 설정·준비하면 되고, 액체 질소의 양의 관리가 더 용이하다.
도 27은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 27의 고정구(13)는 슬릿부(14)와 함께, 기재(25)의 상면(윗면)에 부설된 사각기둥 형상의 액면 게이지부(21)를 갖는다. 도 27의 고정구(13)가 갖는 액면 게이지부(21)는 볼록 형상의 상한 마킹부(22) 및 볼록 형상의 하한 마킹부(23)를 갖고, 작업자는 볼록 형상의 상한 마킹부(22)와 볼록 형상의 하한 마킹부(23) 사이에, 액체 질소의 액면을 설정·준비할 수 있다.
도 28은, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 28의 고정구(13)는 슬릿부(14)와 함께, 기재(25)의 상면(윗면)에 부설된 계단 형의 단차를 갖는 입체 형상의 액면 게이지부(21)를 갖는다. 상술한 마킹부와 마찬가지로, 작업자는 계단형의 단차에 의한 상한 마킹부(22)와 하한 마킹부(23) 사이에, 액체 질소의 액면을 설정·준비할 수 있다.
도 29는, 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 상면 개략도이다. 도 29에 있어서, 고정구(13)는, 기재(25)의 상면에, 복수의 독립적인 슬릿부(14)를 갖는다. 슬릿부(14)는, 각각, 동결 보존용 지그를 고정하는 것이 가능하다. 본 실시 형태에 의하면, 기재(25)의 상면에 보다 많은 슬릿부(14)가 형성되어 있기 때문에, 한 번에 수많은 동결 보존용 지그를 고정·유지할 수 있다.
도 30은 본 발명의 고정구의 또 다른 일례를 나타내는 측면 개략도이다. 도 30에 있어서, 고정구(13)는 공동(空洞) 구조부(17)를 갖는다. 공동 구조부(17)를 가지면, 고정구(13)가 갖는 열적인 용량이 억제되어, 고정구(13)를 액체 질소에 침지했을 때에, 액체 질소의 휘발량이 억제되기 때문에 바람직하다.
다음에, 본 발명의 고정구를 이용한, 세포 또는 조직의 동결, 융해 방법으로 대해서, 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서, 재치부를 갖는 본체 부재 및 당해 본체 부재에 착탈이 자유로운 캡 부재를 적어도 갖는 동결 보존용 지그의 재치부에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하고, 당해 재치부를 캡 부재로 밀폐한 후, 당해 밀폐한 재치부를 냉각 용매에 의해 냉각하여, 동결된 세포 또는 조직의 동결 상태를 유지하고, 그 후, 당해 세포 또는 조직을 융해할 때에 있어서는, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직은, 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치시키며, 또한 본체 부재와 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태로 일단 유지하는 것은, 본체 부재와 캡 부재를 재빠르게 분리하여, 재치부를 융해액 중에 신속히 침지할 수 있기 때문에, 바람직하다.
도 31은, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 개략도이다. 도 31에 있어서 동결 보존용 지그는, 본체 부재(2)와 당해 본체 부재(2)에 착탈이 자유로운 캡 부재(3)를 적어도 갖고, 본체 부재(2)가 갖는 재치부(4)에, 극소량의 보존액(12)과 함께 세포(11)가 재치되어 있다.
극소량의 보존액(12)과 함께 세포(11)가 재치된 재치부(4)는, 캡 부재(3)로 밀폐되어 있으며, 당해 재치부(4)에 재치된 세포(11)는 액체 질소(18)의 액면(19)보다 하방에 위치함으로써 냉각되고, 동결된 세포(11)는 동결 상태가 유지되어 있다. 동결된 세포(11)를 융해할 때에는, 캡 부재(3)와 본체 부재(2)의 접합부(10)가, 액체 질소(18)의 액면(19)보다 상방에 위치하기 때문에, 본체 부재(2)와 캡 부재(3)의 끼워맞춤·고정을 느슨하게 하여, 끼워맞춤을 해제한 경우에도, 주위의 냉각 용매(액체 질소)가 직접적으로 캡 부재(3)의 내부에 침입하지 않고 본체 부재(2)를 캡 부재(3)로부터 재빠르게 빼내, 분리하는 것이 가능하고, 재치부를 융해액 중에 신속히 침지할 수 있기 때문에 바람직하다. 또 고정구(13)가 액면 게이지부(21)를 갖는 경우, 액면(19)의 위치를 작업자는 파악하기 쉬워, 작업성이 향상될 수 있으므로 바람직하다. 도 31에는, 고정구(13)의 상면(윗면)에 부설한 액면 게이지부(21)의 상면을 액면(19)의 위치의 기준으로 한 경우의 일례를 도시하고 있다. 액면 게이지부(21)를 이용하면, 액면(19)을 세포(11)보다 상방에 위치시키며, 또한, 액면(19)을 접합부(10)보다 하방에 위치시키는 것이 용이하다.
도 32는, 융해 공정의 개시 전에, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태를 나타내는 다른 개략도이다. 앞선 도 31에서는 요철 구조부를 갖는 고정구(13)에 의해, 동결 보존용 지그를 고정하고 있었는데, 도 32는 도시하지 않은 테이퍼 구조부를 갖는 고정구(13)에 의해, 동결 보존용 지그를 고정한 상태를 나타내고 있다.
도 33은, 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 재치부를 융해액에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다. 도 33에 있어서, 캡 부재(3)가 고정구(13)에 고정됨으로써, 본체 부재(2)를 빼내는 조작만으로, 재치부(4)를 갖는 본체 부재(2)는 캡 부재(3)로부터 신속히 분리된다. 분리 후, 재치부(4)를 융해액(24)에 침지하여, 융해액(24) 중에서 세포(11)를 융해·회수한다.
본 발명의 고정구를 이용하여 세포 또는 조직을 융해하는 경우, 보존액은, 통상 난자, 배 등의 세포의 동결을 위해 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 상술한 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제(글리세롤, 에틸렌글리콜 등)를 함유하는 보존액이나, 글리세롤이나 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸술폭시드) 등의 각종 내동제를 다량으로(적어도 보존액의 전체 질량에 대해 10질량% 이상, 보다 바람직하게는 20질량% 이상) 함유하는 보존액을 사용할 수 있다. 융해액에 대해서도, 통상 난자, 배 등의 세포의 융해를 위해 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 상술한 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에, 침투압 조정을 위해 1M의 수크로스를 함유하는 융해액을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 동결 보존 및 융해되는 세포로서는, 예를 들면, 포유류(예를 들면, 인간(사람), 소, 돼지, 말, 토끼, 래트, 마우스 등)의 난자, 배, 정자 등의 생식 세포; 인공 다능성 간세포(iPS 세포), 배성 간세포(ES 세포) 등의 다능성 간세포를 들 수 있다. 또, 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 세포주 세포 등의 배양 세포를 들 수 있다. 또, 세포는, 1 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 섬유아세포, 췌장암·간암 세포 등의 암 유래 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 임파관 내피 세포, 신경 세포, 연골 세포, 조직 간세포, 및 면역 세포 등의 접착성 세포를 들 수 있다. 또한, 동결 보존·융해할 수 있는 조직으로서, 동종 또는 이종(異種)의 세포로 이루어지는 조직, 예를 들면, 난소, 피부, 각막 상피, 치근막, 심근 등의 조직을 들 수 있다.
[실시예]
이하에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
하기, 동결 보존용 지그를 이용하여, 이하의 순서로 세포 또는 조직의 재치에서부터 밀폐 공정, 동결 공정, 보냉 공정, 융해 공정을 행했다.
＜동결 보존용 지그의 제작＞
도 1~도 4에 나타내는 형태를 갖는 본체 부재(2) 및 캡 부재(3)를 제작했다. 본체 부재(2)가 갖는 재치부(4)는 길쭉한 형상(폭 1.5mm, 길이 20mm, 두께 250μm)의 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지 필름을 이용하고, ABS 수지로 이루어지는 파지부(5)에 부설했다. 캡 부재(3)는, ABS 수지로 이루어지고, 도 3 및 도 4에 나타낸 형상을 갖고 있으며, 내부 구조의 일부인 끼워맞춤 접촉부(8)에는 테이퍼 구조를 갖고 있다. 캡 부재(3)의 개구부는 원형이며 직경은 2mm이다. 캡 부재(3)의 외형은 3.1mm의 사각기둥이며, 선단부 근처에 0.3mm의 깊이의 오목부를 갖는 구조이다.
＜세포 또는 조직의 재치에서부터 밀폐 공정, 동결 공정, 보냉 공정＞
평형화 처리한 마우스(8) 세포기배를, 피펫을 이용하여, 보존액과 함께 동결 보존용 지그의 재치부(4) 상에 적하 부착시키고, 여분의 보존액을 제거한 후에, 투과형 현미경 관찰 하에서, 재치부(4)를 캡 부재(3)에 삽입하여, 끼워맞춤·고정했다(밀폐 공정：도 7의 상태). 그 후, 동결 보존용 지그(1)의 캡 부재측을 액체 질소에 침지했다(동결 공정). 또한, 보존액은, L-글루타민, 페놀 레드, 25mM의 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)를 포함하는 시판의 Medium199 배지(Life Technologies사)를 기초액으로 하여, 에틸렌글리콜을 15용량%와 DMSO(디메틸술폭시드)를 15용량%, 수크로스를 0.5M, 겐타마이신을 50mg/L 함유하는 것을 사용했다. 마우스(8) 세포기배를 평형화액에서 보존액으로 옮긴 시점으로부터, 액체 질소에 침지할 때까지의 시간은, 1분간으로 행했다. 동결 공정을 행한 동결 보존용 지그는, 융해 공정을 행할 때까지, 액체 질소 하에서 보관했다(보냉 공정).
＜융해 공정＞
상기의 각 공정을 행한 동결 보존용 지그를 취출하여, 도 31에 나타내는 형태로, 알루미늄으로 이루어지는 고정구(13)의 슬릿부에 고정하고, 동결 보존용 지그의 캡 부재(3)의 접합부(10)가 냉각 용매인 액체 질소(18)의 액면(19)보다 위에 위치하는 상태로 일단 유지했다. 이어서, 캡 부재(3)와 파지부(5)의 끼워맞춤을 느슨하게 하여, 캡 부재(3)로부터 본체 부재(2)를 분리하고, 본체 부재(2)가 갖는 재치부(4)를 37℃로 보온한 융해액에 침지했다. 그 후, 재치부(4) 상으로부터의 배의 회수 조작을 행했다. 또한, 캡 부재(3)의 끼워맞춤을 느슨하게 하고 나서, 캡 부재(3)로부터 본체 부재(2)를 분리할 때까지의 작업은 10초 이내로, 캡 부재(3)로부터 본체 부재(2)를 분리 후, 재치부(4)를 융해액에 침지할 때까지의 시간은, 1초 이내로 조작하는 것이 가능했다. 또한, 융해액은, 상기 Medium199 배지를 기초액으로 하여, 1M의 수크로스를 함유하는 것을 사용했다.
(실시예 2)
폴리에틸렌테레프탈레이트 수지 필름(폭 1.5mm, 길이 20mm, 두께 180μm)에, 그 길이 방향의 양단 2mm에 폴리우레탄 접착재를 도포하고, 그 후, 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 수지로 이루어지는 다공성 수지 시트(세공 지름 0.2μm, 공극률 71%, 두께 30μm)를 이것에 붙여, 이를 동결 보존용 지그의 재치부(4)로 한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, 동결한 마우스(8) 세포기배에 대한 일련의 동결 융해 방법을 행했다. 또한, 실시예 2의 동결 융해 방법에서는, 세포 또는 조직을 재치할 때에, 배를 적하 부착할 때에 여분의 보존액이 자동적으로 제거된다는 점에서, 피펫을 이용하여 보존액을 제거하는 조작은 행하지 않았다.
(비교예 1)
실시예 1에 있어서, 마우스(8) 세포기배를 재치부(4) 상에 적하 부착한 후에, 캡 부재(3)로 피포하지 않고, 재치부(4)를 액체 질소에 직접 침지하고, 그 후, 액체 질소 중에서 재치부(4)를 캡 부재(3)로 피포·보호하여, 동결한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 비교예 1의 동결 융해 방법을 행했다.
(비교예 2)
실시예 2에 있어서, 마우스(8) 세포기배를 재치부(4) 상에 적하 부착한 후에, 캡 부재(3)로 피포하지 않고, 재치부(4)를 액체 질소에 직접 침지하고, 그 후, 액체 질소 중에서 재치부(4)를 캡 부재(3)로 피포·보호하여, 동결한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여 비교예 2의 동결 융해 방법을 행했다.
(비교예 3)
실시예 1의 융해 공정에 있어서, 동결 보존용 지그의 캡 부재(3)의 접합부(10)가 액체 질소 중에 들어간 상태(접합부(10)가 액체 질소의 액면보다 아래에 위치하는 상태)에서, 캡 부재(3)와 파지부(5)의 끼워맞춤을 느슨하게 하여, 캡 부재(3)로부터 본체 부재(2)를 분리하고, 본체 부재(2)가 갖는 재치부(4)를 37℃로 보온한 융해액에 침지했다.
＜융해 공정 시의 기포 부착의 평가＞
실시예 1, 2 및 비교예 1~3의 동결 보존용 지그에 대해서, 융해 공정 시에, 재치부를 융해액에 침지하고 나서 5초 후의 시점에서의 재치부 상에 대한 기포의 부착의 모습을 평가했다. 평가로서, 선단으로부터 2mm~선단으로부터 7mm의 영역(폭 1.5mm×길이 5mm의 면적)에서의, 재치부(4) 표면에 대한 기포(직경 30μm 이상)의 부착수를 계측했다. 각각의 동결 융해 방법에 있어서, 평가는 3회 반복하여 행했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
상기의 결과로부터, 본 발명의 동결 융해 방법을 이용하면, 융해 조작을 행할 때에 재치부 상에 대한 기포의 부착, 및 세포 또는 조직에 대한 기포의 부착을 억제할 수 있어, 세포 또는 조직의 회수 조작이 용이하다는 것을 알 수 있다. 또, 세포 또는 조직의 융해가 극히 단시간에 행하는 것이 가능하고, 높은 생존율이 얻어지는 것이 기대된다.
이하, 상기 융해 공정에 있어서 이용한 고정구에 대해서, 상세하게 검토를 행했다.
(실시예 3)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해, 도 9 및 도 10에 나타내는, 1개소의 슬릿부(14)에 볼록형 요철 구조부(15)를 갖는 형태의 실시예 3의 고정구를 제작했다. 또한, 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 슬릿부(14)의 폭 T2는 3.2mm이며, 슬릿부(14)의 길이 T1은 기재(25)의 측면부로부터 10mm이고, 슬릿부의 깊이 T3은 10mm이다. 요철 구조부는 슬릿부의 내부의 측면으로부터 각각 0.25mm인 볼록형 구조로 하고, 볼록형 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이 T4는 2.7mm이다.
(실시예 4)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해 도 13에 나타내는, 1개소의 슬릿부(14)에 볼록형 구조를 요철 구조부(15)로서 갖고, 슬릿 개구부로부터 삽입 방향으로 나아갈수록, 슬릿부(14)의 폭 T2가 서서히 좁아진 구조로 되어 있는 형태의 실시예 4의 고정구를 제작했다. 또한, 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 슬릿부(14)의 길이 T1은 기재(25)의 측면부로부터 10mm이며, 슬릿부(14)의 깊이 T3은 10mm이다. 슬릿부의 폭 T2는 슬릿 개구부(16)에서 4mm이며, 슬릿 개구부(16)로부터 삽입 방향을 향해, 기재 상면 중앙부측의 슬릿부(14)의 폐색부에서 3mm까지 일정하게 감소하는 구조로 했다. 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이 T4는 2.7mm로 일정하게 했다.
(실시예 5)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해, 도 11에 나타내는, 슬릿부의 내부의 한쪽의 측면에만 볼록형 구조의 요철 구조부(15)를 갖는 형태의 실시예 5의 고정구를 제작했다. 또한, 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 슬릿부의 폭 T2는 3.2mm이며, 슬릿부의 길이 T1은 기재(25)의 측면부로부터 10mm이고, 슬릿부의 깊이 T3은 10mm이다. 요철 구조부(15)는 슬릿부의 내부의 측면에서 0.25mm인 볼록형 구조이며, 1개소의 볼록형 구조의 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 길이 T6은 2.95mm이다.
(실시예 6)
ABS 수지를 이용하여 적층형 3D 프린터로 가공을 행한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 실시예 6의 고정구를 제작했다.
(실시예 7)
ABS 수지를 이용하여 적층형 3D 프린터로 가공을 행하여, 도 14에 나타내는 형태의 굴곡 구조부를 갖고, 또한 슬릿부의 내부의 측면에 볼록형 요철 구조부(15)를 갖는 실시예 7의 고정구를 제작했다. 또한, 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 슬릿부(14)의 폭 T2는 3.2mm이며, 슬릿부의 깊이 T3은 10mm이다. 슬릿부(14)의 길이는 삽입 방향으로부터 20mm 직진한 후에 90도 우측으로 방향을 바꾸어 10mm 직진한 형태로 했다. 요철 구조부(15)는 슬릿부(14)의 내부의 측면으로부터 각각 0.25mm인 볼록형 구조로 하고, 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이 T4는 2.7mm이다.
(실시예 8)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해, 도 23에 나타내는, 1개소의 슬릿부(14) 및 상면에 부설된 사각기둥 형상의 액면 게이지부(21)를 갖는 형태의 실시예 8의 고정구를 제작했다. 또한, 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 슬릿부(14)의 폭 T2는 3.2mm이며, 슬릿부(14)의 길이 T1은 기재(25)의 측면부로부터 30mm이고, 슬릿부(14)의 깊이 T3은 30mm이다. 상기 기재(25)의 상면(윗면)에 액면 게이지부(21)가 부설되어 있으며, 액면 게이지부(21)의 크기는 15mm×15mm×15mm이다. 슬릿부(14)는 요철 구조부(15)를 갖고, 요철 구조부(15)는 슬릿부(14)의 내부의 측면으로부터 각각 0.25mm인 볼록형 구조로 하고, 볼록형 요철 구조부(15)에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이 T4는 2.7mm이다.
(실시예 9)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해, 도 15에 나타내는 슬릿부(14)에 테이퍼 구조를 갖고, 기재의 상면에, 앞선 실시예 8에 있어서 상면에 부설된 사각기둥 형상의 액면 게이지부(21)를 갖는 형태의 고정구를, 실시예 9의 고정구로서 제작했다. 기재의 크기는 앞선 실시예 8과 같고, 슬릿부(14)의 개구부(16)의 폭 T21을 4mm, 폐색측의 폭 T22를 3mm로 하고, 슬릿부(14)의 길이 T1(테이퍼 구조부의 안쪽 길이 T11)은 기재(25)의 측면부로부터 30mm로 했다. 테이퍼 구조부의 기울기 (T21-T22)/T11가 0.033이다.
(실시예 10)
폴리아미드 수지를 이용하여 3D 프린터 가공을 행한 것 이외에는 실시예 9와 동일하게 하여, 실시예 10의 고정구를 제작했다.
(실시예 11)
폴리아미드 수지를 이용하여 3D 프린터 가공에 의해, 도 19의 상면 개략도에 나타내는 형상의, 기재(25)의 상면(윗면)에 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부(26)와 삽입부(26)의 측면부에 슬릿 개구부(16)을 갖고, 또한 도시하지 않은 액면 게이지부를 갖는 형태의 실시예 11의 고정구를 제작했다. 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 삽입부(26)의 크기는 세로×가로×깊이가 20mm×20mm×30mm이며, 슬릿부(14)의 폭 T2는 3.2mm이고, 슬릿부(14)의 길이는 슬릿 개구부(16)로부터 20mm이며, 슬릿부(14)의 깊이 T3은 30mm이다. 또한, 슬릿부(14)는 그 양측면에 길이 20mm에 걸쳐 볼록형 구조를 요철 구조부로서 갖는 구조로 했다. 실시예 11의 고정구의 요철 구조부는, 슬릿부(14)의 내부의 측면으로부터 각각 0.25mm인 볼록형 구조로 하고, 볼록형 요철 구조부에 의해 좁아진 부분의 폭방향의 길이 T4는 2.7mm이다. 또, 실시예 11의 고정구는 상기 기재(25)의 상면(윗면)에, 도시하지 않은 액면 게이지부가 부설되어 있으며, 액면 게이지부의 크기는 15mm×15mm×15mm이다.
＜동결 보존용 지그의 고정 상태의 평가＞
실시예 3~11의 고정구에 대해서, 동결 보존용 지그의 고정 상태를 평가하기 위해, 도 31에 도시되는 바와 같은 동결 보존용 지그를 제작했다. 당해 동결 보존용 지그는, 길쭉한 형상(폭 1.5mm, 길이 20mm, 두께 190μm)의 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지 필름을 재치부(4)로 하고, ABS 수지의 파지부(5)와 접착하여 본체 부재(2)를 제작했다. 캡 부재(3)를 ABS 수지로 제작했다. 캡 부재(3)의 외형은 3.1mm의 사각기둥이며, 선단부 근처에 0.3mm의 깊이의 오목부를 갖는 구조이다. 상기 동결 보존용 지그를 이용하여, 평형화 처리한 마우스(8) 세포기배를 보존액 0.1μL와 함께, 투과형 현미경 하에서 적하 부착했다. 또한, 보존액은, 시그마 알드리치사 제조 Medium199 배지에, 15용적% DMSO, 15용적% 에틸렌글리콜, 17질량% 수크로스가 포함되는 조성의 것을 이용했다. 이어서, 투과형 현미경 하에서, 재치부를 포함하는 스트립을 캡 부재(3)에 삽입하고, 그 후, 액체 질소에 침지하여 동결 조작을 행했다. 그 후, 액체 질소 하에서, 상기 동결 보존용 지그의 캡 부재측을 슬릿부(14)에 고정했다. 또한, 액체 질소(18)의 액면(19)이 실시예 1~5의 고정구가 갖는 액면 게이지부(21)를 기준으로 하여, 동결 용기(20)에 액체 질소를 충전하고, 도 31에 나타내는 형태로 액면 게이지부(21)가 액체 질소의 액면보다 약간 아래에 위치하는 상태로 준비를 행했다. 실시예 3~11의 고정구(13)의 슬릿부(14)에 동결 보존용 지그의 캡 부재측을 삽입하고, 도 31에 나타내는 형태로, 고정·유지했을 때의 모습을 이하의 기준으로 평가했다. 이들의 결과를 표 2의 「융해 조작 시의 고정 상태의 평가」의 항에 나타낸다.
◎◎：특히 강고하게 고정을 할 수 있으며, 특히 우수한 평가였다.
◎：강고하게 고정을 할 수 있으며, 안정감이 있었다.
○：안정적으로 고정을 할 수 있었다.
△：고정을 할 수 있었지만, 약간 불안정했다.
(실시예 12)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해, 도 15에 나타내는 슬릿부(14)에 테이퍼 구조를 갖는 실시예 12의 고정구를 제작했다. 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 슬릿부(14)의 슬릿 개구부(16)의 폭 T2는 테이퍼 구조부에 있어서 기재의 표면에 가장 가까운 위치에 있어서의 슬릿부의 폭T21과 마찬가지로 4mm이며, 폐색측의 폭 T22를 3mm로 했다. 또 슬릿부(14)의 길이 T1은 테이퍼 구조부의 안쪽 길이 T11과 동일하고, 기재(25)의 측면부로부터 30mm이며, 슬릿부(14)의 깊이는 30mm로 했다. (T21-T22)/T11의 값은 0.033이다.
(실시예 13)
알루미늄을 이용하여 금속 절삭 가공에 의해, 도 15에 나타내는 슬릿부(14)에 테이퍼 구조를 갖는 실시예 12의 고정구를 제작했다. 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 기재의 표면에 가장 가까운 위치에 있어서의 슬릿부의 폭 T21은 3.8mm이며, 폐색측의 폭 T22를 3mm로 했다. 또 테이퍼 구조부의 안쪽 길이 T11은, 기재(25)의 측면부로부터 30mm로 하고, (T21-T22)/T11의 값은 0.027이다.
(실시예 14)
알루미늄을 이용한 금속 절삭 가공에 의해, 도 17에 나타내는, 슬릿부(14)에 테이퍼 구조부 및 굴곡 구조부를 갖는 실시예 13의 고정구를 제작했다. 또한, 기재(25)의 크기는 세로×가로×높이가 50mm×50mm×70mm이고, 기재의 표면에 가장 가까운 위치에 있어서의 슬릿부(14)의 폭 T21은 3.2mm이며, 슬릿부의 깊이 T3은 30mm이다. 슬릿부(14)의 길이는 삽입 방향으로부터 30mm 직진한 후에 90도 우측으로 방향을 바꾸어 10mm 직진한 형태로 했다. 테이퍼 구조부는, 폐색측의 폭 T22를 3mm로 하고, 테이퍼 구조부의 기울기 (T21-T22)/T11를 0.02로 했다.
＜동결 보존용 지그의 고정 상태의 평가＞
실시예 12~14의 고정구에 대해서, 동결 보존용 지그의 고정 상태를 평가하기 위해, 도 32에 도시되는 바와 같은 동결 보존용 지그를 제작했다. 도 32에 있어서 동결 보존용 지그는, 길쭉한 형상(폭 1.5mm, 길이 20mm, 두께 190μm)의 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지 필름을 재치부(4)로 하고, ABS 수지의 파지부(5)와 접착하여 본체 부재(2)를 제작했다. 또 캡 부재(3)를 ABS 수지로 제작했다. 캡 부재(3)의 외형은 3.1mm의 사각기둥이다. 또 도 32에 기재되는 캡 부재(3)는 오목부를 갖지 않는다.
상기한 동결 보존용 지그를 이용하여, 평형화 처리한 마우스(8) 세포기배를 보존액 0.1μL와 함께, 투과형 현미경 하에서 적하 부착했다. 또한, 보존액은, 시그마 알드리치사 제조 Medium199 배지에, 15용적% DMSO, 15용적% 에틸렌글리콜, 17질량% 수크로스가 포함되는 조성의 것을 이용했다. 이어서, 투과형 현미경 하에서, 재치부를 포함하는 스트립을 캡 부재에 삽입하고, 그 후 액체 질소에 침지하여 동결 조작을 행했다. 당해 보냉 조작 후에, 액체 질소 하에서, 상기한 동결 보존용 지그의 캡 부재측을 슬릿부(14) 내에 삽입하고, 도 32에 나타내는 형태로, 고정·유지했을 때의 모습을 이하의 기준으로 평가했다. 이들의 결과를 표 3의 「융해 조작 시의 고정 상태의 평가」의 항에 나타낸다.
◎◎：특히 강고하게 고정을 할 수 있으며, 특히 우수한 평가였다.
◎：강고하게 고정을 할 수 있며, 안정감이 있었다.
○：안정적으로 고정을 할 수 있었다.
△：고정을 할 수 있었지만, 약간 불안정했다.
＜융해 조작 시의 작업성의 평가＞
상기의 「동결 보존용 지그의 고정 상태의 평가」와 동일한 방법에 의해, 도 33에 나타내는 형태로, 실시예 3~14의 고정구를 이용하여 동결 보존용 지그를 각각 고정·유지했다. 도 33은, 본체 부재(2)와 캡 부재(3)를 분리하고, 재치부(4)를 융해액(24)에 침지한 상태를 나타내는 개략도이다.
그 후, 도 33에 나타내는 형태와 같이, 동결 보존용 지그의 본체 부재와 캡 부재를 분리할 때의 작업성을 평가했는데, 실시예 3~14의 고정구는 모두 신속한 융해 조작이 가능하고, 높은 작업성을 갖는 것이 나타났다. 또 실시예 3~14의 고정구를 이용한 융해 작업에서는, 세포 또는 조직이 액체 질소 중에 위치하는 것을 용이하게 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터, 본 발명의 고정구를 이용하면, 세포 또는 조직을 융해액으로 옮기는 조작에 앞서, 동결 보존용 지그를 안정적으로 고정·유지하는 것이 가능하다. 본 발명의 고정구를 이용하여, 동결 보존용 지그를 고정·유지하면, 세포 또는 조직을 융해액으로 옮기는 조작에 앞서, 동결 보존용 지그를 고정·유지했을 때에, 동결 보존용 지그의 스트립 상에 재치된 세포 또는 조직이 확실하게 액체 질소의 액면보다 아래에 위치하는 것을 용이하게 확인할 수 있는 것에 더하여, 신속한 융해 조작을 행하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있다.
[산업상 이용가능성]
본 발명은, 소 등의 가축이나 동물의 배 이식이나 인공 수정, 사람에 대한 인공 수정 등 이외에, iPS 세포, ES 세포, 일반적으로 이용되고 있는 배양 세포, 배 또는 난자를 포함하는 생체로부터 채취한 검사용 또는 이식용 세포 또는 조직, 생체 밖에서 배양한 세포 또는 조직 등의 동결 보존 및 그 융해에 이용할 수 있다.
1: 동결 보존용 지그 2: 본체 부재
3: 캡 부재 4: 재치부
5: 파지부 6: 마킹부
7: 끼워맞춤 구조부 8: 끼워맞춤 접촉부
9: 고정 부위 10: 접합부
11: 세포 12: 보존액
13: 고정구 14: 슬릿부
15: 요철 구조부 16: 슬릿 개구부
17: 공동 구조부 18: 액체 질소
19: 액면 20: 동결 용기
21: 액면 게이지부 22: 상한 마킹부
23: 하한 마킹부 24: 융해액
25: 기재 26: 삽입부
3: 캡 부재 4: 재치부
5: 파지부 6: 마킹부
7: 끼워맞춤 구조부 8: 끼워맞춤 접촉부
9: 고정 부위 10: 접합부
11: 세포 12: 보존액
13: 고정구 14: 슬릿부
15: 요철 구조부 16: 슬릿 개구부
17: 공동 구조부 18: 액체 질소
19: 액면 20: 동결 용기
21: 액면 게이지부 22: 상한 마킹부
23: 하한 마킹부 24: 융해액
25: 기재 26: 삽입부
Claims (7)
- 상면, 측면 및 저면을 갖는 기재(基材)의 상면에, 적어도 한쪽 끝이 기재의 측면부에 개구된 슬릿부를 갖거나, 혹은 기재의 상면에 동결 보존용 지그를 삽입하는 삽입부와 당해 삽입부의 측면부에 한쪽 끝이 개구된 슬릿부를 갖는 동결 보존용 지그의 고정구로서, 당해 슬릿부는 동결 보존용 지그를 고정하기 위한 고정 구조부를 갖고, 당해 고정 구조부가 하기 (I)~(III)의 구조부 중 적어도 1개의 구조부인 것을 특징으로 하는 동결 보존용 지그의 고정구.
(I) 슬릿부의 내부의 측면에 형성된 요철 구조부.
(II) 슬릿부의 내부의 측면간의 거리가, 슬릿부의 안으로 나아갈수록 서서히 좁아진 테이퍼 구조부.
(III) 슬릿부가 슬릿 개구부로부터 기재의 내부를 향해 직진한 후에, 당해 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 굴곡 구조부. - 청구항 1에 있어서,
고정 구조부로서, 상기한 (II)의 테이퍼 구조부 및/또는 상기한 (III)의 굴곡 구조부 중 어느 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 동결 보존용 지그의 고정구. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
고정 구조부로서, 상기한 (II)의 테이퍼 구조부를 갖고, 당해 테이퍼 구조부가 하기 식 (1)의 요건을 만족하는 것을 특징으로 하는 동결 보존용 지그의 고정구.
(T21-T22)/T11≤0.03 식 (1)
(식 중, T21은 슬릿 개구부에 가장 가까운 부분에 있어서의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내고, T22는 슬릿 개구부로부터 가장 떨어진 부분에 있어서의 테이퍼 구조부의 폭을 나타내며, T11은 테이퍼 구조부의 안쪽 길이를 나타낸다.) - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
고정 구조부로서, 상기한 (III)의 굴곡 구조부를 갖고, 슬릿부가 직진 방향과는 상이한 방향으로 굴곡된 후에 상기한 (II)의 테이퍼 구조부를 갖는 것을 특징으로 하는 동결 보존용 지그의 고정구. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
기재의 상면 또는 측면에, 당해 기재의 상면보다 상방으로 신장된 액면 게이지부를 갖는 것을 특징으로 하는 동결 보존용 지그의 고정구. - 재치부(載置部)를 갖는 본체 부재 및 당해 본체 부재에 착탈이 자유로운 캡 부재를 적어도 갖는 동결 보존용 지그의 재치부에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하고, 당해 재치부를 캡 부재로 밀폐하는 밀폐 공정과, 당해 밀폐한 재치부를 냉각 용매에 의해 냉각하여, 세포 또는 조직을 동결하는 동결 공정과, 당해 동결 공정에 있어서 동결된 세포 또는 조직의 동결 상태를 유지하는 보냉 공정과, 동결 상태가 유지되어 있던 세포 또는 조직을 융해하는 융해 공정을 적어도 갖고, 당해 융해 공정의 개시 전에 있어서, 캡 부재에 의해 밀폐된 세포 또는 조직을, 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 동결 보존용 지그의 고정구가 갖는 고정 구조부에 고정하여, 당해 세포 또는 조직이 냉각 용매의 액면보다 하방에 위치하며, 또한 본체 부재와 캡 부재의 접합부가 냉각 용매의 액면보다 상방에 위치하는 상태로 일단 유지하고, 당해 융해 공정에서는 본체 부재와 캡 부재를 분리하고, 본체 부재가 갖는 재치부를 융해액에 침지하여 세포 또는 조직을 융해하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 융해 방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기한 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 융해 방법.
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