JP2021114962A - 被包部材 - Google Patents

Abstract

【課題】良好な生産性にて生産することが可能な被包部材を提供する。【解決手段】細胞又は組織を凍結保存するにあたり該細胞又は組織が載置された載置部を被包するための被包部材であって、該被包部材は筒状部を有し、該筒状部の一方の端部は前記した載置部が挿入される開口部を有し、該筒状部のもう一方の端部は最端部より、固定材、通気性を有する封止材、および固定材の順で配置された封止部を有する。【選択図】図３

Description

本発明は被包部材に関する。詳しくは細胞又は組織を凍結保存するにあたり、該細胞又は組織が載置された載置部を被包するための被包部材に関する。

細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。

一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われたり、形質の変化が生じることから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を保った状態で長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。

細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化する現象であるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。

前記した緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化凍結法が提案されている。ガラス化凍結法とは、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。

ガラス化凍結法の具体的な操作としては、耐凍剤を多量に含む保存液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化凍結法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。

ガラス化凍結法を用いると、原理的には、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、適切なガラス化凍結を成し得るためには、ガラス化に用いる保存液に含有される耐凍剤の濃度を高いものとしなければならない。

ガラス化凍結法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。

ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。

特許文献３、特許文献４では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ（登録商標）法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、液体窒素下で凍結保存する方法が提案されている。

上記したフィルム上の卵子又は胚等を液体窒素下で凍結保存するにあたり、液体窒素が滅菌されておらず、細胞又は組織を液体窒素中で凍結させる場合においては、凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部を被包部材により被包することが行われる。欧州等の海外先進国では、液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。また、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においても、貯蔵する液体窒素タンク中での物理的衝撃等から、凍結保存用治具上に載置された細胞又は組織を保護する目的で、細胞又は組織が載置された載置部を、被包部材により被包することが行われる。

細胞又は組織を保護する被包部材は、上記した載置部が挿入される開口部を有し、該被包部材のもう一方の端部は、封止されていることによって、細胞又は組織を保護することが可能となる。しかし該被包部材によって載置部を密閉してしまうと、不意な事故等により凍結保存用治具が室温下にさらされた場合、被包部材内部の空気の体積膨張が生じ、被包部材の破裂・破損を招くことがある。このため被包部材の先端（開口部を有する側とは別の端部）を、通気性を有する封止材により封止することが知られている（例えば特許文献５）。また前記した特許文献４にも綿状体によって通気可能に封止することが記載されている。

特許第３０４４３２３号公報 特開２００８−５８４６号公報 特開２００２−３１５５７３号公報 特開２００６−２７１３９５号公報 特開２０１４−１８４０５６号公報

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１７０−１７２（１９９０）

前記した特許文献４に記載されるように、該封止材は接着剤によって固定されることが一般的であった。しかしながら、例えば前記した特許文献５に記載されるように、細胞や組織等を載置する載置部の幅は０．５〜４．０ｍｍと微細であり、よって該載置部を被包する被包部材も微細であることから、該被包部材内部に接着剤を用いて封止材を固定する作業は極めて繁雑であった。このため高い生産性にて製造することが可能な被包部材が求められていた。

本発明は、高い生産性にて製造することが可能な被包部材を提供することを課題とする。

本発明者は、以下の構成を有する被包部材によって、上記課題を解決できることを見出した。

細胞又は組織を凍結保存するにあたり該細胞又は組織が載置された載置部を被包するための被包部材であって、該被包部材は筒状部を有し、該筒状部の一方の端部は前記した載置部が挿入される開口部を有し、該筒状部のもう一方の端部は最端部より、固定材、通気性を有する封止材、および固定材の順で配置された封止部を有することを特徴とする被包部材。

本発明によれば、高い生産性にて製造可能な被包部材を提供することができる。

本発明の被包部材を有する凍結保存用治具の一例を示す全体図である。 被包部材が本体部材に嵌合・固定された状態の一例を示す全体図である。 本発明の被包部材が有する封止部の概略図である。 固定材の一例を示す図である。

本発明の被包部材は、細胞又は組織を凍結保存するにあたり、該細胞又は組織が載置された載置部を被包するために用いられるものである。本発明において、細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。

本発明において、細胞又は組織の凍結保存作業は、細胞又は組織を極低温の冷媒を用いて凍結させる凍結作業、細胞又は組織を極低温の冷媒中で貯蔵する保管作業、細胞又は組織を融解液中で解凍する融解作業の一連の操作を含むものとする。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明の被包部材は筒状部を有し、該筒状部の一方の端部は前記した載置部が挿入される開口部を有し、該筒状部のもう一方の端部は最端部より、固定材、通気性を有する封止材、および固定材の順で配置された封止部を有する。

上記した被包部材が有する筒状部は、結晶性高分子化合物により筒状に形成された部材であることが好ましい。これにより被覆部材の厚みを薄くしても、必要かつ十分な強度を有する被包部材を得ることができる。結晶性高分子化合物とは、高分子鎖が規則正しく配列しているいわゆる結晶状態を有する高分子化合物であり、結晶状態を有さず非晶状態のみからなるいわゆる非晶性高分子化合物とは区別される化合物である。かかる結晶性高分子化合物としては、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリエチレンナフタレート樹脂、ポリアミド樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリブチレンテレフタラート樹脂、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、液晶ポリマー等が例示される。中でも破損等の不具合の生じないスムーズな嵌合と、嵌合後の強固な固定を両立することが可能であり、かつ筒状部を形成する際の加工性に優れることから、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、およびポリエチレンテレフタレート樹脂により形成された筒状部が好適である。筒状部は、一種類の結晶性高分子化合物を含有しても良いし、複数種類の結晶性高分子化合物を含有しても良い。また筒状部は、上記した結晶性高分子化合物の他に、フィラーや可塑剤などの結晶性高分子化合物以外の成分を含有することができる。筒状部が該結晶性高分子化合物以外の成分を含有する場合には、結晶性高分子化合物に対する割合が１０質量％を超えない範囲とすることが好ましい。

本発明において被包部材が有する筒状部は透明性を有することが好ましい。筒状部が透明性を有する場合、凍結作業の際に、被包部材で被包された載置部の様子を良好な視認性で確認でき、細胞又は組織の凍結保存作業時における作業性が向上する。また、凍結後の保管作業、あるいは融解作業の際にも、被包部材を本体部材に嵌合・固定したまま載置部の様子を確認することが可能となる。なお本発明において透明性を有するとは、筒状部のヘイズが３０％以下であることを意味し、より好ましくは１５％以下である。

本発明において被包部材が有する筒状部は、一方の端部が後述する載置部を挿入するための開口部を有し、もう一方の端部は最端部より固定材、通気性を有する封止材、固定材の順で配置された封止部を有する。筒状部の一方の端部が上記した封止部で封止されることにより、接着剤を用いずとも筒状部に通気性を有する封止材を容易に固定することができ、よって該被包部材は高い生産性にて製造することが可能となる。

本発明において通気性を有する封止材としては、例えば綿花や濾紙等が挙げられる。濾紙の素材としてはセルロース繊維、ガラス繊維、シリカ繊維、フッ素樹脂等が挙げられ、二種類以上の素材を混合した濾紙でもよい。また、特殊な処理を施した繊維を用いてもよく、例えばセルロース繊維に活性炭を充填した濾紙等も利用可能である。

本発明において被包部材が有する筒状部および通気性を有する封止材の断面形状（載置部が挿入される方向と直交する面の形状）は円形であることが好ましく、これにより載置部を被包部材で被包する際の作業性が向上する。よって通気性を有する封止材は円柱形であることが好ましく、特に円柱形に成型した濾紙は好適である。濾紙は筒状部内へ容易に挿入できるため、かかる作業に対する負荷も極めて小さく、生産性の観点から好適であり、載置部に載置された細胞又は組織の保護性の観点からも好適である。

本発明の被包部材が有する固定材は、上記した封止材の両側に隣接する形で配置される。すなわち被包部材の最端部より、固定材、通気性を有する封止材、固定材の順で配置される。かかる固定材としては被包部材に十分な通気性を付与する観点から、筒状の固定材、あるいは微細な穴を多数有する固定材が好適であり、円筒状の固定材が特に好ましい。固定材の素材としてはアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属類、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラス等が例示される。

また被包部材の封止部を重くすることで、液体窒素等の冷媒中における凍結保存用治具の浮上に伴う作業性の低下を緩和することができる。従って本発明の好ましい態様としては、固定材をより比重の高い金属類を用いることが好ましく、特にステンレス合金は好適である。

前述した筒状部は、固定材の断面形状の外径を１００％とした際、該筒状部の内径は９４〜９８％であることが好ましい。筒状部の内径が９４％未満では、封止部付近の筒状部に白濁が生じる場合がある。また筒状部の内径が９８％を超えた場合、封止部の位置にズレが生じる場合がある。

本発明の被包部材が有する筒状部の厚み（被包部材の側面部を形成する部材の厚み）は、０．１〜０．５ｍｍであることが好ましい。より好ましくは、０．２〜０．４ｍｍである。被包部材の厚みが０．１ｍｍを下回る場合、液体窒素中で被包部材を嵌合した際、被包部材が破断してしまう場合がある。一方、被包部材の厚みが０．５ｍｍを超える場合には、極低温環境下において本体部材と被包部材の嵌合・固定を、良好な作業性にて解除することが難しくなる場合がある。

本発明の被包部材が有する固定材の幅（固定材を挿入する方向における固定材の長さ）は、１〜８ｍｍであることが好ましい。より好ましくは、３〜６ｍｍである。該固定材の幅が１ｍｍを下回る場合、十分な固定強度が得られない場合がある。また製造過程において該固定材に変形や破損が生じるリスクがある。一方、該固定材の幅が８ｍｍを超える場合には、固定材を挿入する際の作業性が低下する場合がある。

本発明の被包部材により被包される載置部は、把持部により保持されることが好ましい。これにより良好な作業性にて凍結保存作業を行うことができる。また載置部は短冊状であることが好ましい。載置部が短冊状であると、被包部材によって被包・保護することが容易である。

被包部材により被包される載置部としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられる。載置部は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また、載置部の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を、透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。

また載置部として、熱伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。また目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面を、例えばコロナ放電処理のような電気的な方法や、あるいは化学的な方法により親水化することもでき、さらには粗面化することも可能である。

さらに、上記した載置部として保存液吸収体を用いることもでき、該保存液吸収体としては、例えば金網、紙等や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが例示される。その他の保存液吸収体としては屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体が例示される。該多孔質構造体により、細胞又は組織の周囲に存在するガラス化液を除去することができる。また、透過型の光学顕微鏡観察下において、細胞又は組織の凍結作業および凍結後の融解作業を、良好な視認性にて容易かつ確実に行うことができる。

上記した多孔質構造体の素材の屈折率は、例えば、アッベ屈折計（Ｎａ光源、波長：５８９ｎｍ）を用いてＪＩＳ Ｋ ００６２：１９９２、ＪＩＳ Ｋ ７１４２：２０１４に準じて測定できる。多孔質構造体を形成する屈折率が１．４５以下の素材としては、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリビニリデンジフロライド樹脂、ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂などのフッ素樹脂やシリコン樹脂のようなプラスチック樹脂材料、二酸化ケイ素のような金属酸化物材料、フッ化ナトリウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウムのような無機材料が挙げられる。

多孔質構造体の細孔径は５．５μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．７５μｍ以下である。これにより光学顕微鏡観察下における細胞又は組織の視認性を高めることができる。多孔質構造体の厚みは、１０〜５００μｍであることが好ましく、より好ましくは２５〜１５０μｍである。多孔質構造体の空隙率は３０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上である。

上記した多孔質構造体は該構造体単独で載置部としても良く、また、多孔質構造体は前記した各種樹脂フィルム、ガラス板等と積層体を形成し、これを載置部とすることも可能である。この場合、樹脂フィルムやガラス板の全光線透過率は８０％以上であることが好ましい。また、この積層体を形成するにあたり接着剤は好適に用いられ、該接着剤としては低温に強いシリコン系やフッ素系の接着剤を好適に用いることができる。

本発明において把持部は、把持のしやすさや、操作性の向上を目的として、角柱状であることが好ましい。また把持部は、耐液体窒素素材により形成された部材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラスなどを好適に用いることができる。

前記した把持部の、載置部が設けられる側には、前述した被包部材を固定するためのテーパー構造部を有することが好ましい。該テーパー構造部は前記した被包部材を嵌合する方向に向かって径が拡張する円錐台の形状を有することが好ましい。

上記したテーパー構造部は、その側面部に、嵌合方向に対して略平行な溝を有していても良い。テーパー構造部が溝を有することにより、被包部材を嵌合した際に、被包部材が接さない部分をテーパー構造部に付与することで、挿入・嵌合時及び、嵌合を解除する際の抵抗感を軽減することができる。また液体窒素中のような極低温環境下では、素材の熱収縮による寸法変化が生じるため、抵抗感の低減が特に重要である。テーパー構造部が被包部材と接さない部分を有することで、極低温環境下での強固な固定と、スムーズな挿入・嵌合及びその解除を両立することができる。

本発明においてテーパー構造部の嵌合方向の長さに対するテーパー径の拡張幅の比［（径の拡張幅）／（テーパー構造部の嵌合方向の長さ）］は、０．０８以上０．１４未満であることが好ましい。前記した拡径幅の比が０．０８未満の場合には、テーパー構造部に被包部材をスムーズに嵌合することが困難な場合がある。一方で、前記した拡張幅の比が０．１４以上の場合には、被包部材を強固に固定することが困難な場合がある。

上記した本体部材のテーパー構造部の最大径部分は、被包部材の開口部の内径以上であることが好ましい。テーパー構造部の最大径部分が、被包部材の開口部の内径以上であることにより、極低温環境下において本体部材に被包部材を強固に嵌合させることができる。

以上、本発明における凍結保存用治具の構成について説明した。以下、本発明を、図面に沿ってさらに詳細に説明する。

図１は、本発明の被包部材を有する凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において、凍結保存用治具９は、載置部１を有する本体部材４と、被包部材５から構成される。本体部材４は、細胞又は組織を載置する短冊状の載置部１とそれに付設された把持部３を有する。また把持部３の、載置部１が設けられる側には、被包部材５を嵌合・固定可能とするテーパー構造部２を有する。テーパー構造部２は被包部材５を嵌合する方向（図中右側）に向かって径が拡張している。被包部材５は、筒状部８の一方の端部に開口部６を有し、もう一方の端部は封止部７を有する。

図２は、被包部材によって載置部が被包された状態の一例を示す全体図である。図２において被包部材５は、その一端が本体部材４が有するテーパー構造部２に嵌合・固定されている。このようにして、細胞又は組織が載置される載置部１は、封止部７を有する被包部材５によって被包される。

図３は、封止部の拡大図である。図３において筒状部８は最端部より、固定材１１、通気性を有する封止材１０、固定材１１の順で配置された封止部７により封止されている。なお図中、固定材１１と封止材１０の間に隙間が存在するが、この隙間は存在していても、していなくてもよい。

図４は、固定材の一例を示す図である。固定材１１は円筒状の形状であり、これにより被包部材５に良好な通気性を付与している。

本発明の被包部材を用いて細胞又は組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、凍結作業を行う際には、まず保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置部上に滴下する。次いで、前記細胞又は組織を載置部に保持させたまま該凍結保存用治具の本体部材を液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結することができる。その後、該被包部材を、液体窒素中で、本体部材のテーパー構造部に嵌合・固定する。この状態で、長期間、保管作業を行うことができる。

あるいは、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置部上に滴下する。次いで本発明の被包部材を、本体部材のテーパー構造部に嵌合・固定する。その後、被包部材により被包された載置部を液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結する。またその状態を維持することで、長期間、保管作業を行うことができる。

上記した保存液としては、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有する保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含有する保存液を使用できる。

融解作業は、例えば、冷却溶媒中に本発明の被包部材で被包された載置部を浸漬したまま（かつ被包部材の開口部の位置は冷却溶媒の液面よりも高い位置に保持した状態で）、本体部材のテーパー構造部と被包部材の嵌合・固定を解除する。その後、本体部材を被包部材から取り出し、凍結された細胞又は組織が載置された載置部を融解液中に浸漬させる。かかる方法によって融解された細胞又は組織は、その後回収される。

本発明の被包部材によって被包し、凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織等）の凍結保存に好適である。本発明の被包部材は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２−２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。

（実施例１）
図１に示す形態にて実施例１の被包部材を作製した。該被包部材が有する筒状部８は、ポリプロピレン樹脂を押出形成法により成型することで作製した。該筒状部の内径（図３における内径１３）は２．５９ｍｍ、外径は３．４０ｍｍである。

次に封止部が有する固定材として、外径（図４における外径１４）が２．７ｍｍ、幅（図４における幅１５）が５．０ｍｍ、厚みが０．３ｍｍの円筒状のステンレス合金を用い、また封止材としてセルロース繊維からなる円柱形に成型した濾紙（外径が２．５０ｍｍ、幅が２．０ｍｍ）を用いて、図１に示した形状を有する被包部材５を作製した。

その際、上記したポリプロピレン樹脂製の筒状部の端部より、まず１つ目の固定材を挿入し、棒状の金属製挿入治具にて該固定材を奥側に移動させ、続いて封止材および前記した固定材と同じ固定材の順で挿入した。その後、筒状部からはみ出した固定材（最後に挿入した固定材）を作業台の平面に押し当てて、筒状部から固定材が突出しないよう完全に挿入し、実施例１の被包部材を得た。

（実施例２）
実施例１において、ポリプロピレン樹脂により成型された筒状部の内径を２．５７ｍｍに変更した以外は実施例１と同様にして、実施例２の被包部材を得た。

（実施例３）
実施例１において、ポリプロピレン樹脂により成型された筒状部の内径を２．５５ｍｍに変更した以外は実施例１と同様にして、実施例３の被包部材を得た。

（実施例４）
実施例１において、ポリプロピレン樹脂により成型された筒状部の内径を２．６１ｍｍに変更した以外は実施例１と同様にして、実施例４の被包部材を得た。

（実施例５）
実施例１において、ポリプロピレン樹脂により成型された筒状部の内径を２．６３ｍｍに変更した以外は実施例１と同様にして、実施例５の被包部材を得た。

（実施例６）
実施例１において、ポリプロピレン樹脂により成型された筒状部の内径を２．５３ｍｍに変更した以外は実施例１と同様にして、実施例６の被包部材を得た。

（実施例７）
実施例１において、ポリプロピレン樹脂により成型された筒状部の内径を２．６５ｍｍに変更した以外は実施例１と同様にして、実施例７の被包部材を得た。

（比較例１）
実施例１において、筒状部の内径（図３における内径１３）を２．７０ｍｍ、外径を３．５１ｍｍとした以外は同様にして、ポリプロピレン樹脂製の筒状部を作製し、実施例１において作製した封止材（円柱形の濾紙）の側面と、前記した筒状部の内壁との間に、湿気硬化型接着剤（スリーボンド（株）製ＴＢ１５３０）を付与し、その後、ポリプロピレン樹脂製の筒状部の端部より封止材を挿入し（筒状部からはみ出した封止材は作業台の平面に押し当てることで、筒状部から突出しないように挿入し）、その後、接着剤を硬化させて、比較例１の被包部材を作製した。なお湿気硬化型接着剤の硬化には２４時間を要した。

上記した実施例１〜７及び比較例１の被包部材について、下記の被包部材の生産性、封止部の固定度、および極低温耐性について評価を行った。この結果を表１に示す。

＜被包部材の生産性の評価＞
実施例１〜７及び比較例１の被包部材をそれぞれ３０本作製し、該被包部材に封止部を設ける際の、１本当たりに必要であった作業時間を、下記基準にて評価した。この結果を表１に示す。

○：１本当たりに必要であった作業時間は、平均１０秒未満であった。
△：１本当たりに必要であった作業時間は、平均で１０秒以上１５秒未満であった。
×：１本当たりに必要であった作業時間は、平均で１５秒以上必要であった。

＜被包部材の封止部固定度の評価＞
実施例１〜７及び比較例１の被包部材を個々３０本準備し、ノズル口径２．０ｍｍのエアダスターガンを用いて、エアーの流出方向と筒状部が同軸線上になる様にして、被包部材の開口部側より被包部材の封止部に向かって流量１６０Ｌ／分のエアーを１０分間当てて、被包部材の封止部の固定度を下記基準にて評価した。この結果を表１に示す。

○：３０本の被包部材の全てにおいて、封止部の位置が動かなかった。
△：３０本の被包部材の中で、１０％未満の割合で封止部位置にズレが生じたが、そのズレ幅はいずれも実用の範囲内であった。

＜被包部材の極低温耐性の評価＞
実施例１〜７及び比較例１の被包部材を個々３０本準備し、これらを液体窒素下で２４時間保存し、その後、常温に戻して２４時間放置する操作を、計１０回繰り返し、被包部材の極低温耐性を下記基準にて評価した。この結果を表１に示す。

○：３０本の全てにおいて、何ら変化は認められなかった。
△：封止部付近の筒状部にやや白濁が認められたが、実用上問題ないレベル。

上記の結果から、本発明の被包部材は、良好な生産性にて生産することが可能であることが判る。また本発明の好ましい形態においては、被包部材の封止部固定度と極低温耐性に優れた被包部材が得られることが判る。

本発明の被包部材は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織等の凍結保存に用いる凍結保存用治具の被包部材として、好適に用いることができる。

１ 載置部
２ テーパー構造部
３ 把持部
４ 本体部材
５ 被包部材
６ 開口部
７ 封止部
８ 筒状部
９ 凍結保存用治具
１０ 封止材
１１ 固定材
１２ 筒状部の内壁
１３ 筒状部の内径
１４ 固定材の外径
１５ 固定材の幅

Claims (1)

1. 細胞又は組織を凍結保存するにあたり該細胞又は組織が載置された載置部を被包するための被包部材であって、該被包部材は筒状部を有し、該筒状部の一方の端部は前記した載置部が挿入される開口部を有し、該筒状部のもう一方の端部は最端部より、固定材、通気性を有する封止材、および固定材の順で配置された封止部を有することを特徴とする被包部材。

Images