JP3202440U - 凍結保存用治具 - Google Patents

Abstract

【課題】ストローキャップの装着が容易であり、凍結保存時の操作性に優れた生物の細胞又は組織などを凍結保存する際に使用する凍結保存用治具を提供する。【解決手段】細胞又は組織を載置する載置部１を少なくとも有し、該載置部１の先端部形状が載置部１の幅よりも広がることなく、載置部１の幅方向における略中心部に向かって先端部の幅が縮小していく形状であることを特徴とする。【選択図】図１

Description

本考案は、生物の細胞又は組織などを凍結保存する際に使用する凍結保存用治具に関する。より詳細には、凍結保存する際の操作性に優れた凍結保存用治具に関する。

生物の細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術に用いられる胚は、受胚牛の発情周期に合わせて移植が行われており、発情周期に胚の移植を合わせるために、胚を凍結保存し、発情周期に合わせて胚を融解して移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。

一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。

細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。

前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。

前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。

前記した液体窒素は一般に滅菌されていないので、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部にキャップを装着して、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。欧州など海外先進国では、このような細胞又は組織を液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。

また、細胞又は組織を液体窒素に直接接触させる凍結方法においても、細胞又は組織を付着させた載置部の保護を目的として、載置部にキャップを装着することが一般になされる。この場合、例えば、細胞又は組織を付着させた載置部を有する凍結保存用治具を液体窒素中に浸漬させ、細胞又は組織のガラス化状態が崩れないように、液体窒素中でキャップを装着し、該載置部を保護する操作がなされる。

キャップは一般に、耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製され、一般にはストローキャップなどのように、細胞又は組織を載置した載置部と接触せず、細胞又は組織を外界と遮断できるものが使用される。このようなストローキャップを利用した例としては、例えば特開２００２−３１５５７３号公報（特許文献１）、特開２００６−２７１３９５号公報（特許文献２）、国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット（特許文献３）、および特開２０１４−１８４０５６号公報（特許文献４）等に記載されている。

凍結保存用治具が有する、細胞又は組織を載置する載置部の大きさとしては、例えば長さが１０〜５０ｍｍ程度、幅が０．５〜２．０ｍｍ程度とすることが一般的であり、一方、前記したストローキャップは、必要以上に冷却速度を低下させないため、あるいは液体窒素が封入された容器内に数多くの凍結保存用治具を保存するために、必要最小限の容量のものが使用される。

特開２００２−３１５５７３号公報 特開２００６−２７１３９５号公報 国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット 特開２０１４−１８４０５６号公報

しかしながら、従来から知られる凍結保存用治具が有する載置部の先端部形状は、細胞又は組織を載置する載置部の先端が平坦な形状であったり（特許文献１〜３）、載置部の一方の側面の側に向かって先端部の幅が縮小していく形状であったり（特許文献３）、あるいは載置部の先端部形状が載置部の幅よりも一旦広がり、その後、載置部の幅方向における中心部に向かって先端部の幅が縮小していく楕円形状であるため（特許文献４）、必要最小限の容量のストローキャップ、すなわち必要最小限の内径で設計されたストローキャップを装着する操作は煩雑であった。特に、液体窒素中で前記したストローキャップを装着し、細胞又は組織が載置された載置部を保護する操作はとりわけ煩雑であった。

本考案は、ストローキャップの装着が容易である凍結保存用治具を提供することを課題とする。

本考案者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する凍結保存用治具で解決できることが判明した。
（１）細胞又は組織を載置する載置部を少なくとも有し、該載置部の先端部形状が載置部の幅よりも広がることなく、載置部の幅方向における略中心部に向かって先端部の幅が縮小していく形状であることを特徴とする凍結保存用治具。

本考案により、ストローキャップの装着が容易であり、凍結保存時の操作性に優れた凍結保存用治具を提供することができる。

本考案における載置部の先端部形状の一例を示した図 本考案における載置部の先端部形状の別の一例を示した図 本考案における載置部の先端部形状の別の一例を示した図 載置部が把持部に固定された凍結保存用治具を示した図

以下に本考案の実施の形態を、図面を参照して詳細に説明するが、本考案は図示される実施形態に限定されるわけではない。

図１は、本考案における載置部の先端部形状の一例を示した図である。図１において、細胞又は組織を載置する載置部１の先端部形状は、載置部１の幅Ｗよりも広がることなく、図中ａ−ａの地点から、載置部１の幅方向における中心部Ａ_１に向かって、先端部が楕円形状を形成しつつ縮小している。本発明において、先端部が縮小していく方向は略中心部であり、図１に示したような、載置部１の中心線ｂ上に縮小するものに限定されない。なお、本考案における略中心部とは、先端部が縮小した際の最も幅の狭い部分の位置が、載置部の中心線ｂを中心とし、かつ載置部１の幅Ｗの１／２の範囲内に存在することを意味する。また先端部の幅が縮小し始めてから（図中ａ−ａの地点）、最も幅が小さくなる地点Ａまでの長さＨは、載置部の幅Ｗの６０〜２００％であることが好ましい。

図２および図３は、本考案における載置部の先端部形状の別の一例を示した図である。図２において、細胞又は組織を載置する載置部１の先端部形状は、載置部１の幅Ｗよりも広がることなく、図中ａ−ａの地点から、載置部の幅方向における略中心部Ａ_２（先端部が縮小した際の最も幅の狭い部分の位置が、載置部１の中心線ｂを中心とし、かつ載置部１の幅Ｗの１／４の範囲の左端の地点に存在）に向かって、先端部の幅が直線的に縮小している。

図３において、細胞又は組織を載置する載置部１の先端部形状は、載置部１の幅Ｗよりも広がることなく、図中ａ−ａの地点から、載置部の幅方向における中心部Ａ_１の方向に近寄るように、先端部の幅が直線的に縮小している。また図中ａ′−ａ′の地点から再度中心部Ａ_１に向かって、先端部の幅が直線的に縮小している。このように、先端部の幅が直線的に縮小していく際には、複数の段階に分けて先端部の幅を縮小することも可能である。

本考案において、上記した細胞又は組織を載置する載置部の、先端の幅が縮小していない側は、把持部に固定されていることが好ましい。すなわち本考案の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部と、把持部を有することが好ましい。細胞又は組織の凍結操作の際、操作者は、把持部を持ちながら、ストローキャップを装着することができる。また把持部を持ちながら、該凍結保存用治具を液体窒素等に浸漬することができる。図４は載置部１が把持部２に固定された凍結保存用治具３を示した図である。

本考案の凍結保存用治具が有する載置部としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられる。載置部は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また載置部の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を、透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。

温度伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。また、目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面をコロナ放電処理のような電気的な方法や、化学的な方法により易接着処理することもでき、さらには粗面化することもできる。

本考案において、細胞又は組織の載置部が保存液吸収体を有する場合、細胞又は組織に付着した保存液の量が多くても保存液吸収体が保存液を除くことができるため、保存液の除去操作が不要となり作業性が格段に向上する。またそのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結作業する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。クライオトップ法等のガラス化法においては、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液が保存液として利用され、この保存液には多量の耐凍剤による化学的毒性が存在するが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺の保存液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。

本考案の凍結保存用治具が好ましく有する保存液吸収体としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の各種シートが挙げられる。なお本考案における「多孔性」とは、上記したシートが表面に気孔（細孔）を有する構造体であることを意味し、シート表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体であることがより好ましい。また保存液吸収体（上記した各種シート）の厚みは１０μｍ〜５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ〜２．５ｍｍである。

本考案において、保存液吸収体として用いる繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が例示される。

本考案において、保存液吸収体として用いる多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２−１３５６０号公報や、特開平０８−２８３４４７号公報に記載される樹脂シート、特開２００９−２３５４１７号公報に記載される樹脂シート等が挙げられる。

上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニルジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン−アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。中でもポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂は、細胞又は組織を保存液と共に載置部に載置した場合、該多孔性樹脂シートの透明性が高くなり、透過顕微鏡観察下での細胞又は組織の視認性が飛躍的に高まり、細胞又は組織の視認性にとりわけ優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好適である。また多孔性樹脂シートとしては、理化学実験用途や研究用途として市販されている、濾過用のメンブレンフィルターも使用できる。

本考案において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シートとしては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、亜鉛、鉛、チタン、ニッケル、ステンレス等の金属からなる多孔性金属シートが挙げられる。また多孔性金属酸化物シートとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニウム、石英ガラスなどの金属酸化物からなる多孔性金属酸化物シートを好ましく利用することができる。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートは、上記した金属および金属酸化物をそれぞれ２種類以上含有する多孔性シートであっても良い。中でも多孔性金属酸化物シートは、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。

保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合には、該多孔質体の細孔径は、０．０２〜１３０μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５〜６０μｍである。細孔径が０．０２μｍ未満の場合、保存液の滴下時に保存液の吸収性能が十分でない場合がある。また、多孔性シートの製造が難しいという問題がある。一方、細孔径が１３０μｍを超える場合、保存液の吸収性能が十分でない場合がある。なお、多孔質体の細孔径は、多孔性樹脂シートの場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートの場合には、該多孔質体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。

保存液吸収体の空隙率は２０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは３０容量％以上である。また保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合、多孔質体の内部の気孔は、厚み方向のみならず、厚み方向に対して垂直な方向に対しても連続的な構造であることが好ましい。このような構造を有すると、多孔質体内部の気孔を有効に用いることができるために、保存液の高い吸収性能が得られる。保存液吸収体の厚み、多孔質体の空隙率は、用いる細胞又は組織の種類や細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて、適宜選択することができる。

上記した空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称 Ａｕｔｏｐｏｒｅ ＩＩ ９２２０ 製造者 ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
Ｐ：空隙率（％）
Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ^２）
Ｔ：厚み（μｍ）

本考案の凍結保存用治具が上記した保存液吸収体を有する場合、該保存液吸収体は前述した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等を支持体とし、該支持体上に接着層により固定されていることが好ましい。接着層の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ^２の範囲が好ましく、さらに０．１〜５０ｇ／ｍ^２の範囲がより好ましい。

本考案の凍結保存用治具は、細胞又は組織を長期間凍結保存することが可能である。通常、液体窒素は滅菌されておらず、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。しかし本考案の凍結保存用治具によれば、細胞又は組織が載置された載置部に、ストローキャップを装着することで、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないで、長期間凍結保存することが可能となる。また、細胞又は組織を液体窒素に直接接触させる凍結方法においても、液体窒素中で細胞又は組織が載置された載置部にストローキャップを装着することで、細胞又は組織を長期間凍結保存することが可能となる。

本考案は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。

１ 載置部
２ 把持部
３ 凍結保存用治具

Claims (1)

1. 細胞又は組織を載置する載置部を少なくとも有し、該載置部の先端部形状が載置部の幅よりも広がることなく、載置部の幅方向における略中心部に向かって先端部の幅が縮小していく形状であることを特徴とする凍結保存用治具。