WO2021039330A1 - 細胞又は組織の凍結保存用治具 - Google Patents

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WO2021039330A1
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cap member
tissues
cryopreservation
main body
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篤史 松澤
翔 吉田
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三菱製紙株式会社
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    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to a jig for cryopreserving cells or tissues.
  • embryos are cryopreserved, thawed and transplanted in accordance with the estrous cycle of a recipient cattle.
  • human infertility treatment after collecting an egg or an ovary from a mother, it is cryopreserved in order to adjust to a timing suitable for transplantation, and thawed at the time of transplantation for use.
  • a slow freezing method As a method for cryopreserving cells or tissues, for example, a slow freezing method is known.
  • a preservation solution obtained by containing a freezing agent in a physiological solution such as phosphate buffered saline.
  • a physiological solution such as phosphate buffered saline.
  • compounds such as glycerol, ethylene glycol and dimethyl sulfoxide are used.
  • the cells or tissues After immersing the cells or tissues in the preservation solution, the cells or tissues are cooled to ⁇ 30 to ⁇ 35 ° C. at a relatively slow cooling rate (for example, a rate of 0.3 to 0.5 ° C./min) to inside or outside the cells or the tissues.
  • the inner and outer solutions are sufficiently cooled and become more viscous.
  • the vitrification freezing method is also known as a method for cryopreserving cells or tissues.
  • the vitrification freezing method uses the principle that ice crystals are less likely to form even below freezing point due to the freezing point depression of a preservation solution containing a large amount of antifreezing agent. When this preservation solution is rapidly cooled in liquid nitrogen, it can be solidified without forming ice crystals. This solidification is called vitrification freezing.
  • a preservative solution containing a large amount of antifreeze is called a vitrification solution.
  • the slow freezing method described above it takes time for the operation for cryopreservation because it is necessary to cool at a relatively slow cooling rate. Further, there is a problem that a device or a jig for controlling the cooling rate is required.
  • ice crystals are formed in the storage solution outside the cells or tissues, so that the cells or tissues may be physically damaged by the ice crystals.
  • the operation time is short and no special device or jig is required.
  • the vitrification freezing method provides a high survival rate by not producing ice crystals.
  • Patent Document 1 shows that the application of the vitrification freezing method to animal or human germ cells or somatic cells is extremely useful in terms of cryopreservation and survival rate after thawing.
  • the vitrification freezing method is a technology that has been developed mainly using human germ cells, but recently, its application to iPS cells and ES cells has been widely studied.
  • Non-Patent Document 1 shows that the vitrification freezing method was effective for the preservation of Drosophila embryos.
  • Patent Document 2 shows that the vitrification freezing method is effective in preserving cultured plant cells and tissues. As described above, the vitrification freezing method is known to be useful for the preservation of cells and tissues of a wide variety of species.
  • the thawing rate is considered to be particularly important.
  • Non-Patent Document 2 it is known that even rapidly frozen cells have a low survival rate when the thawing rate is slow.
  • Patent Document 3 describes that thawing a frozen sample by a rapid thawing method improves the survival rate of human iPS cell-derived neural stem cells / progenitor cells after thawing.
  • Frozen embryos or eggs are thawed and diluted.
  • this cryopreservation jig and the cryopreservation method it is said that mammalian embryos or eggs can be preserved and thawed and diluted with a high survival rate without being infected with viruses or bacteria.
  • the difficulty of the freezing step of attaching the embryo or egg to the inner surface of the cryopreservation container such as a frozen straw, a frozen vial or a freezing tube is high, and the embryo or egg is surely placed in the cryopreservation container. It was difficult to confirm.
  • the strip for holding the egg attachment is immersed in a warm thawing solution, and the egg or embryo placed on the film is collected in the thawing solution.
  • the egg or embryo is placed on the film together with a small amount of preservative solution by the operator's operation, and although there is a problem that the operation is difficult, the egg or embryo can be frozen with a high survival rate.
  • Patent Document 5 proposes a cell cryopreservation tool having a cell holding member having a heat conductive member and a tubular storage member, but a step such as attaching a lid member to the tubular storage member during the freezing process. It was complicated. Further, in the melting process, in order to take out the cell holding member stored in the tubular storage member, in addition to the operation of removing the lid member, an instrument for taking out is required, which is complicated. It was.
  • Patent Document 11 describes a jig for cryopreservation in which a main body on which an egg is placed is stored in a tubular storage container.
  • a cutting tool and a take-out jig are used during the thawing process. Due to the need for equipment and the like, the operation of taking out the stored cryopreservation jig becomes complicated, and as a result, the thawing process becomes complicated. Further, as in the problems of Patent Documents 6 and 7, the risk of dropping when the egg or embryo is placed in the tubular member after being placed together with the preservation solution has not been improved.
  • the present invention is a jig for cryopreserving cells or tissues having at least a main body member having a strip-shaped tip and a cap member covering the tip of the main body, and the tip is a storage solution. It has at least a mounting portion having an absorber, the length of the tip portion in the minor axis direction is 70% or more of the inner diameter of the cap member, and the length of the lumen of the cap member in the major axis direction is the said.
  • a jig for cryopreservation of cells or tissues characterized in that the length of the tip portion in the major axis direction is 200% or less.
  • the present invention it is possible to cryopreserve an egg or an egg with a small amount of a preservation solution during the freezing step, but there is a risk that the embryo or the egg may fall off when the mounting portion is stored in the cap member.
  • it has excellent insertion workability, and in addition, the melting process can be performed in a short time without requiring complicated operations during the melting process, and excellent visibility in the melt is obtained. It is possible to provide a cryopreservation jig for cells or tissues capable of recovering the cells or tissues.
  • cryopreservation jig of the present invention will be described in detail below.
  • the tip portion of the main body member of the cryopreservation jig of the present invention has at least a mounting portion having a storage liquid absorber.
  • the storage solution absorber can effectively remove excess storage solution existing around the cells or tissues, so that the cells or tissues are placed and frozen. Operability when doing is improved.
  • the storage liquid absorber include wire mesh, paper, and other film-like materials made of synthetic resin having through holes.
  • a porous structure formed by using a material having a refractive index of 1.45 or less is exemplified. The porous structure can remove preservatives present around cells or tissues.
  • the porous structure makes it possible to easily and reliably perform the operation of placing and freezing cells or tissues and the operation of thawing after freezing under observation with a transmission type optical microscope with good visibility. ..
  • the cryopreservation jig of the present invention has a preservative liquid absorber in the mounting portion, so that the shape of the preservative liquid placed in the mounting portion can be flattened.
  • the preservation solution around the cells or tissues is continuous with the portion absorbed in the preservation solution absorbing body, resulting in the result.
  • the cells or tissues and the preservation solution around them can be reliably retained on the mounting portion without falling off from the mounting portion. Is.
  • the refractive index of the material of the above-mentioned porous structure can be measured, for example, using an Abbe refractometer (Na light source, wavelength: 589 nm) according to JIS K 0062: 1992 and JIS K 7142: 2014.
  • Materials having a refractive index of 1.45 or less that form the porous structure include fluororesins such as polytetrafluoroethylene resin, polyvinylidene difluorolide resin, and polychlorotrifluoroethylene resin, and plastic resins such as silicon resin.
  • Materials include metal oxide materials such as silicon dioxide, inorganic materials such as sodium fluoride, magnesium fluoride and calcium fluoride.
  • the tip of the main body member of the cryopreservation jig of the present invention is in the shape of a strip, and in the plane of the sheet-shaped strip, when the long side direction of the strip is the major axis direction, the direction of the minor axis is orthogonal to it.
  • the length (width of the strip, that is, the short side of the strip) is 70% or more of the inner diameter of the cap member.
  • the inner diameter of the cap member is the maximum diameter of the lumen when the cap member is viewed from the opening side.
  • the strip-shaped tip of the main body member of the cryopreservation jig of the present invention has a length in the minor axis direction of 70% or more of the inner diameter of the cap member and a major axis direction of the lumen of the cap member. Since the length of the main body member is 200% or less of the length of the tip portion in the major axis direction, the strip-shaped tip portion having the mounting portion is covered with the cap member during the freezing operation. Then, when the cells or tissues placed in the lumen of the cap member are cooled and frozen by being immersed in a cooling solvent after being combined and fixed, the cells or tissues placed in the lumen of the cap member can be quickly cooled.
  • the cavity of the cap member is large with respect to the tip portion including the mounting portion, and rapid cooling is not performed. It may not be preferable.
  • the main body member of the cryopreservation jig of the present invention preferably has a grip portion, in which case the grip portion is prismatic for the purpose of improving gripability and operability.
  • the grip portion is preferably a member made of a material resistant to a cooling solvent such as liquid nitrogen.
  • a material for example, various metals such as aluminum, iron, copper and stainless steel, ABS resin, acrylic resin, polypropylene resin, polyethylene resin, fluororesin and various engineering plastics, and glass can be preferably used. ..
  • the front surface or the back surface of the grip portion may have a marking portion for the purpose of facilitating the identification of the front and back surfaces of the mounting portion.
  • a characteristic structure for example, a concave portion or a convex portion
  • the freeze-thaw method using the cryopreservation jig of the present invention carries out a freezing step, a cold insulation step, and a thawing step.
  • the freezing step first, cells or tissues are placed together with the preservation solution on the placement portion of the cryopreservation jig. It is preferable that such work is performed under a transmission type microscope observation (hereinafter, also simply referred to as a microscope observation).
  • a transmission type microscope observation hereinafter, also simply referred to as a microscope observation.
  • the mounting portion of the cryopreservation jig has a preservation solution absorber, excess preservation solution can be effectively removed, so that high operability can be obtained and cells or cells or High freezing and thawing rates are easy to obtain because less preservation solution is present around the tissue.
  • the tip portion Since the length of the main body member is 200% or less of the length of the tip portion in the major axis direction, the tip portion is inserted into the cap member, and the cap member is fitted and fixed to the combined structure portion.
  • the operation can be performed with suitable workability, and the cells or tissues placed on the mounting portion located in the lumen of the cap member can be quickly cooled.
  • the time from loosening the fitting / fixing of the main body member and the cap member to immersing the mounting portion in the melting liquid is within 5 minutes. More preferably, it is within 1 minute. If the sealing / fixing is loosened and the sealed state is opened for a long time, a gas such as nitrogen or oxygen may enter the cap and then be cooled and liquefied. If the liquefied gas adheres to the mounting portion and is brought into the melt during the melting step, the temperature of the melt may be lowered, which is not preferable.
  • the length of the cavity of the cap member in the long axis direction is 200% or less of the length of the tip portion of the main body member in the long axis direction.
  • the workability of separating the cap member and the main body member is good. In particular, it is easy to achieve the rapid thawing rate required by the vitrification freezing method, and the cells or tissues on the placement site can be transferred from the cryogenic state into the thawing solution, preferably in less than 1 second. it can. More preferably, it is within 0.75 seconds.
  • the cryopreservation jig of the present invention can be suitably used by the freeze-thaw method as described above.
  • the freezing step and the thawing step as described above are performed, the cells or tissues on the mounting portion are immersed in the thaw solution, and when the cells or tissues on the mounting portion are collected from the mounting portion, the adhesion of air bubbles on the mounting portion is suppressed. It is preferable because it exhibits excellent recovery workability during the melting step.
  • FIG. 1 is a schematic top view showing an example of a main body member of the cryopreservation jig of the present invention.
  • the main body member 2 shown in FIG. 1 has a grip portion 8, a combined structure portion 10, and a tip portion 4.
  • the tip portion 4 includes a mounting portion 5, a support 6, and a tip marking portion 7, and is attached to the combined structure portion 10.
  • the grip portion 8 has a grip portion marking portion 9 for identifying the side on which the cell or tissue is placed.
  • the tip of the tip portion 4, that is, the tip marking portion 7 has a substantially semicircular shape, and workability at the time of insertion into the cap member can be improved.
  • the combined structure portion 10 is a portion for fixing the cap member to the main body member 2.
  • the combined structure portion 10 has a conical trapezoidal tapered structure that narrows from the grip portion 8 toward the tip portion 4.
  • FIG. 2 is a side schematic view showing an example of a main body member of the cryopreservation jig of the present invention.
  • the grip portion 8 of the main body member 2 shown in FIG. 2 is provided with a recess in a part thereof, so that when the operator grips the main body member 2, the front and back surfaces of the tip portion 4 are identified, that is, cells or tissues are placed. It is easy to identify the mounting portion 5 side.
  • a grip portion marking portion 9 is provided for the purpose of identifying the front and back surfaces of the tip portion 4.
  • the tip portion 4 of the main body member 2 has a mounting portion 5 made of a storage liquid absorber and a tip marking portion 7 on a support 6.
  • the mounting portion 5 can be installed on the support 6 by adhering the two short sides of the mounting portion 5 via an adhesive layer (the adhesive layer is not shown in FIG. 2).
  • FIG. 3 is a side sectional view showing an example of a cap member of the cryopreservation jig of the present invention.
  • the figure shown in FIG. 3 illustrates the structure of the cavity 11 of the cap member 3 that covers the tip portion 4 of the main body member 2.
  • the cap member 3 has a structure in which only one end thereof is open, and a tapered structure for fitting with the matching structure portion 10 of the main body member 2 is formed in the vicinity of the opening 23.
  • the cap member 3 has a fixing portion 12 for fixing the cap member 3 to the fixture before the start of the melting step.
  • the fixing portion 12 has an uneven shape that matches the shape of the fixture 16 described later.
  • FIG. 4 is a side view of an example of the cap member of the cryopreservation jig of the present invention as viewed from the opening side.
  • the cap member 3 shown in FIG. 4 has a square columnar outer surface shape and has a cylindrical cavity 11.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of a state in which the main body member 2 and the cap member 3 are combined and fixed.
  • the cap member 3 shows an internal structure (cross-sectional structure) so that the appearance of the combined structure portion 10 and the tip portion 4 enclosed in the cap member 3 can be seen including the following figures.
  • the cap member 3 is completely aligned and fixed to the main body member 2 by the combined structure portion 10 of the main body member 2, and the tip portion 4 is formed by the cap member 3. Enclosed and sealed, completely protected from the external environment. If the light transmission of the material used for the cap member is not sufficient, it is difficult to distinguish the front and back sides of the tip portion 4, so it is preferable to provide the grip portion marking portion 9.
  • FIG. 6 is a schematic view showing a state in which cells and a preservation solution are placed on a cryopreservation jig.
  • the operator drops and adheres the cells 14 and the preservative solution 15 onto the mounting portion 5 attached to the tip portion 4 of the main body member 2.
  • the cell 14 is placed on the mounting portion 5.
  • the droplets of the preservation solution 15 that have been dropped and adhered are automatically removed from the excess preservation solution by the placement portion 5 made of the preservation solution absorber, and have a flat shape on the placement portion 5.
  • FIG. 7 is a schematic view showing a state in which the cap members are combined and fixed after the cells and the preservation solution are placed on the cryopreservation jig of the present invention.
  • the cells 14 are dropped and adhered to the mounting portion 5 of the main body member 2 together with the preservative solution 15, and after the cells 14 are placed, the cap member 3 is fitted and fixed to the main body member 2.
  • the cells 14 placed on the placement portion 5 are completely encapsulated and sealed by the cap member 3, and are completely protected from the external environment.
  • the boundary between the cap member 3 and the main body member 2 is the joint portion 13.
  • FIG. 8 is a schematic side sectional view showing an example of a fixture used in the freeze-thaw method using the cryopreservation jig of the present invention.
  • the fixture 16 has a slit portion 17 into which the cap member 3 is inserted, and the slit portion 17 has a slit fixing portion 18 for fixing the fixing portion 12 of the cap member 3.
  • FIG. 9 cells or tissues sealed by the cap member are located below the surface of the cooling solvent and the junction of the cap members is located above the surface of the cooling solvent prior to the start of the melting step.
  • FIG. 9 the fixing portion 12 of the cap member 3 included in the cryopreservation jig 1 is held and fixed by being inserted into the slit fixing portion 18 formed in a part of the slit portion 17 of the fixture 16. .. At this time, the joint portion 13 between the cap member 3 and the main body member 2 is located above the liquid level 21 of the cooling solvent 20 filled in the freezing container 19.
  • the cooling solvent does not come into contact with the tip 4 and the cell 14 and the preservation solution 15, but the cooled state of the cell or tissue is maintained, and the cell 14 is sufficiently cooled.
  • the cells or tissues can be transferred from the cryogenic state into the melting solution and quickly melted. That is, cells or tissues can be rapidly thawed without slowing the melting rate.
  • FIG. 10 is a schematic view showing a state in which the main body member and the cap member are separated and the mounting portion is immersed in the melting liquid.
  • the main body member 2 having the tip portion 4 and the mounting portion 5 attached to the tip portion 4 is a cap member only by pulling out the main body member 2. It is quickly separated from 3. After separation, the placing portion 5 is immersed in the melting solution 22, and the cells 14 are thawed and recovered in the melting solution 22.
  • the preservation solution used is one that is normally used for freezing cells such as eggs and embryos.
  • a preservative solution containing various antifreeze agents glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethylsulfoxide), etc.
  • a physiological solution such as the above-mentioned phosphate buffered saline, or various antifreeze agents in a large amount (at least preserved).
  • a preservative solution containing 10% by mass or more, more preferably 20% by mass or more with respect to the total mass of the solution can be used.
  • thawing solution one usually used for thawing cells such as eggs and embryos can be used.
  • thawing cells such as eggs and embryos
  • 1 M of a physiological solution such as the above-mentioned phosphate buffered saline for adjusting the osmotic pressure can be used.
  • a melt containing sucrose can be used.
  • Examples of cells to which the freeze-thaw method using the cryopreservation jig of the present invention can be used include eggs and embryos of mammals (for example, humans, cows, pigs, horses, rabbits, rats, mice, etc.). , Germ cells such as sperm; pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells). In addition, cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells can be mentioned.
  • the cells include fibroblasts, cancer-derived cells such as pancreatic cancer / liver cancer cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, nerve cells, chondrocytes, tissue stem cells, and the like. And adhesive cells such as immune cells.
  • tissues that can be cryopreserved and thawed include tissues composed of allogeneic or heterologous cells, such as tissues such as ovary, skin, corneal epithelium, periodontal ligament, and myocardium.
  • the present invention is particularly suitable for cryopreservation of tissues having a sheet-like structure (for example, cell sheets, skin tissues, etc.).
  • the jig for cryopreservation of the present invention is not limited to tissues directly collected from a living body, for example, cultured skin cultured and grown in vitro, a so-called cell sheet constructed in vitro, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-205516. It can also be suitably used for cryopreservation of artificial tissues such as the proposed tissue model having a three-dimensional structure.
  • the cryopreservation jig of the present invention is suitably used as a cryopreservation jig for cells or tissues as described above.
  • Example 1 The cryopreservation jig of Example 1 was produced in the form shown in FIGS. 1 and 3.
  • a polytetrafluoroethylene porous material (pore diameter 0.2 ⁇ m, void ratio) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd., using a polyethylene terephthalate resin film (total light transmittance 89%, haze value 2.3%) as a support and a preservation solution absorber. 71%, thickness 35 ⁇ m), using Henkel Japan Ltd. hot melt urethane resin Purmelt (registered trademark) QR 170-7141P as an adhesive layer, and fixing only both ends on the short axis side on the support. , A tip portion having a mounting portion was produced.
  • the grip portion and the combined structure portion of the main body member, and the cap member were manufactured using ABS resin.
  • the tip portion, the grip portion, and the combined structure portion were joined to prepare the cryopreservation jig of Example 1.
  • the length of the tip portion of the main body member of the cryopreservation jig of Example 1 in the minor axis direction is 1.75 mm, and the length in the major axis direction is 20 mm.
  • the inner diameter of the cap member of the cryopreservation jig of Example 1 is 2.1 mm, and the length of the lumen in the long axis direction is 35 mm.
  • Example 2 The cryopreservation jig of Example 2 was produced in the same manner as in Example 1 except that the length of the tip portion of the main body member in the minor axis direction was changed from 1.75 mm to 1.5 mm.
  • Example 3 The cryopreservation jig of Example 3 was produced in the same manner as in Example 2 except that the length of the lumen of the cap member in the long axis direction was changed from 35 mm to 40 mm.
  • Comparative Example 1 The cryopreservation jig of Comparative Example 1 was produced in the same manner as in Example 2 except that the support was used as the mounting portion without providing the storage liquid absorber.
  • Comparative Example 2 The cryopreservation jig of Comparative Example 2 was produced in the same manner as in Example 1 except that the length of the tip portion of the main body member in the minor axis direction was set to 0.7 mm instead of 1.75 mm.
  • Example 3 A cap member having a length in the longitudinal direction of the cavity of the cap member of 80 mm was produced. Further, the length of the main body member of the cryopreservation jig and the total length when the cap member is fitted and fixed to the main body member have a shape similar to that of the cryopreservation jig of Example 1, and are joined together.
  • the cryopreservation jig of Comparative Example 3 was produced in the same manner as in Example 1 except that the shape of the structural portion was expanded to the grip portion side.
  • the main body member is pulled out while the cap member is fixed to the fixture to separate it from the cap member, and the tip portion of the main body member is immersed in the melting liquid.
  • the required time was measured and evaluated according to the following criteria as "evaluation of workability in immersion in the melt during the melting process".
  • As the melting solution a medium having a composition containing 34% by mass of sucrose in the Medium 199 medium was used. These results are shown in Table 1.
  • ⁇ The operation time was within 0.75 seconds.
  • ⁇ The operation time exceeded 0.75 seconds and was within 1 second.
  • X The operation took more than 1 second.
  • the present invention relates to tests collected from living organisms including iPS cells, ES cells, commonly used cultured cells, embryos or eggs, as well as embryo transfer, artificial insemination, and artificial insemination of domestic animals such as cattle and animals. It can be used for cryopreservation and thawing of cells or tissues for use or transplantation, cells or tissues cultured in vitro.

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Abstract

本発明の目的は、細胞又は組織の凍結操作と融解操作の作業性に優れた凍結保存用治具を提供することである。 本発明は、短冊状の先端部を有する本体部材、及び、該本体部材の先端部を被包するキャップ部材を少なくとも有する細胞又は組織の凍結保存用治具であって、該先端部は保存液吸収体を有する載置部を少なくとも有し、該先端部の短軸方向の長さが該キャップ部材の内径の７０％以上であり、該キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが該先端部の長軸方向の長さの２００％以下である細胞又は組織の凍結保存用治具である。

Description

細胞又は組織の凍結保存用治具
　本発明は、細胞又は組織の凍結保存用治具に関する。
　細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。
　一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われたり、形質の変化が生じたりすることから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を保った状態で長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
　細胞又は組織の凍結保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／分の速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化する現象であるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
　また、細胞又は組織の凍結保存方法として、ガラス化凍結法も知られている。ガラス化凍結法とは、耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。
　前述した緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、上記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。これに対し、上記したガラス化凍結法では、操作の時間が短時間であり、特別な装置又は治具を必要としない。加えて、ガラス化凍結法は、氷晶を生じさせないことによって高い生存率が得られる。
　ガラス化凍結法を用いた細胞又は組織の凍結保存方法については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。
　ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。このように、ガラス化凍結法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。
　適切なガラス化凍結を成し得るために、凍結速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。さらに、凍結保存後の融解工程時においても、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で、融解速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。
　適切なガラス化凍結を成し得るための重要な因子である凍結速度と融解速度のうち、特に重要なのは、融解速度とされている。例えば、非特許文献２に記載されるように、迅速に凍結された細胞であっても、融解速度が遅い場合には生存率が低くなることが知られている。また特許文献３には、凍結したサンプルを急速融解法により融解することで、融解後のヒトｉＰＳ細胞由来神経幹細胞／前駆細胞の生存率が向上することが記載されている。
　一般に、ガラス化凍結法に関わる凍結保存用治具及び凍結保存方法としては、特許文献４において、哺乳動物胚または卵子を凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに十分な最少量のガラス化液で貼り付け、この容器を液体窒素に接触させて急速に冷却する方法が提案されている。該凍結保存方法の後に行われる融解方法は、上記の方法で保存した凍結保存用容器を液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３～３９℃の希釈液を注入し、凍結した胚または卵子を融解希釈するものである。この凍結保存用治具及び凍結保存方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウィルスや細菌に感染させるおそれがなく高い生存率で保存及び融解希釈することができるとされている。しかしながら、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子を貼り付ける凍結工程の難易度が高く、確実に胚または卵子を凍結保存用容器に載置されたことを確認することが難しかった。また、融解工程においても、希釈液を用いて融解するが、胚または卵子を載置した場所を視認しながら融解することが難しく、確実に胚または卵子を回収することが難しかった。さらには、凍結工程においてストローシーラーが必要であり、融解工程においてもストローカッターが必要であるなど、特別な器具が必要であり、煩雑なプロセスとなっていた。
　特許文献５では、熱伝導性部材を有した細胞保持部材と筒状収納部材を有した細胞凍結保存用具が記載されており、特許文献４の課題がある程度解決されている。特許文献５に記載されている凍結保存用具の使用方法として、顕微鏡下において、卵子を細胞保持部材に付着させ、細胞保持部材を筒状収納部材に収納した後に、液体窒素に浸漬してガラス化凍結する。その後に、筒状収納部材の開口部に蓋部材を装着し、液体窒素タンク内で保管する方法が記載されている。
　よりプロセスの少ないガラス化凍結法に関わる凍結保存用治具及び凍結融解方法として、特許文献６、特許文献７に記載されるような、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ（登録商標）法という方法が開示されている。該方法の凍結操作時は、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを備えた卵凍結保存用具を使用し、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、卵子が付着したフィルムを液体窒素に浸漬し、凍結する。一方、融解操作時には、卵付着保持用ストリップを保温された融解液に浸漬し、融解液中でフィルム上に載置された卵子又は胚を回収する。この方法では作業者の操作によって、卵子や胚は少量の保存液と共にフィルム上に載置され、かかる手法は操作の難度が高いといった問題があるものの、高い生存率で卵子又は胚を凍結できることが知られている。
　特許文献８～１０では、細胞又は組織を、耐凍剤を多量に含む保存液と共に保存液除去材の上に載置し、細胞又は組織の周囲に付着した余分な保存液を除き、優れた生存率で凍結保存する方法が提案されている。特許文献８では、特定のヘーズ値を有する保存液吸収体が記載され、さらに特許文献９、特許文献１０には、保存液吸収体として多孔質焼結形成体や特定の屈折率を有する素材で形成された多孔質構造体を有するガラス化凍結保存用治具が記載されている。
　特許文献１１には、短冊状の光透過性を有したベース部を有し、さらに該ベース部上の一部に吸水部（保存液吸収体）に取り囲まれた欠損部が設けられることにより、過剰な保存液の除去操作が不要な生体細胞凍結保存用具の例が記載されている。また、特許文献１１には上記した欠損部に、卵子を少量のガラス化液と共に載置し、卵付着保持用ストリップを含む凍結保存用治具全体を筒状の収納容器に収納した後に、液体窒素に浸漬して、ガラス化凍結する凍結保存方法が記載されている。
特許第３０４４３２３号公報 特開２００８－５８４６号公報 特開２０１７－１０４０６１号公報 特開２０００－１８９１５５号公報 特許第５７９８６３３号公報 特開２００２－３１５５７３号公報 特開２００６－２７１３９５号公報 特開２０１４－１８３７５７号公報 特開２０１５－１４２５２３号公報 国際公開第２０１５／０６４３８０号 国際公開第２０１９／００４３００号
Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３４５：１７０－１７２（１９９０） 僧都博著「生細胞の凍結による障害と保護の機構」化学と生物　第１８巻（１９８０）２号　Ｐ．７８～８７　日本農芸化学会発行
　特許文献５では、熱伝導性部材を有した細胞保持部材と筒状収納部材を有した細胞凍結保存用具が提案されているが、凍結工程時に、筒状収納部材に蓋部材を取り付けるなどの工程があり、煩雑であった。また、融解工程の際には、筒状収納部材に収納された細胞保持部材を取り出すために、蓋部材を外す操作の他にも、取り出すための器具が必要になるなどして、煩雑であった。
　特許文献６、特許文献７では、卵子又は胚を載置するフィルムの幅を制限することにより、少ない量の保存液とともに卵子又は胚を凍結保存し、優れた生存率を得る凍結保存用治具が提案されており、よりプロセスの少ないガラス化凍結法が提案されている。しかしながら、これらの方法は、いくつかの問題を有していた。まず、凍結操作時においては、幅が制限されたフィルム上に、卵子又は胚を保存液と共に滴下し、凍結し、その後、筒状収納部材に収納するが、幅が制限されたフィルムの先端を筒状収納部材に収納する際、固化したガラス化液及び卵子又は胚が、筒状収納部材の端面に接触し、誤って脱落するおそれがあった。また、卵子又は胚を融解・回収する融解操作時に、フィルム上に気泡が付着し、顕微鏡観察下において載置された胚又は卵子と気泡の区別がつきづらいといった問題があった。さらには、融解操作時に、フィルム上に付着した気泡が卵子又は胚に付着し、これらの視認が阻害されるほか、気泡の浮力により卵子又は胚が不意に顕微鏡視野から外れてしまい、見失うといった問題があり、胚又は卵子の回収作業を阻害するといった問題もあった。
　特許文献８～１０では、卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を取り除く吸収性能を備えた凍結保存用治具により、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法が提案されている。しかしながら、特許文献６、特許文献７と同様、融解操作時において生じる気泡の影響に関しては解決されないままであった。
　特許文献１１では、卵を載置した本体部を、筒状収納容器に収納する凍結保存用治具が記載されているが、特許文献５と同様に、融解工程の際に、切断器具や取り出し器具が必要なことなどにより、収納された凍結保存用治具を取り出す操作が煩雑となり、結果的に、融解工程が煩雑であった。また、特許文献６、特許文献７での課題と同様に、卵子又は胚を保存液と共に載置後に、筒状部材に収納する際の、脱落のおそれについては依然として改善されないままであった。
　本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、凍結工程の際に、少ない量の保存液と共に卵子又は胚を凍結保存することが可能でありながら、載置部を筒状部材に収納する際に細胞又は組織の脱落のおそれがない、優れた挿入作業性を有し、加えて、融解工程の際には、煩雑な操作を必要とせずに、短時間で融解工程を行うこと、及び気泡の付着を抑制することで、融解液中で優れた視認性にて細胞又は組織を回収可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞又は組織の凍結保存用治具（以下、「本発明の凍結保存用治具」とも言う。）によって、上記課題を解決できることを見出した。
　本発明は、短冊状の先端部を有する本体部材、及び、該本体部材の先端部を被包するキャップ部材を少なくとも有する細胞又は組織の凍結保存用治具であって、該先端部は保存液吸収体を有する載置部を少なくとも有し、該先端部の短軸方向の長さが該キャップ部材の内径の７０％以上であり、該キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが該先端部の長軸方向の長さの２００％以下であることを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具である。
　本発明によれば、凍結工程の際に、少ない量の保存液と共に卵子又は胚を凍結保存することが可能でありながら、載置部をキャップ部材に収納する際に胚又は卵子の脱落のおそれがない、優れた挿入作業性を有し、加えて、融解工程の際には、煩雑な操作を必要とせずに、短時間で融解工程を行うこと、及び融解液中で優れた視認性にて細胞又は組織を回収可能な細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することができる。
本発明の凍結保存用治具の本体部材の一例を示す上面概略図である。 本発明の凍結保存用治具の本体部材の一例を示す側面概略図である。 本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の一例を示す側面断面図である。 本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の一例を開口部側から見た側面図である。 本体部材とキャップ部材を篏合・固定した状態の一例を示す概略図である。 本発明の凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した状態を示す側面概略図である。 本発明の凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した後に、キャップ部材を篏合・固定した状態を示す側面概略図である。 本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法で用いる固定具の一例を示す断面概略図である。 融解工程の開始前に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態を示す概略図である。 本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬した状態を示す概略図である。
　本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織をいわゆるガラス化凍結保存法において凍結保存する際に、好適に用いられるものである。本発明において、細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。本発明の凍結保存用治具は、卵子又は胚の凍結保存において、特に好適に用いることができる。
　本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置後に、極低温の冷却溶媒を用いて凍結させる凍結工程と、凍結された状態を維持する保冷工程、及び細胞又は組織を融解液中で融解・解凍し、これを回収する融解工程の一連の作業で用いられる。
　本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織の保存用具、細胞又は組織の凍結保存器具、細胞又は組織の保存用器具等と言い換えることができる。
　以下に本発明の凍結保存用治具について詳細に説明する。
　本発明の凍結保存用治具は、短冊状の先端部を有する本体部材、及び、該本体部材の先端部を被包可能なキャップ部材を有する。本体部材は棒状で、一方の端部に先端部を有する。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材が有する先端部は短冊状である。当該短冊状の先端部は、先端部の長辺方向が本体部材の長さ方向に平行になるように設けられている。短冊状であると載置部をキャップ部材によって被包・保護することが容易である。
本発明の凍結保存用治具のキャップ部材は、載置部を被包保護可能な内腔を有する。なお、キャップ部材は、開口した片端と閉塞した片端を有し、略四角柱状であることが好ましい。キャップ部材の内腔は、略円筒形状であることが好ましい。
　本発明の凍結保存用治具のキャップ部材は、本体部材に対して着脱自在であることが好ましい。着脱自在とは、特別な器具を必要とせずに、キャップ部材を本体部材に対して容易に篏合・固定することができ、キャップ部材を本体部材から容易に外すことができることを意味する。着脱自在を可能とするために、本体部材は先端部側に篏合構造部を有することが好ましく、本体部材は該篏合構造部として、テーパー構造又はねじ切り構造を有することが好ましい。迅速かつ容易に着脱できる観点から、該篏合構造部はテーパー構造を有することがより好ましい。本体部材の篏合構造部が、ねじ切り構造を有する場合には、キャップ部材もねじ切り構造を有することが好ましい。また、本体部材の篏合構造部がテーパー構造を有する場合には、より確実に篏合・固定する観点から、キャップ部材もテーパー構造を有することが可能である。
　本発明の凍結保存用治具のキャップ部材は、例えば、各種樹脂、金属等の液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材を用いて形成することができる。キャップ部材は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂は射出成型等のプロセスにより、テーパー構造やねじ切り構造を容易に形成できるため、好ましい。樹脂の具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂が挙げられる。また、キャップ部材の全光線透過率が８０％以上であると、キャップ部材を篏合後に、キャップ内部の載置部の様子を容易に確認することができるため好ましい。
　本発明の凍結保存用治具が有するキャップ部材は、融解工程の開始前に利用する固定具に固定するための固定部位を有することが好ましい。キャップ部材が有する固定部位は、固定具の形状に合わせて、凹部や凸部等の任意の凹凸形状とすることができる。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材が有する先端部は保存液吸収体を有する載置部を少なくとも有する。載置部が保存液吸収体を有すると、該保存液吸収体により、細胞又は組織の周囲に存在する余分な保存液を効果的に除去することができるため、細胞又は組織を載置し凍結する時の操作性が向上する。保存液吸収体としては、例えば金網、紙等や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが例示される。その他の保存液吸収体として、屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体が例示される。該多孔質構造体により、細胞又は組織の周囲に存在する保存液を除去することができる。また、該多孔質構造体により、透過型の光学顕微鏡観察下において、細胞又は組織を載置し凍結する操作及び凍結後に融解する操作を、良好な視認性にて容易かつ確実に行うことができる。
　本発明の凍結保存用治具は載置部に保存液吸収体を有することにより、載置部に載置した保存液の形状を扁平にすることができる。また、細胞又は組織を載置後に、極低温の冷却溶媒で凍結・固化させる際には、細胞又は組織の周囲の保存液は、保存液吸収体内に吸収された部分と連続しており、結果として、極低温の冷却溶媒での凍結・固化の後に、細胞又は組織が載置部から脱落することなく、細胞又は組織とその周囲の保存液を載置部上に確実に保持することが可能である。
　上記した多孔質構造体の素材の屈折率は、例えば、アッベ屈折計（Ｎａ光源、波長：５８９ｎｍ）を用いてＪＩＳ　Ｋ　００６２：１９９２、ＪＩＳ　Ｋ　７１４２：２０１４に準じて測定できる。多孔質構造体を形成する屈折率が１．４５以下の素材としては、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリビニリデンジフロライド樹脂、ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂などのフッ素樹脂やシリコン樹脂のようなプラスチック樹脂材料、二酸化ケイ素のような金属酸化物材料、フッ化ナトリウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウムのような無機材料が挙げられる。
　多孔質構造体による保存液吸収体の細孔径は５．５μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．７５μｍ以下である。これにより光学顕微鏡観察下における細胞又は組織の視認性を高めることができる。保存液吸収体の厚みは、１０～５００μｍであることが好ましく、より好ましくは２５～１５０μｍである。なお、保存液吸収体の細孔径は、プラスチック樹脂材料の多孔質構造体の場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また金属酸化物材料あるいは無機材料の多孔質構造体の場合には、該多孔質構造体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。
　保存液吸収体の空隙率は３０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上である。空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称　Ａｕｔｏｐｏｒｅ　ＩＩ　９２２０、製造者　ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
　Ｐ：空隙率（％）
　Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ２）
　Ｔ：厚み（μｍ）
　本発明の凍結保存用治具の本体部材の先端部は、保存液吸収体を有する載置部の他に支持体を有することができる。支持体としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられ、１種類の素材のみからなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものであっても良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材の先端部が支持体を有する場合に、熱伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で、支持体として金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。
　上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ～１０ｍｍであることが好ましい。また目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面を、例えばコロナ放電処理のような電気的な方法や、あるいは化学的な方法により親水化することもでき、さらには粗面化することも可能である。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材が有する先端部は短冊状であり、シート状の短冊の面内において、短冊の長辺方向を長軸方向とした時に、それと直交する短軸方向の長さ（短冊の幅、すなわち短冊の短辺）は、キャップ部材の内径の７０％以上である。キャップ部材の内径とは、キャップ部材を開口部側から見たときの、内腔の最大径のことである。先端部の短軸方向の長さが、上記の範囲であると、細胞又は組織が保存液と共に載置された載置部をキャップ部材に挿入して収納する際に、キャップ部材の開口部側の端部に、保存液及び細胞又は組織が触れて脱落するおそれがなく、キャップ部材で被包することができる。先端部の短軸方向の長さが７０％未満の場合には、上記の収納作業の際に、先端部がたわむなどした場合に、キャップ部材の開口部側の端部に、保存液及び細胞又は組織が触れて脱落することがある。なお、短冊状の先端部の短軸方向の長さがキャップ部材の内径の７０％以上、９５％以下であると、挿入する際の作業性が良好であり、好ましい。また、短冊状の先端部は、長軸方向に延びるシートの端辺（長辺）が平行（短冊の幅が一定）であることが好ましいが、短冊の中心線が長軸方向に直線状に延びていれば平行でなくても構わない。その場合は、短冊の最大幅を先端部の短軸方向の長さとする。さらには、先端部の短軸方向の長さは、キャップ部材の内腔の最小径よりも小さいことが好ましい。
　本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の内腔の長軸方向の長さは、本体部材が有する先端部の長軸方向の長さの２００％以下である。キャップ部材の内腔の長軸方向の長さとは、キャップ部材の内腔の空間が延びる方向において、キャップ部材の開口した片端から閉塞した片端までの内腔の空間の長さのことである。キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが上記の範囲であると、凍結操作の際に、細胞又は組織を載置後、先端部が有する載置部を被包するためのキャップ部材を挿入し、取り付ける作業を好適な作業性で行うことができる。また、融解工程の際に、先端部を有する本体部材とキャップ部材を迅速に分離することが可能である。キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが、本体部材が有する長軸方向の長さの２００％を超える場合として、例えば特許文献１１に記載・図示されるような、テーパー構造等の篏合構造部を把持部に近い側に設けたような凍結保存用治具が知られているが、このような形態であると、融解工程の際に、キャップ部材と本体部材を迅速に分離することが難しい。また、先端部をキャップ部材により被包・保護する観点から、本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の内腔の長軸方向の長さは、本体部材が有する先端部の長軸方向の長さの１０５％以上であることが好ましい。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材が有する短冊状の先端部は、短軸方向の長さがキャップ部材の内径の７０％以上であり、かつ、該キャップ部材の内腔の長軸方向の長さは、本体部材が有する該先端部の長軸方向の長さの２００％以下であることから、凍結操作の際に、載置部を有する短冊状の先端部をキャップ部材で被包し、篏合・固定した後に、冷却溶媒に浸漬して冷却・凍結する際に、キャップ部材の内腔中に載置された細胞又は組織を迅速に冷却することができる。例えば、特許文献６に記載・図示されるような従来知られている凍結保存用治具では、載置部を含む先端部に対して、キャップ部材の内腔が大きく、迅速な冷却がなされないことがあり、好ましくない。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材は作業性の観点から把持部を有することが好ましく、その場合、把持部は、把持のしやすさや、操作性の向上を目的として、角柱状であることが好ましい。該把持部は、液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材により形成された部材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミニウム、鉄、銅、ステンレスなどの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラスなどを好適に用いることができる。
　本発明の凍結保存用治具の本体部材が把持部を有する場合、載置部の表裏の識別を容易にする目的で、把持部の表面又は裏面は、マーキング部を有することができる。また、同様の目的で、例えば、把持部の表面の一部には、特徴的な構造（例えば凹部又は凸部）を形成することもできる。
　以上、本発明の凍結保存用治具について説明した。次に、本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法の一例について説明する。
　本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法は、凍結工程、保冷工程、融解工程を行う。凍結工程では、第一に、凍結保存用治具が有する載置部に細胞又は組織を保存液と共に載置する。かかる作業は透過型の顕微鏡観察下（以下、単に顕微鏡観察下とも記載）において行うことが好ましい。この時、凍結保存用治具が有する載置部は保存液吸収体を有することから、余分な保存液を効果的に除去することができるため、高い操作性が得られることに加え、細胞又は組織の周囲に存在する保存液をより少ないものとできるために、高い凍結速度と融解速度を得ることが容易である。
　次いで、第二に、本体部材の載置部を含む先端部をキャップ部材に挿入し、キャップ部材を篏合・固定する。キャップ部材へ先端部を挿入する操作は、顕微鏡観察下で行っても良い。この際に、本発明の凍結保存用治具は、先端部の短軸方向の長さがキャップ部材の内径の７０％以上であることに加えて、載置部上に載置された保存液の液滴は、保存液吸収体の作用により載置部上で扁平な形状となることから、キャップ部材の端部に保存液及び細胞又は組織が触れて、脱落するおそれがなく、載置部を含む先端部をキャップ部材で被包することができる。先端部は、キャップ部材に挿入後、キャップ部材で完全に被包し、キャップ部材を本体部材の篏合構造部に篏合・固定することで完全に密閉することができる。
　次いで、第三に、本体部材に篏合、固定したキャップ部材を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し、載置部上に載置した細胞又は組織を冷却・凍結する。この時、キャップ部材によって被包され、完全に密閉された載置部及び載置部上の細胞又は組織は冷却溶媒と接触せずに冷却される。本発明の凍結保存用治具の本体部材が有する短冊状の先端部は、短軸方向の長さがキャップ部材の内径の７０％以上であり、かつ、該キャップ部材の内腔の長軸方向の長さは、本体部材が有する該先端部の長軸方向の長さの２００％以下であることから、先端部をキャップ部材に挿入し、キャップ部材を篏合構造部に篏合・固定する操作を好適な作業性で行うことができ、キャップ部材の内腔の中に位置する載置部上に載置された細胞又は組織を迅速に冷却することができる。
　細胞又は組織を保存液と共に載置部に載置してから、密閉する操作を経て、キャップ部材で密閉された本体部材を冷却溶媒に浸漬するまでの時間は、１分以内であることが好ましい。より好ましくは３０秒以内である。上記凍結工程の所要時間が１分を超える場合には、細胞又は組織が耐凍剤を含む保存液の影響を強く受けることがあり、生存性の観点で好ましくない。本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の内腔の長軸方向の長さは、本体部材が有する先端部の長軸方向の長さの２００％以下であることから、上記の制限時間以内の作業においても高い作業性が得られる。
　次いで、冷却された細胞又は組織は、そのガラス化凍結状態を維持したまま、冷却溶媒等により極低温が保たれた低温保管容器の中で保冷される。かかる工程はいわゆる保冷工程である。
　融解工程に先立って、本発明の凍結保存用治具のキャップ部材が固定部位を有する場合には、キャップ部材が好ましく有する固定部位を利用して、キャップ部材の固定機能を有した固定具を用いて凍結保存用治具を保持することができる。キャップ部材の固定部位を利用して固定具に本発明の凍結保存用治具を固定させて固定具と共に冷却溶媒に浸漬すると、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織を、冷却溶媒の液面よりも下方に位置させ、かつ凍結保存用治具のキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持することが容易であり、好ましい。
　上記した固定具は、好ましくは凍結保存用治具のキャップ部材が挿入・固定されるスリット部を有する。また、スリット部は、上記したキャップ部材が有する固定部位を固定するためのスリット固定部を有することが好ましい。上記固定具が有するスリット部は１ヶ所でも良いし、複数ヶ所でも良い。
　本発明において固定具は、上述したキャップ部材と同様、液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材により形成されることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミニウム、鉄、銅、ステンレスなどの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラスなどを好適に用いることができる。自重が大きく、凍結保存用治具を良好に固定できる観点から、金属製の固定具が好ましい。
　本発明の凍結保存用治具の載置部は、融解工程の開始前においては、キャップ部材によって密閉されており、載置部に載置された細胞又は組織の位置は冷却溶媒の中にあるが、本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒中に入らない状態で一旦保持し、次いで、本体部材とキャップ部材の篏合・固定を緩め、その後キャップ部材と本体部材を分離することが好ましい。かかる分離の後、載置部を融解液に浸漬する融解工程を行うことが好ましい。融解工程前のこれらの操作により、本体部材が有する載置部は液体窒素等の冷却溶媒に接触することなく、融解液中に迅速に浸漬することができる。
融解工程において、本体部材とキャップ部材の篏合・固定を緩めてから、載置部を融解液に浸漬するまでの時間は５分以内であることが好ましい。より好ましくは１分以内である。篏合・固定を緩め、密閉状態が開放された状態が長い場合、窒素や酸素等の気体が、キャップ内に入り込み、次いで冷却されて、液化することがある。液化された気体が載置部に付着し、融解工程の際に融解液中に持ち込まれると、融解液の温度を下げるおそれがあり、好ましくない。
　本発明の凍結保存用治具は、キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが、本体部材が有する先端部の長軸方向の長さの２００％以下であることから、上記融解工程における、キャップ部材と本体部材を分離する作業性が良好である。特に、ガラス化凍結法で求められる迅速な融解速度を達成することが容易であり、載置部上の細胞又は組織を極低温の状態から、好ましくは１秒未満で融解液中に移すことができる。より好ましくは０．７５秒以内である。
　本発明の凍結保存用治具は、上記のような凍結融解方法で好適に使用できる。上記のような凍結工程及び融解工程を行うと、載置部上の細胞又は組織を融解液中に浸漬し、載置部上から回収する際に、載置部上への気泡の付着が抑制され、融解工程時に優れた回収作業性を示すことから好ましい。
　以上、本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法について説明した。次に、本発明の凍結保存用治具やそれを用いた凍結融解方法の中で好ましく用いる固定具について、図面に沿ってさらに詳細に説明する。
　図１は、本発明の凍結保存用治具の本体部材の一例を示す上面概略図である。図１に示す本体部材２は把持部８と篏合構造部１０と先端部４を有する。先端部４は載置部５と支持体６、及び先端マーキング部７を備え、篏合構造部１０に付設されている。把持部８は、細胞又は組織を載置する側を識別するための把持部マーキング部９を有する。先端部４の先端、すなわち先端マーキング部７は略半円状で、キャップ部材への挿入の際の作業性を高めることができる。また、篏合構造部１０はキャップ部材を本体部材２に固定するための部位である。図１において、篏合構造部１０は、把持部８から先端部４に向かって細くなる円錐台形のテーパー構造を有している。
　図２は、本発明の凍結保存用治具の本体部材の一例を示す側面概略図である。図２に示す本体部材２が有する把持部８はその一部に凹部を設けることにより、操作者が本体部材２を把持した際に、先端部４の表裏の識別、すなわち細胞又は組織を載置する載置部５側の識別を容易としている。同様に先端部４の表裏を識別する目的で、把持部マーキング部９を備えている。本体部材２の先端部４は支持体６上に保存液吸収体からなる載置部５と先端マーキング部７を有する。支持体６上へ載置部５の設置は、載置部５の短辺二辺を接着層を介して接着するなどして行うことができる（図２には接着層は示さない）。
　図３は、本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の一例を示す側面断面図である。図３に示す図は、本体部材２の先端部４を被包するキャップ部材３の内腔１１の構造を図示したものである。キャップ部材３はその一端のみが開口した構造であり、開口部２３の近傍には、本体部材２の篏合構造部１０と篏合するためのテーパー構造が形成されている。また、キャップ部材３は、融解工程の開始前に、キャップ部材３を固定具に固定するための固定部位１２を有する。固定部位１２は、後述の固定具１６の形状に合わせた凹凸形状を有する。
　図４は、本発明の凍結保存用治具のキャップ部材の一例を開口部側から見た側面図である。図４に示すキャップ部材３は、四角柱状の外面形状を有し、円筒形状の内腔１１を有する形状である。
　図５は、本体部材２とキャップ部材３を篏合・固定した状態の一例を示す概略図である。なお、以下の図も含めて、キャップ部材３に被包されている篏合構造部１０及び先端部４の様子が分かるように、キャップ部材３は内部構造（断面構造）を図示している。図５に示す凍結保存用治具１は、本体部材２が有する篏合構造部１０により、キャップ部材３が本体部材２に完全に篏合・固定され、先端部４は、キャップ部材３によって、被包・密閉され、外部環境から完全に保護されている。キャップ部材に用いる素材の光透過性が十分でない場合には先端部４の表裏の識別が困難であるために、把持部マーキング部９を設けることが好ましい。
　図６は、凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した状態を示す概略図である。本発明の凍結保存用治具１を用いた凍結融解方法において、操作者は、本体部材２の先端部４に付設された載置部５上に、細胞１４と保存液１５を滴下付着し、細胞１４を載置部５上に載置する。滴下付着された保存液１５の液滴は、保存液吸収体からなる載置部５により、余分な保存液が自動的に除去されるとともに、載置部５上で扁平な形状となる。
　図７は、本発明の凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した後に、キャップ部材を篏合・固定した状態を示す概略図である。本体部材２の載置部５上に保存液１５と共に、細胞１４を滴下付着し、載置した後に、キャップ部材３を本体部材２に篏合・固定する。これにより、載置部５上に載置された細胞１４は、キャップ部材３により完全に被包・密閉され、外部環境から完全に保護されている。キャップ部材３と本体部材２の境目が接合部１３である。
　図８は、本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法で用いる固定具の一例を示す側面断面概略図である。図８において、固定具１６は、キャップ部材３が挿入されるスリット部１７を有し、スリット部１７はキャップ部材３の固定部位１２を固定するための、スリット固定部１８を有する。
　図９は、融解工程の開始前に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態を示す概略図である。図９において、凍結保存用治具１が有するキャップ部材３の固定部位１２は、固定具１６のスリット部１７の一部に形成されたスリット固定部１８に差し込まれることで、保持・固定される。この時、キャップ部材３と本体部材２との接合部１３は、凍結容器１９に充填された冷却溶媒２０の液面２１よりも上部に位置している。そのため、凍結保存用治具１の本体部材２とキャップ部材３の篏合・固定を緩め、篏合を解除した場合にも、周囲の冷却溶媒が直接的にキャップ部材３の内部に侵入することはない。すなわち、冷却溶媒は、先端部４には接触せず、細胞１４及び保存液１５にも接触しないが、細胞又は組織の冷却状態は維持されており、細胞１４は十分に冷却される。このようにすることで、その後の融解工程において、細胞又は組織を極低温の状態から融解液中に移し、迅速に融解することができる。すなわち、融解速度を低下させることなく細胞又は組織を迅速に融解することができる。
　図１０は、本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬した状態を示す概略図である。図１０において、キャップ部材３が固定具１６に固定されることにより、本体部材２を引き抜く操作のみで、先端部４と先端部４に付設された載置部５を有する本体部材２はキャップ部材３から迅速に分離される。分離後、載置部５を融解液２２に浸漬し、融解液２２中で細胞１４を融解・回収する。
　本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法を用いて細胞又は組織を凍結保存・融解する場合、保存液は、卵子、胚等の細胞の凍結のために通常使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に各種耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等）を含有する保存液や、各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含有する保存液を使用できる。融解液についても、卵子、胚等の細胞の融解のために通常使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に、浸透圧調整のために１Ｍのスクロースを含有する融解液を使用することができる。
　本発明の凍結保存用治具を用いた凍結融解方法を用いることができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存・融解することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織等）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２－２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。
　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　図１及び図３に示す形態で、実施例１の凍結保存用治具を作製した。ポリエチレンテレフタレート樹脂フィルム（全光線透過率８９％、ヘーズ値２．３％）を支持体として、保存液吸収体として、アドバンテック東洋社製のポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を、ヘンケルジャパン社製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ（登録商標）ＱＲ　１７０－７１４１Ｐを接着層として、短軸側の両端二辺のみを該支持体上に貼り合わせて固定し、載置部を有する先端部を作製した。また、本体部材の把持部及び篏合構造部と、キャップ部材を、ＡＢＳ樹脂を用いて作製した。先端部と把持部及び篏合構造部を接合し、実施例１の凍結保存用治具を作製した。実施例１の凍結保存用治具の本体部材が有する先端部の短軸方向の長さは１．７５ｍｍであり、長軸方向の長さは２０ｍｍである。また、実施例１の凍結保存用治具のキャップ部材の内径は２．１ｍｍであり、内腔の長軸方向の長さは３５ｍｍである。
（実施例２）
　本体部材が有する先端部の短軸方向の長さを、１．７５ｍｍにかえて１．５ｍｍとした以外は、実施例１と同様にして、実施例２の凍結保存用治具を作製した。
（実施例３）
　キャップ部材の内腔の長軸方向の長さを、３５ｍｍにかえて４０ｍｍとした以外は、実施例２と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。
（比較例１）
　保存液吸収体を設けずに、支持体をそのまま載置部とした以外は、実施例２と同様にして、比較例１の凍結保存用治具を作製した。
（比較例２）
　本体部材が有する先端部の短軸方向の長さを、１．７５ｍｍにかえて０．７ｍｍとした以外は、実施例１と同様にして、比較例２の凍結保存用治具を作製した。
（比較例３）
　キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが８０ｍｍとなるようなキャップ部材を作製した。また、凍結保存用治具の本体部材の長さ及び、キャップ部材を本体部材に篏合・固定した際の全長は実施例１の凍結保存用治具と同じになるような形状で、篏合構造部の形状を把持部側に拡張した以外は、実施例１と同様にして、比較例３の凍結保存用治具を作製した。
＜凍結工程時のキャップ部材の挿入作業性の評価＞
　実施例１～３及び比較例１～３の凍結保存用治具の載置部上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として、保存液０．１μＬと共に、透過型顕微鏡下で滴下付着させた。なお、保存液は、シグマアルドリッチ社製　Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地に、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、１７質量％スクロースが含まれる組成のものを用いた。次いで、透過型顕微鏡下で、載置部を含む先端部をキャップ部材に挿入した。その際に、キャップ部材の開口部側の端面に載置部上に載置された保存液が接触してしまうか否かの評価を５回行い、「凍結工程時のキャップ部材の挿入作業性の評価」として以下の基準で評価した。これらの結果を表１に示す。
○：５回の評価の中で、保存液がキャップ部材の開口部側の端面に接触してしまうことが１回もなかった。
×：５回の評価の中で、保存液がキャップ部材の開口部側の端面に接触してしまうことが１回以上あった。
＜融解工程時の融解液浸漬における作業性の評価＞
　上記と同様の手順により、実施例１～３及び比較例１～３の細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に疑似細胞を保存液と共に載置部へ滴下付着し、本体部材にキャップ部材を完全に篏合・固定した後に、液体窒素に浸漬して凍結した。保冷工程の後に、融解工程に先立って、図８に示す形態の固定具に、図９に示す形態で本体部材を固定した。その後、疑似細胞が液体窒素の液面よりも下にある状態を維持し、かつ、液体窒素に触れないようにしながら、キャップ部材の篏合・固定をわずかに緩めた。次いで、図１０に示す形態のように、キャップ部材を固定具に固定したまま、本体部材を抜き取ることで、キャップ部材と分離し、本体部材の先端部を融解液中に浸漬させ、この際の所要時間を計測し、「融解工程時の融解液浸漬における作業性の評価」として以下の基準で評価した。なお、融解液は、上記Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地に３４質量％スクロースが含まれる組成のものを用いた。これらの結果を表１に示す。
◎：操作にかかる時間が０．７５秒以内だった。
○：操作にかかる時間が０．７５秒を超え１秒以内だった。
×：操作に１秒を超える時間を要した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜融解工程時の回収作業における作業性の評価＞
　上記の「融解工程時の融解液浸漬における作業性の評価」と同様の方法により、実施例１～３及び比較例１～３の凍結保存用治具の載置部を有する先端部を融解液中に浸漬させた。その後、顕微鏡下で、融解液中の載置部及び載置部上の疑似細胞の様子を観察した。その際の融解液中で観察される載置部上の気泡の付着の有無を確認したが、実施例１～３及び比較例１～３の全ての凍結保存用治具において、載置部上への気泡の付着は見られず、融解工程時の回収作業において、高い作業性を有することが示された。
　上記の結果から、本発明の凍結融解用治具は、凍結工程と融解工程の両方に優れた作業性を有することが分かる。また、細胞又は組織の融解が極めて短時間に行うことが可能であり、高い生存率が得られることが期待される。
　本発明は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織等の凍結保存及びその融解に用いることができる。
１　細胞又は組織の凍結保存用治具
２　本体部材
３　キャップ部材
４　先端部
５　載置部
６　支持体
７　先端マーキング部
８　把持部
９　把持部マーキング部
１０　篏合構造部
１１　キャップ部材の内腔
１２　固定部位
１３　接合部
１４　細胞
１５　保存液
１６　固定具
１７　スリット部
１８　スリット固定部
１９　凍結容器
２０　冷却溶媒
２１　液面
２２　融解液
２３　開口部

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  1. 　短冊状の先端部を有する本体部材、及び、該本体部材の先端部を被包するキャップ部材を少なくとも有する細胞又は組織の凍結保存用治具であって、該先端部は保存液吸収体を有する載置部を少なくとも有し、該先端部の短軸方向の長さが該キャップ部材の内径の７０％以上であり、該キャップ部材の内腔の長軸方向の長さが該先端部の長軸方向の長さの２００％以下であることを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
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