WO2015064380A1 - 細胞または組織のガラス化凍結保存用治具 - Google Patents

細胞または組織のガラス化凍結保存用治具 Download PDF

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WO2015064380A1
WO2015064380A1 PCT/JP2014/077646 JP2014077646W WO2015064380A1 WO 2015064380 A1 WO2015064380 A1 WO 2015064380A1 JP 2014077646 W JP2014077646 W JP 2014077646W WO 2015064380 A1 WO2015064380 A1 WO 2015064380A1
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WO
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vitrification
cells
tissues
cryopreservation
solution
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PCT/JP2014/077646
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健二 桃沢
篤史 松澤
須崎　活光
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学校法人北里研究所
三菱製紙株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • A01N1/0268—Carriers for immersion in cryogenic fluid, both for slow-freezing and vitrification, e.g. open or closed "straws" for embryos, oocytes or semen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/22—Means for packing or storing viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a vitrification cryopreservation jig used for cryopreserving biological cells or tissues.
  • embryos used in bovine embryo transfer technology are transplanted in accordance with the estrous cycle of the recipient cow, and the embryo is cryopreserved and matched to the estrous cycle in order to match the embryo transfer to the estrous cycle.
  • the embryo is thawed and transplanted.
  • human infertility treatment after collecting an egg or ovary from a mother, it is stored frozen in order to match the timing suitable for transplantation, and thawed at the time of transplantation.
  • a slow freezing method is known as a method for preserving cells or tissues.
  • cells or tissues are first immersed in a preservation solution obtained by adding a freezing-resistant agent to a physiological solution such as phosphate buffered saline.
  • a freezing-resistant agent such as phosphate buffered saline.
  • compounds such as glycerol and ethylene glycol are used.
  • the cells or tissues are cooled or cooled to ⁇ 30 to ⁇ 35 ° C. at a relatively slow cooling rate (for example, 0.3 to 0.5 ° C./min), thereby allowing intracellular or extracellular or tissue
  • a relatively slow cooling rate for example, 0.3 to 0.5 ° C./min
  • the vitrified cell or tissue can be stored semipermanently by storing it in liquid nitrogen.
  • the slow freezing method since it is necessary to cool at a relatively slow cooling rate, the operation for cryopreservation takes time. In addition, there is a problem of requiring a device or jig for temperature control. In addition, in the slow freezing method, since ice crystals are formed in the preservation solution outside the cells or tissues, the cells or tissues may be physically damaged by the ice crystals.
  • a vitrification preservation method has been proposed as a method for solving the problems in the slow freezing method.
  • the vitrification preservation method is based on the principle that it becomes difficult to form ice crystals even below freezing point due to the freezing point depression of an aqueous solution containing a large amount of antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol and DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • an aqueous solution containing a large amount of antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol and DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • vitrification preservation method As a specific operation of the vitrification preservation method, cells or tissues are immersed in a vitrification solution, and then cooled at a liquid nitrogen temperature ( ⁇ 196 ° C.). Since this is a simple and quick process, it does not require time for the operation for cryopreservation, and does not require a device or jig for temperature control.
  • vitrification preservation method when vitrification preservation method is used, since ice crystals do not form inside or outside the cells, physical damage to the cells during freezing and thawing (freezing damage) can be avoided, but it is included in the vitrification solution.
  • a high concentration of antifreeze has chemical toxicity, and it is preferable that the vitrification solution is not more than necessary when cryopreserving cells or tissues.
  • the time during which the cells or tissues are exposed to the vitrification solution that is, the time until freezing is short. Furthermore, it is necessary to dilute the vitrification solution immediately after thawing.
  • Patent Document 1 shows that application of a vitrification method to animal or human germ cells or somatic cells is extremely useful in terms of cryopreservation and survival after thawing.
  • the vitrification preservation method is a technique that has been developed mainly using human germ cells, but recently, its application to iPS cells and ES cells has been widely studied.
  • Non-Patent Document 1 shows that the vitrification preservation method was effective in preserving Drosophila embryos.
  • Patent Document 2 or Non-Patent Document 2 shows that the vitrification storage method is effective in storing plant cultured cells and tissues.
  • the vitrification preservation method is known to be useful for a wide variety of cells and tissues.
  • Patent Document 3 As a jig and operation method for performing the vitrification preservation method more efficiently, in Patent Document 3 and the like, an egg or an embryo is vitrified and frozen in a straw filled with a vitrification solution, and quickly when thawed. Attempts have been made to improve the regeneration rate by contacting with a diluent.
  • Patent Document 4 an excellent viability is obtained by removing an excess vitrification solution adhering to the periphery of an egg or embryo by placing the egg or embryo on a vitrification preservative removal material together with a vitrification solution and sucking from the lower part.
  • a method of cryopreserving is proposed.
  • a vitrification preservation liquid removal material what has a through-hole by the film-like thing which consists of natural products and synthetic resins, such as a wire net and paper, is described.
  • Patent Document 5 proposes a method of cryopreserving with an excellent survival rate by absorbing excess vitrification solution adhering to the periphery of an egg or embryo with an absorbent such as filter paper.
  • Patent Document 6 and Patent Document 7 a so-called cryotop method used in the field of human infertility treatment, a strip-like flexible and colorless and transparent film is used as a strip for holding eggs attached, A method has been proposed in which an egg or embryo is attached to a film together with a very small amount of vitrification solution under a microscope and cryopreserved.
  • Patent Document 3 has a problem that it takes a long time to freeze because the vitrification liquid is filled in the straw.
  • the size of cells or tissues that can be cryopreserved is limited to the inner diameter of the straw, it is difficult to preserve a sheet-shaped tissue such as a cell sheet.
  • Patent Document 4 proposes a method for cryopreserving these germ cells with an excellent survival rate by removing excess vitrification solution adhering to the periphery of the ovum or embryo.
  • the method described in Patent Document 4 requires a suction operation from the bottom when removing excess vitrification liquid, which is a complicated operation and is not suitable for performing vitrification cryopreservation operation in a short time. It is. Furthermore, if the suction from the lower part is insufficient, there is a problem that excess vitrification liquid remains.
  • Patent Document 5 proposes a method of cryopreserving these germ cells with excellent viability by absorbing an excess vitrification solution adhering to the periphery of an egg or embryo into an absorbent such as filter paper.
  • the vitrification preservation method is applied to a human ovum or embryo by the cryotop method, for example, the accuracy of the work for confirming the adhesion of the ovum or embryo to the absorber is required with high accuracy. Since it is difficult to observe the ovum or embryo adhering to the absorber under a commonly used transmission type optical microscope, it is extremely difficult to reliably confirm the attachment of the ovum or embryo. Met.
  • the methods proposed in Patent Document 6 and Patent Document 7 provide a compact egg cryopreservation tool that is easy to operate and does not occupy a cryopreservation space.
  • This egg cryopreservation device is provided with a flexible, colorless and transparent flat film (strip for holding egg adhesion) that can observe a human egg or embryo under a microscope, and a very small amount (0.1 ⁇ L) on the film.
  • the egg or embryo can be cryopreserved by attaching the egg or embryo dropwise with the vitrification solution.
  • the width of these films is usually 0.5 to 2 mm, and it is very difficult to accurately drop and attach a vitrification solution containing a very small amount of eggs or embryos unless they are skilled in operation.
  • many newcomers who stumble in the freezing operation of an ovum or embryo are operations that place an ovum or embryo on a sheet with a very small amount of liquid.
  • excess vitrification solution may remain around the ovum or embryo, and viability of the ovum or embryo may be reduced due to toxicity of the vitrification solution itself. Therefore, there is a demand for a method that eliminates the difficulty and complexity of these operations.
  • the main object of the present invention is to provide a vitrified cryopreservation jig capable of easily and reliably performing cryopreservation of cells or tissues. More specifically, excellent absorption performance for absorbing excess vitrification liquid when cells or tissues are immersed in the vitrification liquid and dripping the vitrification liquid onto the vitrification liquid absorber together with the cells or tissues. It is an object of the present invention to provide a vitrification cryopreservation jig capable of observing cells or tissues on a vitrification liquid absorber with suitable visibility (adhesion confirmation) using a transmission optical microscope. .
  • the present invention provides suitable visual recognition of cells or tissues placed on the vitrification cryopreservation jig during the thawing operation after cryopreservation. It is an object of the present invention to provide a vitrification jig for cryopreservation that can be observed by the property.
  • a cell or tissue vitrification cryopreservation jig having the following configuration.
  • the excess vitrification solution attached to the outer periphery of the cell or tissue is removed.
  • Other operations to remove excess vitrification liquid from absorption for example, suction removal operation from the bottom of the vitrification liquid absorber, or direct suction removal from cells or tissues using a micropipette etc. It is possible to provide a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues, which can easily and easily perform cryopreservation operations of cells or tissues without particularly requiring operation.
  • the jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues of the present invention optically cells or tissues on the vitrification solution absorber when a vitrification solution containing cells or tissues is dropped on the vitrification solution absorber. Since it can be easily confirmed under a microscope, the vitrification / freezing operation of cells or tissues can be easily and accurately performed efficiently by using the vitrification cryopreservation jig of the present invention. Furthermore, the cell or tissue vitrification cryopreservation jig according to the present invention can observe the cells or tissues placed on the vitrification cryopreservation jig with suitable visibility during the thawing operation. When the vitrification cryopreservation jig is used, the frozen cells or tissues can be thawed easily, accurately and efficiently.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues of the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the vitrification liquid absorber in FIG. 1.
  • FIG. 3 is a schematic perspective view showing an example of a vitrification solution absorber used when a plurality of cells or tissues are cryopreserved with a single vitrification cryopreservation jig.
  • FIG. 4 is a schematic perspective view showing another example of a vitrification solution absorber used when a plurality of cells or tissues are cryopreserved with a single vitrification cryopreservation jig.
  • the “jig for cell or tissue vitrification cryopreservation” of the present invention has a porous structure formed using a material having a refractive index of 1.45 or less as a vitrification solution absorber.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention is used when cryopreserving biological cells or tissues.
  • the cell includes not only a single cell but also a cell population composed of a plurality of cells.
  • the cell population composed of a plurality of cells may be a cell population composed of a single type of cell or a cell population composed of a plurality of types of cells.
  • the tissue may be a tissue composed of a single type of cell or a tissue composed of a plurality of types of cells, and includes non-cellular substances such as an extracellular matrix in addition to cells. Things can be used.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention preferably has cells or tissues attached to the vitrification solution absorber together with the vitrification solution, and the vitrification solution absorber to which the cells or tissues have adhered is cooled with liquid nitrogen or the like. It is intended to be immersed in a substance and frozen. By having the vitrification liquid absorber, cells or tissues can be easily held together with the vitrification liquid, and further, the operation of immersing the cells or tissues in liquid nitrogen can be easily performed.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention can be restated as a cell or tissue cryopreservation tool or a cell or tissue vitrification storage tool.
  • the vitrification solution absorber absorbs excess vitrification solution, so that the cells or tissues immersed in the vitrification solution are put on the vitrification solution absorber together with the vitrification solution.
  • the vitrification solution absorber absorbs excess vitrification solution, so that the cells or tissues immersed in the vitrification solution are put on the vitrification solution absorber together with the vitrification solution.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention is a vitrification cryopreservation jig having at least a vitrification solution absorber that absorbs a vitrification solution, and the refractive index of the vitrification solution absorber is 1. It is a porous structure formed using 45 or less materials. From the viewpoint of easily confirming cells or tissues on the vitrified solution absorber under a microscope, the refractive index of the material is preferably 1.39 or less, and the refractive index of the material is 1.30 or more. Preferably there is.
  • the refractive index of the raw material of the porous structure functioning as a vitrification liquid absorber can be measured according to JIS K0062 and JIS K7142 using an Abbe refractometer (Na light source, wavelength: 589 nm), for example.
  • the porous structure in the present invention is a structure having pores (pores) on the surface, and preferably a structure having continuous pores on the surface and inside.
  • the vitrification liquid absorber of the present invention may have the porous structure itself as a vitrification liquid absorber without providing a support. Or the vitrification liquid absorber which has the above-mentioned porous structure on a support body as a vitrification liquid absorption layer may be sufficient.
  • an adhesion layer can be provided between a support body and a vitrification liquid absorption layer.
  • an undercoat layer may be provided for the purpose of obtaining a uniform adhesive layer on the support.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention is such that when a vitrification solution containing cells or tissues is dropped on the vitrification solution absorber, the vitrification solution is immediately introduced into the glass through the pores on the surface of the porous structure. Absorbed by the liquid absorber, excess vitrification liquid can be removed from the surroundings of the cells or tissues. At the same time, when the dripped / absorbed vitrification liquid is filled in the pores of the porous structure, the refractive index difference between the vitrification liquid absorber and the vitrification liquid is small (the refractive index of the vitrification liquid is In general, the transparency of the vitrification liquid absorber is increased, and the cells or tissues adhering to the vitrification liquid absorber can be easily observed under a transmission type optical microscope. it can.
  • the cells to be cryopreserved are human or mouse ova and / or embryos
  • Examples of the form of the vitrified liquid absorber of the present invention include a porous structure that is a porous film produced by stretching, a porous structure made of fibers, and a porous structure having a three-dimensional mesh lattice structure.
  • the porous structure which consists of a body, a sintered fine particle, etc., the porous body which is a porous membrane manufactured by the phase-separation method, etc. can be used preferably.
  • the porous structure can be obtained by, for example, forming an unsintered tetrafluoroethylene resin mixture containing a liquid lubricant by extrusion or rolling or a method including both described in JP-B-42-13560. And a method for producing a porous structure characterized by heating to about 327 ° C. or higher in an unsintered state in a stretched state in at least one direction. ”“ Polytetra ”described in JP 2010-94579 A A fluororesin thin film having a film thickness of 50 ⁇ m or less made of a fluororesin mainly composed of fluoroethylene is fixed to a support having a property of stretching by stretching, and then stretched at less than 30 ° C. to make it porous.
  • Extruded honeycomb formed body with cell walls formed on outer peripheral portion “ Extruded honeycomb formed body with cell walls formed on outer peripheral portion ”described in JP-A-2011-245854
  • the material paste includes inorganic particles and / or inorganic fibers, and a member disposed on the mold, the inner surface of the mold, or the inner surface of the mold is provided with a ventilation portion having air permeability.
  • the sealing material paste is brought into contact with at least a part of the ventilation portion to dry and solidify the sealing material paste.
  • ", JP 2007-46042 A A hydrophobic solution in which reverse micelles are formed by stirring a solution comprising at least an amphiphile, a hydrophobic organic polymer, a hydrophilic liquid, and a hydrophobic organic solvent that dissolves the organic polymer.
  • a step of obtaining an organic solvent solution, a step of casting the hydrophobic organic solvent solution on a substrate, and a porous structure for evaporating the hydrophobic organic solvent and the hydrophilic liquid from the hydrophobic organic solvent solution on the substrate Forming a porous structure using a reverse micelle template formed in a hydrophobic organic solvent solution for forming pores. It can be produced by a method according to a known production method such as “
  • Examples of materials that can be processed into such a porous structure and have a refractive index of 1.45 or less include fluorine resins such as polytetrafluoroethylene, polyvinylidene difluoride, and polychlorotrifluoroethylene, Examples thereof include plastic resin materials such as silicon resins, metal oxide materials such as silicon dioxide, and inorganic materials such as sodium fluoride, magnesium fluoride, and calcium fluoride. Further, for example, a polymer material whose refractive index is controlled by a method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-95862, and a material made of a polymer alloy in which two or more types of polymers are mixed as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-279459. Etc.
  • porous structure may be formed from a material including other materials in addition to the above-described materials, but is formed from a material in which the above-described material having a refractive index of 1.45 or less accounts for 85% by mass or more. More preferably, it is 90 mass% or more.
  • the surface of the vitrification liquid absorber of the present invention is preferably subjected to a hydrophilic treatment in order to enhance the vitrification liquid absorption performance.
  • Hydrophilic treatment methods include graft modification methods, coating methods using hydrophilic polymer compounds, etc., corona discharge, plasma treatment, and general surface modification methods using various electron beams such as excimer lasers. Can do.
  • the porous structure possessed by the vitrification liquid absorber of the present invention has a vitrification viewpoint and visibility of whether or not cells or tissues have adhered to the vitrification liquid absorber (with a transmission optical microscope). From the viewpoint of (visibility under observation), a vitrified liquid absorber having a pore diameter of 0.02 to 20 ⁇ m is preferable, and a more preferable pore diameter is 0.2 to 15 ⁇ m.
  • the pore size of the porous structure of the absorber is preferably 5.5 ⁇ m or less, more preferably 1.0 ⁇ m or less, and even more preferably 0.75 ⁇ m or less.
  • the pore diameter of the porous structure of the vitrified liquid absorber is less than 0.02 ⁇ m, the absorption performance under the vitrified droplets is not sufficient, and it takes time until frozen storage, or extra vitrification A large amount of fluid may remain around the cells or tissues.
  • the pore diameter exceeds 20 ⁇ m, the cells or tissues are trapped in the surface pores, and the cells or tissues are not easily separated from the vitrification solution absorber during the thawing operation after freezing. Operation may not be possible.
  • the thickness of the porous structure of the vitrification liquid absorber is preferably 10 to 500 ⁇ m, more preferably 25 to 150 ⁇ m.
  • the porosity of the porous structure is preferably 30% or more, and more preferably 70% or more.
  • the pore size, thickness, and porosity of the porous structure of the vitrification liquid absorber of the present invention are appropriately set according to the type of cell or tissue used, the amount of dripping of the vitrification solution dripped with the cell or tissue, and the like. can do.
  • the pore diameter of the porous structure is the diameter of the largest pore measured by a bubble point test specified in JIS K3832.
  • the porosity is defined by the following formula.
  • the void volume V was measured and processed using a mercury porosimeter (measuring instrument name: Autopore II 9220 manufacturer micromeritics instrument corporation), and the cumulative pore volume (ml / ml) of the vitrified liquid absorber from a pore radius of 3 nm to 400 nm.
  • g dry solid content
  • g / square meter dry solid content of the vitrification liquid absorber
  • the area of the vitrification liquid absorber of the present invention is not particularly limited as long as it is appropriately set according to the dripping amount of the vitrification liquid dripped together with the cells or tissues, but for example, 10 mm 2 per 1 ⁇ L of the dripping vitrification liquid.
  • the above is preferable, and 20 to 400 mm 2 is more preferable.
  • tool for vitrification cryopreservation of this invention has a support body, as this support body, a light-transmissive support body is preferable, and the light transmittance whose total light transmittance is 80% or more.
  • a support is more preferred.
  • the haze value of the light transmissive support is preferably 10% or less. Examples of such a support include various resin films, glass, rubber and the like. As long as the effects of the present invention are exhibited, two or more kinds of supports may be used in combination. Among them, the resin film is preferably used in terms of excellent handleability.
  • the resin film include polyester resins such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate (PEN), acrylic resins, epoxy resins, silicone resins, polycarbonate resins, diacetate resins, triacetate resins, polyarylate resins, polychlorinated resins.
  • polyester resins such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate (PEN)
  • acrylic resins epoxy resins
  • silicone resins polycarbonate resins
  • diacetate resins diacetate resins
  • triacetate resins polyarylate resins
  • polychlorinated resins examples include a vinyl resin, a polysulfone resin, a polyether sulfone resin, a polyimide resin, a polyamide resin, a polyolefin resin, and a cyclic polyolefin resin
  • the thickness is preferably 10 to 1000 ⁇ m.
  • the surface of the support can be easily adhered by corona discharge treatment.
  • the vitrification liquid absorber of the jig for vitrification cryopreservation of the present invention has an adhesive layer, an instantaneous adhesive material, a hot-melt adhesive material, a photo-curing property as typified by a moisture-curable adhesive material
  • adhesive materials can be used, for example, water-soluble adhesive materials such as polyvinyl alcohol, hydroxycellulose, polyvinylpyrrolidone, starch paste, vinyl acetate adhesive materials, acrylic adhesive materials, epoxy adhesives Substances, urethane adhesives, elastomer adhesives, cyanoacrylate adhesives, fluorine adhesives, silicon adhesives, nitrocellulose adhesives, nitrile rubber adhesives, styrene-butadiene adhesives, urea resin adhesives Adhesive materials, styrene resin adhesive materials, phenol resin adhesive materials, polyimide adhesive materials, Polyamide-based adhesive material, a polyester adhesive material, bismaleimide adhesive material, an olefin-based adhesive material,
  • the adhesive layer may contain one kind of adhesive substance or may contain a plurality of kinds of adhesive substances.
  • the solid content of the adhesive layer is preferably in the range of 0.01 to 100 g / m 2 , more preferably in the range of 0.1 to 50 g / m 2 .
  • the adhesive layer may be made of polyvinyl alcohol, hydroxycellulose, polyvinylpyrrolidone, starch paste or the like. It is preferable to contain a water-soluble adhesive substance.
  • an acrylic adhesive, epoxy adhesive, urethane adhesive, elastomer adhesive, or cyanoacrylate adhesive should be used for the adhesive layer. Is preferred.
  • the adhesive layer can contain various matting agents, surfactants, pH adjusters and the like.
  • the vitrification liquid absorber in the present invention has been described above.
  • the structure of the vitrification cryopreservation jig using these will be described below.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention may be anything as long as it has a vitrification solution absorber as described above, but the vitrification solution absorber is connected to the gripping part. May be. Having a gripping portion is preferable because workability during cryopreservation work and melting work is good.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of a jig for vitrification cryopreservation of cells or tissues of the present invention.
  • a vitrification cryopreservation jig 5 includes a gripping portion 1 and a vitrification liquid absorber 2.
  • the grip 1 is preferably made of a liquid nitrogen resistant material.
  • various metals such as aluminum, iron, copper, and stainless alloy, ABS resin, polypropylene resin, polyethylene resin, fluorine resin, various engineer plastics, and glass can be preferably used.
  • the vitrification liquid absorber 2 is preferably strip-shaped or sheet-shaped for handling.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the vitrification liquid absorber 2 of FIG.
  • the vitrification liquid absorber 2 a in FIG. 2 has a vitrification liquid absorption layer 3 on a support 4.
  • the vitrification liquid absorber 2a shown in FIG. 2 is an example of a form having the vitrification liquid absorption layer 3 on the entire surface of the vitrification liquid absorber.
  • the vitrification liquid absorber 2 can be connected to the holding part 1 by insert molding, for example, when molding. Furthermore, the vitrification liquid absorber insertion part which is not shown in figure in the holding part 1 can be produced, and the vitrification liquid absorber 2 can be connected with an adhesive agent.
  • adhesives can be used, but a silicon-based or fluorine-based adhesive that is resistant to low temperatures can be suitably used.
  • the cap is preferably made of various metals, various resins, glass, ceramics, etc., which are liquid nitrogen resistant materials.
  • the shape may be any shape as long as it is not in contact with the vitrification liquid absorber such as a pencil cap or a cylindrical straw cap and can be shielded from the outside.
  • FIG. 3 and 4 show examples of other modes of the vitrification liquid absorber in the present invention.
  • the vitrification solution absorber may be as shown in FIGS.
  • FIG. 3 is a schematic perspective view showing an example of a vitrification liquid absorber 2b used when a plurality of cells or tissues are cryopreserved with a single vitrification cryopreservation jig.
  • FIG. 4 is a schematic perspective view showing another example of the vitrification liquid absorber 2c used when a plurality of cells or tissues are cryopreserved with one vitrification cryopreservation jig. 3 and 4, the vitrification solution absorbing layer 3 is discontinuous and disposed on the support 4.
  • the vitrification liquid absorption layer 3 has a continuous shape as shown in FIG. 2 described above, when a plurality of cells or tissues are attached to the vitrification liquid absorption layer 3, the vitrification liquid is the vitrification liquid absorption layer. Since it spreads in the lateral direction and the thickness direction, for example, when the second or subsequent cells or tissues are attached to the vitrification solution absorption layer 3, the absorbability of the vitrification solution may be lowered. However, if a plurality of the vitrification solution absorption layers 3 are provided on the support 4 in a discontinuous manner as shown in FIGS. 3 and 4, there is no such concern, and cells or tissues are vitrified together with the vitrification solution.
  • the liquid absorbing layer 3 can be securely attached one by one.
  • vitrification liquid absorber 2b and the vitrification liquid absorber 2c shown in FIGS. 3 and 4 are also examples of a vitrification liquid absorber having a vitrification liquid absorption layer on a part of the support.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention is suitably used, for example, in the cryotop method.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention when cells or tissues are frozen and thawed, they are not easily damaged by vitrification liquid existing outside the cells or tissues, and the cells or tissues are frozen with an excellent survival rate. Can be saved.
  • the method for cryopreserving cells or tissues using the vitrification cryopreservation jig of the present invention is not particularly limited.
  • a vitrification solution absorber comprising cells or tissues immersed in a vitrification solution together with the vitrification solution
  • the vitrification solution adhering to the periphery of the cell or the tissue is dropped onto the vitrification solution absorber.
  • the cells or the tissues can be frozen by immersing them in liquid nitrogen or the like while being held on the vitrification liquid absorber.
  • the vitrification solution those usually used for freezing cells such as eggs and embryos can be used.
  • aqueous solutions containing various antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide) are used. it can.
  • Examples of cells that can be cryopreserved using the vitrification cryopreservation jig of the present invention include, for example, mammals (eg, humans, cows, pigs, horses, rabbits, rats, mice, etc.) eggs or embryos. And germ cells such as sperm, iPS cells, and ES cells. Moreover, cultured cells, such as a primary cultured cell, a subcultured cell, and a cell line cell, are mentioned.
  • the cells are fibroblasts, cancer-derived cells such as pancreatic cancer / hepatoma cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, nerve cells, chondrocytes, tissue stem cells, Examples include embryonic stem cells and adherent cells such as immune cells.
  • tissues that can be cryopreserved include tissues composed of allogeneic or heterogeneous cells, such as tissues such as ovary, skin, corneal epithelium, periodontal ligament, myocardium, and cartilage.
  • the vitrification cryopreservation jig of the present invention is not limited to cells or tissues collected directly from a living body, for example, cultured skin grown and grown in vitro, a so-called cell sheet constructed in vitro, It can also be suitably used in vitrified cryopreservation of an artificial tissue such as a tissue model having a three-dimensional structure described in JP-A-205516.
  • Example 1 On a transparent PET film having a thickness of 250 ⁇ m, a haze value of 5.5%, and a total light transmittance of 91%, the surface of which is subjected to corona discharge treatment, a urethane-based adhesive substance having a dry mass of 10 g / Application was at m 2 .
  • a polytetrafluoroethylene porous film (refractive index 1.35, pore diameter 0.1 ⁇ m, film thickness 30 ⁇ m, porosity, which is a porous film manufactured by stretching)
  • the vitrification liquid absorber 2 was produced by stacking 80% of the hydrophilic layer with polyvinyl alcohol on the adhesive layer and drying it.
  • This vitrified liquid absorber 40 mm 2 was joined to a gripping portion 1 made of ABS (acrylonitrile-butadiene-styrene) resin, and a vitrification cryopreservation jig 5 of Example 1 was produced in the form shown in FIG.
  • Example 2 As a porous structure, a polytetrafluoroethylene porous membrane (refractive index: 1.35, pore diameter: 0.5 ⁇ m, film thickness: 35 ⁇ m, hydrophilized with polyvinyl alcohol, which is different from Example 1 in the characteristics of the porous membrane, The jig for vitrification cryopreservation of Example 2 was produced in the same manner as Example 1 except that the porosity was 79%.
  • Example 3 As a porous structure, a polytetrafluoroethylene porous membrane hydrophilized with polyvinyl alcohol (characterized by a refractive index of 1.35, a pore diameter of 1 ⁇ m, a film thickness of 85 ⁇ m, and a porosity is different from that of the first embodiment.
  • the jig for vitrification cryopreservation of Example 3 was produced in the same manner as in Example 1 except that 80%) was used.
  • Example 4 As a porous structure, a polytetrafluoroethylene porous membrane hydrophilized with polyvinyl alcohol (characterized by a refractive index of 1.35, a pore diameter of 10 ⁇ m, a film thickness of 85 ⁇ m, and a porosity is different from that of the first embodiment.
  • the jig for vitrification cryopreservation of Example 4 was produced in the same manner as Example 1 except that 80%) was used.
  • Example 5 As a porous structure, a polyvinylidene difluoride porous film hydrophilically treated with polyvinyl alcohol (refractive index 1.42, pore diameter 0.1 ⁇ m, film thickness 125 ⁇ m), which is different from Example 1 in the characteristics of the porous film A vitrification cryopreservation jig of Example 5 was produced in the same manner as in Example 1 except that the porosity was 70%.
  • Example 6 As a porous structure, a polyvinylidene difluoride porous film hydrophilically treated with polyvinyl alcohol (refractive index 1.42, pore diameter 0.5 ⁇ m, film thickness 125 ⁇ m), which is different from Example 1 in the characteristics of the porous film.
  • the vitrification cryopreservation jig of Example 6 was produced in the same manner as in Example 1 except that the porosity was 70%.
  • Example 7 As a porous structure, a polyvinylidene difluoride porous film hydrophilized with polyvinyl alcohol (refractive index 1.42, pore diameter 5 ⁇ m, film thickness 125 ⁇ m, voids, which is different from Example 1 in the characteristics of the porous film
  • the vitrification cryopreservation jig of Example 7 was produced in the same manner as in Example 1 except that the ratio 70% was used.
  • Comparative Example 1 Example 1 with the exception of using a cellulose acetate membrane made by Advantech as a porous structure (refractive index 1.47, pore diameter 0.5 ⁇ m, film thickness 125 ⁇ m, porosity 68%) as a porous structure. Similarly, the jig for vitrification cryopreservation of Comparative Example 1 was produced.
  • Comparative Example 2 As a porous structure, a cellulose mixed ester membrane (refractive index 1.51, pore diameter 0.5 ⁇ m, film thickness 145 ⁇ m, porosity 78%) manufactured by Advantech, which is a porous film made of cellulose acetate and nitrocellulose, was used. Except for the above, a vitrification cryopreservation jig of Comparative Example 2 was produced in the same manner as in Example 1.
  • Comparative Example 3 Example 1 except that a porous film (refractive index 1.51, pore diameter 43 ⁇ m, film thickness 500 ⁇ m, porosity 42%) made of polyethylene sintered fine particles subjected to hydrophilic treatment was used as the porous structure. In addition, a vitrification cryopreservation jig of Comparative Example 3 was produced.
  • Comparative Example 4 As a porous structure, on a PET film, alumina fine particles (refractive index 1.65) and a binder made of polyvinyl alcohol (PVA, refractive index 1.52 to 1.55) are mixed with 90% by mass of alumina fine particles, The same as in Example 1 except that an alumina porous membrane (pore size 0.08 ⁇ m, film thickness 110 ⁇ m, porosity 55%) formed by coating a coating layer mixed at a binder ratio of 10% by mass was used. A vitrification freezing jig of Comparative Example 4 was prepared. Since the pore diameter of the alumina porous membrane was not obtained by a bubble point test, it was obtained as a cumulative 50% diameter in the pore distribution measured by the mercury intrusion method.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Comparative Example 5 Filter paper No. manufactured by Advantech, which is a filter paper made of cellulose fiber.
  • 5C reffractive index 1.50, basis weight 120 g / m 2 , density 0.57 g / cm 3
  • a jig was produced.
  • Comparative Example 6 A glass of Comparative Example 6 as in Example 1, except that a transparent PET film (thickness 250 ⁇ m, total light transmittance 91%, porosity 0%), which is a colorless transparent film, was used as the vitrification liquid absorber. A freezing and freezing jig was prepared.
  • the vitrification solution used was a composition containing 20% by volume serum, 15% by volume DMSO, 15% by volume ethylene glycol, and 0.2% by volume sucrose in a modified TCM199 medium manufactured by Sigma-Aldrich.
  • the visibility of cells was evaluated according to the following criteria. A: Pseudo cells can be easily observed. ⁇ : Pseudo cells can be observed. X: Observation of pseudo cells is difficult or impossible.
  • the absorptivity of vitrification liquid was evaluated according to the following criteria.
  • Example 8 As a porous structure, a polytetrafluoroethylene porous membrane (refractive index: 1.35, pore diameter: 0.1 ⁇ m, film thickness: 35 ⁇ m, hydrophilized with polyvinyl alcohol, which is different from Example 1 in the characteristics of the porous membrane, A vitrification cryopreservation jig of Example 8 was produced in the same manner as in Example 1 except that the porosity was 71%.
  • Example 9 As a porous structure, a polytetrafluoroethylene porous membrane (refractive index: 1.35, pore diameter: 0.2 ⁇ m, film thickness: 35 ⁇ m, hydrophilized with polyvinyl alcohol, which is different from Example 1 in the characteristics of the porous membrane, A jig for vitrification cryopreservation of Example 9 was produced in the same manner as Example 1 except that the porosity was 71%.
  • Example 10 As a porous structure, a polytetrafluoroethylene porous membrane (refractive index: 1.35, pore diameter: 0.5 ⁇ m, film thickness: 65 ⁇ m, hydrophilized with polyvinyl alcohol, which is different from Example 1 in the characteristics of the porous membrane, A jig for vitrification cryopreservation of Example 10 was produced in the same manner as in Example 1 except that the porosity was 79%.
  • the equilibration treatment was 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.9 mM CaCl 2 .2H 2 O, 0.5 mM MgCl 2 .6H 2 O, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 8 mM Na 2.
  • the composition of HPO 4 , 5.6 mM glucose, 0.3 mM Na pyruvate, 65 ⁇ g / ml dibekacin sulfate, 1 mg / ml polyvinylpyrrolidone, 14.8 mM L-proline, 200 mM trehalose is extremely low as a pH indicator.
  • a mouse embryo was immersed in a vitrification base solution containing a concentration of phenol red for 10 minutes, and then removed. The removed mouse embryo was then removed from 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.9 mM CaCl 2.
  • the mouse embryo after the above-described equilibrium treatment refers to a mouse embryo taken out from the pre-vitrification solution.
  • the vitrified cryopreserved mouse embryos of Example 3, Example 6, Examples 8 to 10, Comparative Example 1, Comparative Example 2, Comparative Example 5, and Comparative Example 6 were vitrified cryopreservation jigs. Then, it was taken out and immersed in a melt at 37 ° C. The melt was 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.9 mM CaCl 2 .2H 2 O, 0.5 mM MgCl 2 .6H 2 O, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 8 mM Na.
  • the frozen vitrification cryopreservation jig was stored in a liquid nitrogen storage container until thawed.
  • the amount of vitrification solution when the mouse embryo was placed on the vitrification cryopreservation jig was in the range of about 0.2 to 1 ⁇ l according to the absorbability of the vitrification cryopreservation jig to be used. .
  • the embryos are vitrified and frozen after being placed on the vitrification solution absorber.
  • the time was up to 1 minute (within 1 minute 30 seconds until the mouse embryo was immersed in the vitrification solution and then frozen) according to the protocol of Kitasato Corporation.
  • the vitrification preservation jig on which the mouse embryo was placed was taken out of the liquid nitrogen and immersed in a melt at 37 ° C. (a solution obtained by adding 1M sucrose to the above-mentioned modified phosphate buffer). After approximately 1 minute of immersion, the mouse embryo was recovered from the melt, and then immersed in a diluent at a temperature of 37 ° C. (a solution obtained by adding 0.5 M sucrose to the modified phosphate buffer). The immersion time in the diluent is about 3 minutes. Then, it was immersed in the said modified phosphate buffer solution of temperature 37 degreeC for 5 minutes.
  • KSOM / aa containing BSA
  • KSOM / aa a development medium for mouse embryos
  • conditions of 5% CO 2 , 5% O 2 , 90% N 2 , and 37 ° C. saturated humidity Cultivation was performed below. Observation was performed every 4 hours from the start of the culture, and those in which the blastocoel remodeled by 24 hours after the culture were determined to be alive.
  • the ratio of the number of embryos determined to be alive in this way was 95.4% for the vitrification cryopreservation jig of Example 3, 100% for the vitrification cryopreservation jig of Example 9, and the comparative example. In the vitrification cryopreservation jig of No. 6, it was 42%.
  • the vitrification freezing operation of cells or tissues and the thawing operation after freezing can be easily and reliably performed by the vitrification cryopreservation jig of the present invention. Furthermore, the vitrification cryopreservation jig of the present invention can provide a very high survival rate of cells or tissues.
  • the present invention can be used for testing or transplanting from iPS cells, ES cells, commonly used cultured cells, living organisms, etc. in addition to embryo transfer or artificial insemination of humans such as cattle and animals, artificial insemination to humans, etc. It can be used for cryopreservation of cells or tissues, cells or tissues cultured in vitro, and the like.

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Abstract

　細胞または組織のガラス化凍結作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、ガラス化凍結保存用治具を提供する。本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具は、屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体をガラス化液吸収体として有する。

Description

細胞または組織のガラス化凍結保存用治具
　本発明は、生物の細胞または組織などを凍結保存する際に使用するガラス化凍結保存用治具に関する。
　生物の細胞または組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術に用いられる胚は、受胚牛の発情周期に合わせて移植が行われており、発情周期に胚の移植を合わせるために、胚を凍結保存し、発情周期に合わせて胚を融解して移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子または卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。
　一般に、生体内から採取された細胞または組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞または組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を損なわずに長期間保存する技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞または組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚や生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても広く求められている技術である。
　細胞または組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、リン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞または組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞または組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／分の速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外または組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞または組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内または組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外または組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞または組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
　しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置または治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外または組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞または組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
　前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。
　前記ガラス化保存法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞または組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（－１９６℃）で冷却する。このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に時間を必要としない他、温度制御をするための装置または治具を必要としない。
　ガラス化保存法を用いると、細胞内外の何れにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性があり、細胞または組織の凍結保存時にはガラス化液が必要以上に多くないことが好ましい。また、細胞または組織がガラス化液に暴露される時間つまりは凍結までの時間が短時間であることが好ましい。さらには、解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。
　これらガラス化保存法を用いた細胞または組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞または組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物またはヒトの生殖細胞または体細胞へのガラス化保存法の適用が凍結保存、融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。
　ガラス化保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２あるいは非特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化保存法が有効であることが示されている。このように、ガラス化保存法は広く様々な種の細胞や組織で有用であることが知られている。
　ガラス化保存法をより効率的に行うための治具や操作方法としては、特許文献３などでは、ストローにガラス化液を充満させた中で卵子または胚をガラス化凍結保存させ、解凍時に素早く希釈液と接触させて再生率を向上させる試みがなされている。
　特許文献４では、卵子または胚をガラス化液と共にガラス化保存液除去材の上に載せ、下部から吸引することで卵子または胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、ガラス化保存液除去材としては、金網、紙などの天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。
　特許文献５では卵子または胚の周囲に付着した余分なガラス化液を濾紙などの吸収体により吸収させることにより、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。
　特許文献６、特許文献７では、人の不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法と云う方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用し、該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子または胚を顕微鏡下で付着させ、凍結保存する方法が提案されている。
特許第３０４４３２３号公報 特開２００８－５８４６号公報 特開平１０－２４８８６０号公報 国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット 特開２００５－４００７３号公報 特開２００２－３１５５７３号公報 特開２００６－２７１３９５号公報
Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３４５：１７０－１７２（１９９０） 酒井昭，低温生物工学会誌　４２：６１－６８（１９９６）
　特許文献３で提案されている方法は、ストロー中にガラス化液を充満させることから、凍結までの時間が長い問題がある。また、凍結保存できる細胞または組織の大きさはストローの内径に制限されるため、細胞シートのようなシート形状の組織を保存することは困難である。
　特許文献４で提案されている方法は、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除くことにより、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法を提案している。しかしながら、特許文献４記載の方法では、余分なガラス化液を除く際に、下部からの吸引操作を必要とするため、煩雑な操作となり、短時間でガラス化凍結保存操作を行う場合には不向きである。さらには、下部からの吸引が不十分であると余分なガラス化液が残存する問題がある。
　特許文献５では、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を濾紙などの吸収体に吸収させることにより、優れた生存性でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法を提案している。しかしながら、クライオトップ法により、例えばガラス化保存法を人の卵子又は胚に適用する場合には、特に卵子又は胚の吸収体への付着確認作業の正確性が高い精度で求められるが、濾紙は全光線透過率が低く、一般的に用いられる透過型の光学顕微鏡下で吸収体上に付着した卵子又は胚を観察することは難しいため、確実に卵子又は胚の付着を確認することは極めて困難であった。また凍結保存後の融解作業時に、卵子又は胚を確実に吸収体上から採取することが難しいという問題もあった。
　特許文献６、特許文献７で提案されている方法では、特許文献５に提案されている方法の不具合をある程度解決している。特許文献６、特許文献７に提案されている方法によって、操作性が良く、凍結保存スペースを占有しないコンパクトな卵凍結保存用具が提供される。この卵凍結保存用具は、顕微鏡下で人の卵子又は胚を観察できる可撓性かつ無色透明な平坦フィルム（卵付着保持用ストリップ）を備えており、該フィルム上に極少量（０．１μＬ）のガラス化液と共に卵子又は胚を滴下付着させることにより、卵子又は胚を凍結保存できる。しかし、これらフィルムの幅は通常０．５～２ｍｍであり、操作に熟練していないと極少量の卵子又は胚の入ったガラス化液を正確に滴下付着させるのは非常に難しい。実際には新人培養士の多くが卵子又は胚の凍結操作でまずつまずくのが、極少量の液で卵子又は胚をシートへ乗せる操作である。更にガラス化液を多く滴下した場合、余分なガラス化液が卵子又は胚の周囲に残り、ガラス化液自体の毒性のために、卵子又は胚の生存性を低下させるおそれがある。そのため、これらの操作の難しさや煩雑さを解消する方法が求められている。
　本発明は、細胞または組織の凍結保存作業を容易にかつ確実に行うことが可能なガラス化凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞または組織をガラス化液に浸漬し、細胞または組織と共にガラス化液をガラス化液吸収体上に滴下する時に、余分なガラス化液を吸収するための優れた吸収性能を備え、ガラス化液吸収体上の細胞または組織を、透過型の光学顕微鏡を用いて好適な視認性（付着確認性）で観察できるガラス化凍結保存用治具を提供することを課題とする。また本発明は、余分なガラス化液を吸収するための優れた吸収性能に加え、凍結保存後の融解操作時に、該ガラス化凍結保存用治具上に載せられた細胞または組織を好適な視認性で観察できるガラス化凍結保存用治具を提供することを課題とする。
　本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記した各種技術的な課題は、以下の構成を有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具で解決できることが判明した。
（１）屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体をガラス化液吸収体として有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
（２）上記（１）記載の多孔質構造体の細孔径が５．５μｍ以下である、細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
（３）上記（２）記載の多孔質構造体がフッ素樹脂多孔体である、細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
　本発明により、ガラス化液に浸漬させた細胞または組織をガラス化液と共にガラス化液吸収体上に載せる際に、ガラス化液吸収体が細胞または組織の外周に付着した余分なガラス化液を吸収することから、余分なガラス化液を除くためのその他の操作（例えば、ガラス化液吸収体下部からの吸引除去操作や、マイクロピペット等を用いた細胞または組織周囲からの直接的な吸引除去操作）を特に必要とせずに、細胞または組織の凍結保存作業を容易かつ簡便に行うことが可能な、細胞または組織のガラス化凍結保存用治具を提供することができる。
　また本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具は、細胞または組織を含むガラス化液をガラス化液吸収体上に滴下した際に、ガラス化液吸収体上の細胞または組織を光学顕微鏡下で容易に確認することができるため、本発明のガラス化凍結保存用治具を用いると、細胞または組織のガラス化凍結作業を容易かつ精度よく効率的に行うことができる。さらには本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具は、融解操作時に、該ガラス化凍結保存用治具上に載せられた細胞または組織を好適な視認性で観察できるため、本発明のガラス化凍結保存用治具を用いると、凍結した細胞または組織の融解作業を容易かつ精度よく効率的に行うことができる。
図１は、本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具の一例を示す斜視図である。 図２は、図１中のガラス化液吸収体の拡大図である。 図３は、複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体の一例を示す概略斜視図である。 図４は、複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体の別の一例を示す概略斜視図である。
　以下に本発明の「細胞または組織のガラス化凍結保存用治具」を詳細に説明するが、本発明は下記実施形態に限定されるものではない。本発明の「細胞または組織のガラス化凍結保存用治具」は、屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体をガラス化液吸収体として有する。
　本発明のガラス化凍結保存用治具は、生物の細胞または組織を凍結保存する際に用いられるものである。本明細書中で細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。本発明のガラス化凍結保存用治具は、好ましくは、ガラス化液吸収体に細胞または組織をガラス化液と共に付着させて、細胞または組織が付着したガラス化液吸収体を液体窒素等の冷却物質に浸漬し凍結させるためのものである。上記ガラス化液吸収体を有することにより、細胞または組織をガラス化液と共に容易に保持することができ、さらには細胞または組織の液体窒素への浸漬作業も容易に行うことができる。本発明のガラス化凍結保存用治具は、細胞または組織凍結保存用具、細胞または組織ガラス化保存用具と言い換えることができる。
　本発明のガラス化凍結保存用治具は、ガラス化液吸収体が余分なガラス化液を吸収するので、ガラス化液に浸漬させた細胞または組織を、ガラス化液と共にガラス化液吸収体上に滴下付着させる際に、細胞または組織に付着したガラス化液の量が多くても細胞または組織の極めて高い生存率が達成できる。さらに、そのように操作された細胞または組織はごく少量のガラス化液に覆われており、凍結操作する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらには凍結保存した細胞または組織を解凍後ただちにガラス化液を希釈することができる。
　本発明のガラス化凍結保存用治具は、ガラス化液を吸収するガラス化液吸収体を少なくとも有するガラス化凍結保存用治具であって、該ガラス化液吸収体が、屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体であることを特徴とする。ガラス化液吸収体上の細胞または組織を顕微鏡下で容易に確認するとの観点から、該素材の屈折率を１．３９以下とすることは好ましく、また該素材の屈折率は１．３０以上であることが好ましい。なお、ガラス化液吸収体として機能する多孔質構造体の素材の屈折率は、例えば、アッベ屈折計（Ｎａ光源、波長：５８９ｎｍ）を用いてＪＩＳ Ｋ００６２、ＪＩＳ Ｋ７１４２に準じて測定できる。また、本発明における多孔質構造体とは、表面に気孔（細孔）を有する構造体であり、好ましくは表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体である。本発明のガラス化液吸収体は、支持体を設けずに、前記した多孔質構造体そのものをガラス化液吸収体として有していても良い。あるいは支持体上に前記した多孔質構造体をガラス化液吸収層として有するガラス化液吸収体であっても良い。支持体上にガラス化液吸収層を設ける場合には、支持体とガラス化液吸収層との間に、接着層を設けることができる。さらには、該ガラス化液吸収層と該接着層以外にも、例えば支持体上に均一な接着層を得ることを目的に、例えば下塗り層等を設けても良い。
　本発明のガラス化凍結保存用治具は、細胞または組織を含むガラス化液がガラス化液吸収体上に滴下された時、多孔質構造体の表面の細孔を通してガラス化液がすみやかにガラス化液吸収体に吸収され、細胞または組織の周囲から余分なガラス化液を除くことができる。同時に、滴下・吸収されたガラス化液が多孔質構造体の気孔内部に充填された際、ガラス化液吸収体とガラス化液との屈折率差が小さいために（ガラス化液の屈折率は、一般に１．４３～１．３３）、ガラス化液吸収体の透明性が上昇し、該ガラス化液吸収体上に付着した細胞または組織を透過型の光学顕微鏡下で容易に観察することができる。特に、凍結保存する細胞がヒトやマウスの卵子および／または胚である場合には、特許文献６や特許文献７のような方法ではガラス化液中の卵子を視認することは困難であるが、本発明のガラス化凍結保存用治具が有するガラス化液吸収体は余分なガラス化液を吸収するために、より容易に細胞を視認することが可能となる。
　本発明のガラス化液吸収体の形態としては、例えば、延伸によって製造される多孔質膜である多孔質構造体、繊維からなる多孔質構造体、三次元のメッシュ格子構造を有した多孔質構造体、焼結微粒子等からなる多孔質構造体、相分離法により製造される多孔質膜である多孔質体などを好ましく用いることができる。
　該多孔質構造体は、例えば、特公昭４２－１３５６０号公報に記載の「液状潤滑剤を含む未焼結の４フッ化エチレン樹脂混和物を押出もしくは圧延または両者を含む方法にて成形した後、未焼結状態にて少なくとも一方向に延伸した状態で約３２７℃以上に加熱することを特徴とする多孔性構造物の製造法。」、特開２０１０－９４５７９号公報に記載の「ポリテトラフルオロエチレンを主体とするフッ素樹脂よりなる膜厚が５０μｍ以下のフッ素樹脂薄膜を、延伸によって伸びる特性を有する支持体に固定した後、３０℃未満で延伸して多孔質化することを特徴とする多孔質フッ素樹脂薄膜の製造方法。」、特開２０１２－９７３６３号公報に記載の「少なくとも、一部が溶融状態にあるフッ素樹脂を帯電させる帯電用電極と該帯電用電極に対向配置されたコレクタとの間に電圧を印加することによって、溶融状態にある前記フッ素樹脂を繊維化し、該繊維をコレクタに集積して、前記帯電用電極が負極となるように、前記帯電用電極と前記コレクタとの間に電圧を印加することを特徴とする不織布の製造方法。」、特開２０１１－２４５８５４号公報に記載の「外周部にセル壁が形成されたハニカム成形体を押出成形する成形工程と、前記ハニカム成形体を焼成してハニカム焼成体を形成する焼成工程と、型枠内に複数のハニカム焼成体を固定する固定工程と、前記型枠とハニカム焼成体との隙間及びハニカム焼成体間の隙間にシール材ペーストを充填する充填工程と、前記シール材ペーストを乾燥固化させて接着材層およびコート層を形成する乾燥工程とを備え、前記シール材ペーストは無機粒子及び／又は無機繊維を含み、前記型枠、前記型枠の内面、又は、前記型枠の内面側に配置された部材には、空気透過性を有する通気部が設けられており、前記乾燥工程では、前記シール材ペーストを前記通気部の少なくとも一部に接触させて該シール材ペーストの乾燥固化を行うことを特徴とする、多数のセルがセル壁を隔てて長手方向に並設された柱状のハニカム焼成体が、接着材層を介して複数個結束されてなるセラミックブロックの周囲にコート層が設けられたハニカム構造体の製造方法。」、特開２００７－４６０４２号公報等に記載の「少なくとも両親媒性物質、疎水性を有する有機ポリマー、親水性液体及び該有機ポリマーを溶解する疎水性有機溶媒からなる溶液を撹拌して、逆ミセルが形成された疎水性有機溶媒溶液を得る工程と、前記疎水性有機溶媒溶液を基板上にキャストする工程と、前記基板上の疎水性有機溶媒溶液から、疎水性有機溶媒と親水性液体を蒸発させる多孔質の構造体を形成する工程とを含む、疎水性有機溶媒溶液中に形成された逆ミセルの鋳型を孔の形成に利用する多孔質構造体の製造方法。」などの公知の製造方法に準じた方法によって、製造することが可能である。
　このような多孔質構造への加工が可能であり、且つ屈折率が１．４５以下の素材としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリクロロトリフルオロエチレンなどのフッ素樹脂やシリコン樹脂のようなプラスチック樹脂材料、二酸化ケイ素のような金属酸化物材料、フッ化ナトリウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウムのような無機材料などが挙げられる。また、例えば特開２０００－９５８６２号公報に示される方法で屈折率を制御した高分子材料や、特開２００７－２７９４５９号公報に示される２種類以上の高分子が混合されたポリマーアロイからなる材料なども用いることができる。好ましくは、フッ素樹脂多孔体であり、より好ましくはポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライドであり、特に好ましくはポリテトラフルオロエチレンである。多孔質構造体は、上記した素材以外にも、他素材を含んだ素材から形成されていても良いが、上記した屈折率が１．４５以下の素材が８５質量％以上を占める素材から形成されることが好ましく、より好ましくは９０質量％以上である。
　本発明のガラス化液吸収体の表面は、ガラス化液吸収性能を高めるために、親水化処理することが好ましい。親水化処理の方法としては、グラフト改質法、親水性高分子化合物等を用いたコーティング法、コロナ放電、プラズマ処理、エキシマレーザー等の各種電子線を用いた一般的な表面改質方法を使用することできる。
　本発明のガラス化液吸収体が有する多孔質構造体は、ガラス化液の吸収性の観点およびガラス化液吸収体に細胞または組織が付着したか否かの視認性（透過型光学顕微鏡での観察下における視認性）の観点から、細孔径が０．０２～２０μｍのガラス化液吸収体であることが好ましく、より好ましい細孔径は０．２～１５μｍである。またガラス化液の吸収性と、凍結保存後の融解操作時に、融解液中のガラス化液吸収体上に載せられた細胞または組織を好適な視認性で観察するとの観点から、該ガラス化液吸収体が有する多孔質構造体の細孔径が５．５μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．７５μｍ以下である。
　ガラス化液吸収体が有する多孔質構造体の細孔径が０．０２μｍ未満の範囲では、ガラス化液滴下時の吸収性能が十分でなく、凍結保存までに時間を要したり、余分なガラス化液が細胞または組織の周辺に多量に残存するおそれがある。また、細孔径が２０μｍを超える範囲では、細胞または組織が表面の細孔にトラップされ、凍結後の融解操作の際に、細胞または組織がガラス化液吸収体から容易に離れず、適切な解凍操作が行えないおそれがある。さらには、ガラス化液吸収体表面の細孔と表面に付着した細胞または組織との見極めが困難になるおそれがあり、視認性の観点で問題が残る。
　本発明においてガラス化液吸収体が有する多孔質構造体の厚みは、１０～５００μｍであることが好ましく、より好ましくは２５～１５０μｍである。また該多孔質構造体の空隙率は３０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上である。本発明のガラス化液吸収体が有する多孔質構造体の細孔径、厚み、空隙率は、用いる細胞または組織の種類や細胞または組織と共に滴下されるガラス化液の滴下量等に応じて適宜設定することができる。
　本明細書において、多孔質構造体の細孔径とは、ＪＩＳ　Ｋ３８３２に規定されるバブルポイント試験により測定される最も大きい孔の直径である。また、空隙率は以下の式で定義される。
　ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称 Autopore II 9220 製造者 micromeritics instrument corporation）を用い測定・処理された、ガラス化液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、ガラス化液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。またガラス化液吸収体の厚みＴはガラス化液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
Ｐ：空隙率（％）
Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ２）
Ｔ：ガラス化液吸収体の厚み（μｍ）
　本発明のガラス化液吸収体の面積は、細胞または組織と共に滴下されるガラス化液の滴下量等に応じて適宜設定すればよく特に限定されないが、例えば、滴下するガラス化液１μＬにつき１０ｍｍ２以上とすることが好ましく、２０～４００ｍｍ２とすることがより好ましい。
　本発明のガラス化凍結保存用治具が有するガラス化液吸収体が支持体を有する場合、かかる支持体としては光透過性支持体が好ましく、全光線透過率が８０％以上である光透過性支持体がより好ましい。また、光透過性支持体のヘーズ値は１０％以下であることが好ましい。この様な支持体としては例えば、各種樹脂フィルム、ガラス、ゴム等が挙げられる。本発明の効果を奏する限り、２種以上の支持体を組み合わせて用いてもよい。中でも樹脂フィルムは、取扱い性が優れている点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられ、その厚さは１０～１０００μｍであることが好ましい。また、接着層との接着強度を高めるために、支持体の表面をコロナ放電処理により易接着処理することもできる。
　本発明のガラス化凍結保存用治具が有するガラス化液吸収体が接着層を有する場合には、湿気硬化性の接着物質に代表されるような瞬間接着物質、ホットメルト接着物質、光硬化性接着物質などを用いた一般的な接着方法が利用でき、例えば、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性接着物質、酢酸ビニル系接着物質、アクリル系接着物質、エポキシ系接着物質、ウレタン系接着物質、エストラマー系接着物質、シアノアクリレート系接着物質、フッ素系接着物質、シリコン系接着物質、ニトロセルロース系接着物質、ニトリルゴム系接着物質、スチレン―ブタジエン系接着物質、ユリア樹脂系接着物質、スチレン系樹脂接着物質、フェノール樹脂系接着物質、ポリイミド系接着物質、ポリアミド系接着物質、ポリエステル系接着物質、ビスマレイミド系接着物質、オレフィン系接着物質、ＥＶＡ系接着物質などの非水溶性接着物質が好ましく利用できる。該接着層は、一種類の接着物質を含有してもよいし、複数種類の接着物質を含有してもよい。接着層の固形分量は、０．０１～１００ｇ／ｍ２の範囲が好ましく、更に０．１～５０ｇ／ｍ２の範囲がより好ましい。
　また、該接着層にはガラス化液を吸収しうる効果を付与することも可能であり、このような観点からは、該接着層に、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性接着物質を含有させることが好ましい。また、支持体とガラス化液吸収体との接着強度の観点からは、アクリル系接着物質、エポキシ系接着物質、ウレタン系接着物質、エストラマー系接着物質、シアノアクリレート系接着物質を接着層に用いることが好ましい。また、接着層には、各種マット化剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤等を含有させることができる。
　以上、本発明におけるガラス化液吸収体を説明してきた。以下にこれらを用いたガラス化凍結保存用治具の構成について説明する。本発明のガラス化凍結保存用治具は上述したようなガラス化液吸収体を有するものであればどのようなものであってもよいが、該ガラス化液吸収体が把持部に接続されていてもよい。把持部を有すると、凍結保存作業時および融解作業時の作業性が良好であるため、好ましい。
　図１は本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具の一例を示す斜視図である。図１においてガラス化凍結保存用治具５は、把持部１とガラス化液吸収体２から構成される。把持部１は耐液体窒素素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いことができる。また基本的にガラス化液吸収体２はハンドリング上、短冊状又はシート状であることが好ましい。
　本発明におけるガラス化液吸収体の一例を、図２に示す。図２は、図１のガラス化液吸収体２の拡大図である。図２のガラス化液吸収体２ａは支持体４上にガラス化液吸収層３を有する。図２に示すガラス化液吸収体２ａは、ガラス化液吸収体の全面にガラス化液吸収層３を有する形態の一例である。
　図１の把持部１とガラス化液吸収体２の接続方法について説明する。把持部１が樹脂の場合、例えば、成形加工するときにインサート成形によりガラス化液吸収体２を把持部１に接続することができる。更に、把持部１に図示しないガラス化液吸収体挿入部を作製して接着剤にてガラス化液吸収体２を接続することができる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコン系やフッ素系の接着剤を好適に用いることができる。
　本発明における細胞または組織のガラス化凍結保存用治具で細胞または組織を長期凍結保存する場合、図１に示す治具本体に安全の為、外界と遮断するためにキャップを被せることも可能である。更に、通常液体窒素は滅菌されておらず、直接液体窒素に接触させて凍結させる場合、ガラス化凍結保存用治具が滅菌されていても無菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞または組織を付着させたガラス化液吸収体にキャップをして、直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、米国・ＥＵなど海外先進国では前記の様に液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流となってきている。この様な理由からキャップは耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては、鉛筆用のキャップや円柱状のストローキャップなどガラス化液吸収体と接触せず、外界と遮断できる様な形状ならどのような形状でもよい。
　図３、図４に、本発明におけるガラス化液吸収体の別の態様の例を示す。図１に示す細胞または組織のガラス化凍結保存用治具において、ガラス化液吸収体を図３、図４に示すものとすることもできる。図３は、複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体２ｂの一例を示す概略斜視図である。また、図４は複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体２ｃの別の一例を示す概略斜視図である。図３及び図４ではガラス化液吸収層３が支持体４上に、不連続であって複数が配置されている。
　前述した図２のようにガラス化液吸収層３が連続した形状である場合、複数の細胞または組織をガラス化液吸収層３に付着させようとすると、ガラス化液はガラス化液吸収層で横方向と厚み方向に広がるため、例えば２個目以降の細胞または組織をガラス化液吸収層３に付着させる場合、ガラス化液の吸収性は低下する場合がある。しかし、図３及び図４のようにガラス化液吸収層３が支持体４上に、不連続で複数設けられているとその様な心配がなく、ガラス化液と共に細胞または組織を各ガラス化液吸収層３に１個ずつ確実に付着させることができる。図３及び図４では、一例として、升目状のガラス化液吸収層３を複数配置した。図３及び図４に示すガラス化液吸収体２ｂ及びガラス化液吸収体２ｃは、支持体上の一部にガラス化液吸収層を有するガラス化液吸収体の一例でもある。
　本発明のガラス化凍結保存用治具は、例えば、クライオトップ法において好適に用いられるものである。本発明のガラス化凍結保存用治具を用いると、細胞または組織の凍結時及び融解時に細胞または組織の外に存在するガラス化液による損傷を受けにくく、細胞または組織を優れた生存率で凍結保存することができる。
　本発明のガラス化凍結保存用治具を用いて細胞または組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず、ガラス化液に浸漬した細胞または組織をガラス化液と共にガラス化液吸収体上に滴下し、該細胞または該組織の周囲に付着しているガラス化液をガラス化液吸収体に吸収させる。次いで、前記細胞または前記組織をガラス化液吸収体上に保持させたまま液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞または組織を凍結することができる。ガラス化液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、上述したグリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの各種耐凍剤を含有する水溶液を使用できる。
　本発明のガラス化凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子または胚、精子等の生殖細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一または複数の実施形態において、繊維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種または異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋、軟骨等の組織が挙げられる。本発明のガラス化凍結保存用治具は、直接生体から採取した細胞または組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２－２０５５１６号公報に記載されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織のガラス化凍結保存においても好適に用いることができる。
　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲において様々な変形や修正が可能である。
　（実施例１）
　コロナ放電処理により、表面が易接着処理された厚さ２５０μｍ、ヘーズ値５．５％、全光線透過率９１％の透明ＰＥＴフィルム上に、接着層として、ウレタン系接着物質を乾燥時質量１０ｇ／ｍ２で塗布した。接着層が硬化する前に、多孔質構造体として、延伸によって製造された多孔質膜であるポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径０．１μｍ、膜厚３０μｍ、空隙率８０％、ポリビニルアルコールによって親水化処理）を接着層に重ねて乾燥させ、ガラス化液吸収体２を作製した。このガラス化液吸収体４０ｍｍ２をＡＢＳ（アクリロニトリル－ブタジエンースチレン）樹脂製の把持部１と接合させ、図１に示す形態で実施例１のガラス化凍結保存用治具５を作製した。
　（実施例２）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径０．５μｍ、膜厚３５μｍ、空隙率７９％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例２のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例３）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径１μｍ、膜厚８５μｍ、空隙率８０％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例３のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例４）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径１０μｍ、膜厚８５μｍ、空隙率８０％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例４のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例５）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリビニリデンジフロライド多孔質膜（屈折率１．４２、細孔径０．１μｍ、膜厚１２５μｍ、空隙率７０％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例５のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例６）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリビニリデンジフロライド多孔質膜（屈折率１．４２、細孔径０．５μｍ、膜厚１２５μｍ、空隙率７０％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例６のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例７）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリビニリデンジフロライド多孔質膜（屈折率１．４２、細孔径５μｍ、膜厚１２５μｍ、空隙率７０％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例７のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（比較例１）
　多孔質構造体として、セルロースアセテート多孔質膜であるアドバンテック社製セルロースアセテートメンブレン（屈折率１．４７、細孔径０．５μｍ、膜厚１２５μｍ、空隙率６８％）を用いた以外は実施例１と同様に、比較例１のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（比較例２）
　多孔質構造体として、セルロースアセテートとニトロセルロースからなる多孔質膜であるアドバンテック社製セルロース混合エステルメンブレン（屈折率１．５１、細孔径０．５μｍ、膜厚１４５μｍ、空隙率７８％）を用いた以外は実施例１と同様に、比較例２のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（比較例３）
　多孔質構造体として、親水化処理されたポリエチレン焼結微粒子からなる多孔質膜（屈折率１．５１、細孔径４３μｍ、膜厚５００μｍ、空隙率４２％）を用いた以外は実施例１と同様に、比較例３のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（比較例４）
　多孔質構造体として、ＰＥＴフィルム上に、アルミナ微粒子（屈折率１．６５）と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、屈折率１．５２～１．５５）からなるバインダーとを、９０質量％のアルミナ微粒子と１０質量％のバインダーの比率で混合した塗工層を塗工してなるアルミナ多孔質膜（細孔径０．０８μｍ、膜厚１１０μｍ、空隙率５５％）を用いた以外は、実施例１と同様に比較例４のガラス化凍結保存用治具を作製した。なおアルミナ多孔質膜の細孔径は、バブルポイント試験により得られないので、水銀圧入法により測定した細孔分布において、累積５０％径として得た。
　（比較例５）
　セルロース繊維からなる濾紙であるアドバンテック社製濾紙Ｎｏ．５Ｃ（屈折率１．５０、坪量１２０ｇ／ｍ２、密度０．５７ｇ／ｃｍ３）をガラス化液吸収体として用いた以外は実施例１と同様に、比較例５のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（比較例６）
　無色透明なフィルムである透明ＰＥＴフィルム（厚さ２５０μｍ、全光線透過率９１％、空隙率０％）をガラス化液吸収体とした用いた以外は実施例１と同様に、比較例６のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　＜凍結保存作業時の細胞の視認性の評価＞
　実施例１～７及び比較例１～６の各ガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として含むガラス化液１μＬ（マイクロリットル）を滴下付着させた。なお、ガラス化液は、シグマアルドリッチ社製　修正ＴＣＭ１９９培地に、２０容積％血清、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、０．２容積％スクロースが含まれる組成のものを用いた。滴下付着後、透過型光学顕微鏡（オリンパス（株）製、ＳＺＨ－１２１）にて、ガラス化液吸収体上に滴下した疑似細胞を観察できるかどうかを以下の基準で評価した。これらの結果を、表１の「凍結保存作業時の細胞の視認性」の項目に示す。
　細胞の視認性は以下の基準で評価した。
◎：疑似細胞が容易に観察できる。
○：疑似細胞が観察できる。
×：疑似細胞の観察が困難またはできない。
　＜ガラス化液の吸収性の評価１＞
　実施例１～７及び比較例１～６の各ガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として含むガラス化液１μＬを滴下付着させた。なお、ガラス化液は、シグマアルドリッチ社製　修正ＴＣＭ１９９培地に、２０容積％血清、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、０．２容積％スクロースが含まれる組成のものを用いた。滴下付着後、落射型光学顕微鏡（オムロン（株）製、ＶＣ４５００－Ｓ１）にて、疑似細胞周辺のガラス化液が吸収される様子を観察し、以下の基準で評価した。これらの結果を、表１の「凍結保存作業時のガラス化液の吸収性（１）」の項目に示す。
　ガラス化液の吸収性の評価は以下の基準で評価した。
◎：ガラス化液滴下付着後、１０秒以内にガラス化液が全て吸収された。
○：ガラス化液滴下付着後、１０秒後ではガラス化液は残るものの、吸収される様子が観察された。
×：ガラス化液滴下付着後、ガラス化液の吸収がほとんど見られなかった。または全く見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例８）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径０．１μｍ、膜厚３５μｍ、空隙率７１％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例８のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例９）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径０．２μｍ、膜厚３５μｍ、空隙率７１％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例９のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　（実施例１０）
　多孔質構造体として、多孔質膜の特徴が実施例１と異なる、ポリビニルアルコールにより親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔質膜（屈折率１．３５、細孔径０．５μｍ、膜厚６５μｍ、空隙率７９％）を用いた以外は実施例１と同様に、実施例１０のガラス化凍結保存用治具を作製した。
　＜ガラス化液の吸収性の評価２＞
　上記した実施例３、実施例６、実施例８～１０、比較例１、比較例２、比較例５、および比較例６の各ガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として含むガラス化液０．２μＬ(マイクロリットル) を滴下付着させた。なお、ガラス化液は、１３７ｍＭ(ミリモル)のＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．９ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭのグルコース、０．３ｍＭのピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ(ミリリットル)の硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭのＬ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭのトレハロース、３０容積％エチレングリコール、０．５容積％グリセロール、５００ｍＭのスクロースの組成にｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれるものを用いた。滴下付着後、落射型光学顕微鏡にて、疑似細胞周辺のガラス化液が吸収される様子を観察し、以下の基準で評価した。これらの結果を、表２の「凍結保存作業時のガラス化液の吸収性（２）」の項目に示す。
◎：ガラス化液滴下付着後、１０秒以内に細胞周辺のガラス化液が全て吸収された。
○：ガラス化液滴下付着後、１０秒後ではガラス化液は残るものの、吸収される様子が観察された。
×：ガラス化液滴下付着後、ガラス化液の吸収がほとんど見られなかった。または全く見られなかった。
　＜融解作業時の細胞の視認性＞
　マウス胚に下記に記載の平衡処理を行った後、平衡処理後のマウス胚を前記したガラス化液の吸収性の評価２において用いたガラス化液と共に、実施例３、実施例６、実施例８～１０、比較例１、比較例２、比較例５、および比較例６の各ガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に滴下付着させ、液体窒素に直接浸漬し、ガラス化凍結保存した。なお平衡処理は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．９ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭのグルコース、０．３ｍＭのピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌの硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭのＬ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭのトレハロースの組成にｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれたガラス化基礎液中に、マウス胚を１０分間浸漬させた後に一旦取り出し、次いで取り出したマウス胚を、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．９ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭのグルコース、０．３ｍＭのピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌの硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭのＬ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭのトレハロース、７容積％エチレングリコール、０．５容積％グリセロールの組成にｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれたガラス化前処理液中に、５分間浸漬させることで行った。また前記した平衡処理後のマウス胚とは、該ガラス化前処理液中から取り出したマウス胚を指す。その後、ガラス化凍結保存されたマウス胚を実施例３、実施例６、実施例８～１０、比較例１、比較例２、比較例５、および比較例６の各ガラス化凍結保存用治具と共に取り出し、３７℃の融解液に浸漬させた。なお、融解液は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．９ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭのグルコース、０．３ｍＭのピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌの硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン、３００ｍＭのスクロースの組成にｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれるものを用いた。融解液中で、ガラス化液吸収体上のマウス胚を透過型光学顕微鏡で観察し、マウス胚の視認性を以下の基準で評価した。これらの結果を、表２の「融解作業時の細胞の視認性」の項目に示す。
◎：マウス胚が容易に視認できる。
○：マウス胚が視認できる。
×：マウス胚の視認が困難またはできない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜マウス胚の生存率の評価＞
《胚盤胞期胚の採取》
　８～１３週齢のＩＣＲ系成熟雌マウスを自然交配させ、膣栓の有無により交尾を確認した。交尾が確認された雌マウスに対して、交尾確認日を１日として、約７７時間後ＫＳＯＭ／ａａ（含ＰＶＰ）で子宮を灌流し、マウス胚盤胞期胚を採取した。
《胚のガラス化凍結保存》（実施例３、実施例９のガラス化凍結保存用治具）
　上記のように採取したマウス胚をｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれるもの修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．９ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭのグルコース、０．３ｍＭのピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌの硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭのＬ－ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭのトレハロース）に、１５℃の環境下で１０分間浸漬させた。その後、温度１５℃の平衡液（７容積％エチレングリコール、０．５容積％グリセロール、９２．５容積％上記修正リン酸緩衝液）に５分間浸漬させた。次いで、温度４℃のガラス化液（３０容積％エチレングルコール、０．５容積％グリセロール、６９．５容積％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた。３０秒間の浸漬後、マウス胚を実施例３および実施例９のガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に置き、顕微鏡観察下でマウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収したことを確認した後に、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させたガラス化凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。マウス胚をガラス化凍結保存用治具上に置く際のガラス化液の液量は、使用するガラス化凍結保存用治具の吸収性にあわせて、およそ０．２～１μｌの範囲で行った。
《胚のガラス化凍結保存》（比較例６のガラス化凍結保存用治具）
　上記のように採取したマウス胚を温度１５℃の上記修正リン酸緩衝液に１０分間浸漬させた。その後、温度１５℃の上記平衡液に５分間浸漬させた。次いで、温度４℃の上記ガラス化液に浸漬させた。３０秒間の浸漬後、マウス胚を比較例６のガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に置き、顕微鏡観察下でマウス胚周辺の余分なガラス化液を可能な限り除去した後に、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させたガラス化凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
　なお、上記した実施例３、実施例９および比較例６のガラス化凍結保存用治具を用いた胚のガラス化凍結保存において、胚をガラス化液吸収体上に置いてからガラス化凍結するまでの時間は、北里コーポレーション社のプロトコールに従い、１分以内（マウス胚をガラス化液に浸漬させてから、凍結するまで１分３０秒以内）で行った。
《胚の融解方法》
　マウス胚を載置したガラス化保存用治具を液体窒素中からとりだし、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。およそ１分間の浸漬の後に、融解液中からマウス胚を回収し、次いで温度３７℃の希釈液（上記修正リン酸緩衝液に０．５Ｍスクロースを添加した溶液）にマウス胚を浸漬させた。希釈液への浸漬時間は約３分間である。その後、温度３７℃の上記修正リン酸緩衝液に５分間浸漬させた。
《生存率の評価》
　上記の融解方法により融解したマウス胚を、マウス胚用の発生培地であるＫＳＯＭ／ａａ（含ＢＳＡ）に移し、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、３７℃飽和湿度の条件下で培養を行った。培養開始から４時間毎に観察を行い、培養後２４時間までに胞胚腔が再形成したものを生存と判定した。この様にして生存と判定された胚の個数の割合は、実施例３のガラス化凍結保存用治具では９５．４％、実施例９のガラス化凍結保存用治具では１００％、比較例６のガラス化凍結保存用治具では４２％であった。
　以上の結果から、本発明のガラス化凍結保存用治具によって、細胞または組織のガラス化凍結作業、および凍結後の融解作業を容易にかつ確実に行うことが可能であることが判る。さらに本発明のガラス化凍結保存用治具によって、細胞または組織の極めて高い生存率を得ることができる。
　本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用または移植用の細胞または組織、生体外で培養した細胞または組織などの凍結保存に用いることができる。
１　把持部
２　ガラス化液吸収体
２ａ　ガラス化液吸収体
２ｂ　ガラス化液吸収体
２ｃ　ガラス化液吸収体
３　ガラス化液吸収層
４　支持体
５　ガラス化凍結保存用治具

Claims (3)

  1. 　屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体をガラス化液吸収体として有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
  2. 　請求項１に記載の多孔質構造体の細孔径が５．５μｍ以下である、細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
  3. 　請求項２に記載の多孔質構造体がフッ素樹脂多孔体である、細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
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