JPH10248860A - ストロー内希釈型の哺乳動物胚ガラス化保存 ストロー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ストロー内において、内部に哺乳動物胚
を有するガラス化保存液層と希釈液層とを隣接して設け
るとともに、その両端部に空気層を配してなること、を
特徴とするストロー内希釈型の哺乳動物胚ガラス化保存
ストロー。ガラス化保存液としては、４０％エチレング
リコール、１８％フィコール、０．３Ｍシュークロース
を添加したＰＢ１液（ＥＦＳ４０）が好適である。 【効果】 液体窒素中に保存した本ストローを、温水に
ごく短時間浸漬、融解するだけで、細胞の傷害が小さ
く、高い生存性を保った哺乳動物胚を容易に得ることが
でき、胚移植、実験等に活用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ストロー内希釈型
の哺乳動物胚ガラス化保存ストローに関するものであ
り、本発明は胚の保存、融解及び移植に広く利用するこ
とができるものである。

【０００２】

【従来の技術】優良な形質をもった動物を増産するため
に、雌の生殖器から回収した受精卵（胚）や体外受精に
よって作製した胚をレシピエント（受卵動物）に移植し
て子畜を得る、胚移植技術が普及してきた。胚は、レシ
ピエントの性周期に応じた時期に移植する必要があるた
め、生存率を低下させずに胚を凍結保存する技術は不可
欠である。現在、牛胚やマウス胚では、−３０℃前後ま
でを毎分−０．３〜−０．５℃の極めて緩慢な速度で冷
却したのち液体窒素に投入して保存する緩慢凍結法が広
く用いられている。

【０００３】しかしこの緩慢凍結法では、細胞外の氷晶
に由来する物理的障害を完全に回避することはできな
い。融解後の胚にはしばしば物理的な亀裂が見られ、フ
ラクチャー傷害と呼ばれている。ウシ胚においても見ら
れるが（２９％、Lehn-Jensenand Rall,1983）、特にウ
サギ胚においては重要で、ムチン層や透明帯の物理的傷
害は、５０％に達することもあり（Landa，1982）、着
床前後の発育にとって致命的なことが知られている。凍
結融解ウサギ胚の移植後の発育率（胎仔数／移植胚数）
は２３〜４８％であった（Tsunoda et al., 1982; Koji
ma et al., 1990）。従って、生存性の面から現在のレ
ベル以上の大きな改善は望めない。さらに、植氷と緩慢
冷却に手間と時間を要し、温度制御に高価な機器を必要
とするなどのデメリットもあり、より簡易な胚の保存方
法が求められてきた。

【０００４】近年、究極的な簡便法として開発されたの
が、ガラス化法（Rall & Fahy,1985,Nature 313, 573-5
76）である。ＥＦＳ４０（ガラス化保存液、後述）によ
るウサギ胚のガラス化保存では、透明帯の傷害率はわず
か３．６％（１３／３６１）であり、保存胚の９２％を
移植して、移植胚の６５％が末期の胎仔まで発育するな
ど、移植後の発育率も極めて高い（Kasai et al., 199
2）。また、最近マウス胚を使用した実験で、ガラス化
法ではフラクチャー傷害を完全に防止しうることも明ら
かにされている（Kasai et al., 1996）。

【０００５】ガラス化の原理は、次の通りである。水溶
液にグリセロールやエチレングリコールなどの耐凍剤を
多量に加えると、溶液の凝固点が低下し、氷点下でも氷
晶ができにくくなる。この溶液を急速に液体窒素中に冷
却すると、氷晶を生じさせないまま固体化させることが
できる。これは、本来の凝固点を速く通過するために過
冷却が生じ、水分が結晶化することなくガラス状の固体
になるもので、ガラス化と呼ぶ。ガラス化した固体を加
温すると、−１３０℃付近で液状に戻るが、耐凍剤の濃
度が十分高くない場合には、本来の凝固点付近（通常−
６０〜−４０℃）で氷晶が生じる可能性がある。加温時
に、ガラス化していた溶液に氷晶が生じる現象を脱ガラ
ス化と呼ぶ。脱ガラス化は、氷晶が細胞外だけに留まっ
ていれば、細胞の生存にとって悪影響を与えないと考え
られるが、細胞外の氷晶によって細胞内が植氷され、細
胞内に氷晶形成を引き起こす可能性が高まる。細胞内の
氷晶形成は細胞の死滅につながる。

【０００６】ガラス化法を用いると、細胞内外とも氷晶
がないために物理的障害を完全に回避することが可能で
ある。しかも、サンプルを室温から直接液体窒素に浸し
て保存できるために、温度制御のための機器は必要な
く、冷却に要する時間もわずか数秒間である。ガラス化
法を用いた実験動物胚の超低温保存では、生存率が極め
て高く維持される条件が明らかにされており（Kasai et
al, 1990, J. Reprod.Fertil. 89, 91-97）、家畜胚に
おいてもその有効性は確認されている（Tachikawa et a
l., 1993, Mol. Reprod. Dev. 34, 266-271）。

【０００７】ガラス化法の唯一の問題点は、保存液に含
まれる極めて高濃度の保護物質（耐凍剤）による化学的
毒性である。これを避けるために、融解後はただちに保
存液を希釈することが必要である。

【０００８】現在、家畜の胚移植では、ウシの胚移植が
最も普及している。ウシ胚は、細型ストローに充填して
液体窒素中に保存するのが一般的である。現在普及して
いる緩慢凍結法で保存した胚を移植する場合、ストロー
中の保存液の毒性が低いため、融解後ストローから胚を
取り出さず、そのままレシピエント雌牛の子宮に注入す
る方法（直接移植法；ダイレクト・トランスファー）が
可能である。従って、人工授精における精液と同様に、
庭先での直接移植が一般に行われている。一方ガラス化
法で保存した胚（ガラス化保存胚）を移植する場合は、
保存液の毒性が強いため、ストロー内で融解した胚を一
旦ストローから取り出して、保存液を希釈し、胚の中に
浸透している耐凍剤を除去しなければならない。そして
再度胚を移植用のストローに充填し直すことになるが、
この時の胚の操作には顕微鏡等が必要であり、庭先での
作業は困難となる。従って、ガラス化保存胚の利用を実
用的にする為には、ストロー内で保存液を希釈できるよ
うに工夫し、従来の緩慢凍結法の場合と同様に、庭先で
の直接移植が行えるようにする必要がある。

【０００９】また、ウシガラス化保存胚の利用を普及さ
せる為には、体外受精卵にも応用できることが必要とな
る。移植する時に用いる体外受精卵の発育段階は、一般
に胚盤胞や拡大胚盤胞である。胞胚腔の拡大した胚盤胞
期胚は、ガラス化処理する場合に胞胚腔内への耐凍剤の
透過と濃縮が不十分となり、８細胞期胚〜初期胚盤胞に
比べてこれまで相対的に生存性が低くなると見られた。
胚盤胞期の胚に対し最も安定して高い生存率の得られる
方法として、２段階ガラス化法（Zhu et al.,J. Repro
d. Fertil., 98, 139-145)が挙げられる。彼らは、エチ
レングリコール濃度の低い溶液で胚を事前に平衡処理
（前処理）したのちガラス化溶液に移すことによって、
胞胚腔の拡大した胚盤胞を効率的にガラス化しうること
を示した。しかし、彼らの方法は、融解後に胚をストロ
ー外に取り出して融解・希釈することを前提としてい
る。

【００１０】したがって、ガラス化法を実用化し、普及
させる為には、胚盤胞期の胚でも安定して高い生存率が
得られ、しかもストロー内希釈ができる新しい技術の開
発が必要である。

【００１１】ストロー内希釈を行うための手法について
は、従来の緩慢凍結法やガラス化法を含めて既にいくつ
か報告されており、『振とう法』または『重層法』が挙
げられる。

【００１２】『振とう法』：従来の緩慢凍結法において
は、ウシ胚のストロー内希釈法が報告されている（Leib
o, 1983, Cryo-Lett., 4, 387-400)。これは、ストロー
内に、保存液と希釈液を空気層を介して配置し、体温計
を振る要領で両液を混合させて希釈するものである。ガ
ラス化保存胚においても、同様の試みが報告されている
（Wurthe et al., 1994, Theriogenology 42, 1275-128
4; Vajta et al., 1995, Vet. Rec, 137, 672; Leeuw e
t al., 1995, Cryobiology 32, 157-167)。しかし、ガ
ラス化法では、保存液の粘度が高いために両液層が必ず
しもスムーズに混和するとは言えず、この振とう法は適
していないと思われる。Wurthe et al.(1994）の報告で
は、胚移植後の妊娠率は低く（２４％、２０／８５）、
またVajta et al. (1995）は、胚移植実験を行っていな
い。

【００１３】『重層法』：比重の大きい保存液と比重の
小さい希釈液を、ストロー内で空気層を介さずに縦向き
に重層して配置すれば、希釈時にストローの向きを逆に
すると、比重の差により、重い保存液が軽い希釈液の中
を下降していく。ガラス化保存胚にも、この原理を利用
して両液を混合させる方法が提案されている（Ishimori
et al., 1993, Theriogenology 39, 238; Kuwayama et
al., 1994, Cryobiology 31, 609-610）。しかし、先に
述べた様に、胚盤胞期の胚を安定してガラス化保存する
為には、２段階ガラス化法で胚をガラス化処理する必要
がある。しかし、彼等が使用した耐凍剤濃度の低い溶液
で前処理した胚を、ガラス化保存液に導入し、その上に
希釈液を重層する重層法を用いた場合、基本的に以下の
様に問題点がある。

【００１４】◎ ガラス化保存液の比重は、前処理に用
いた耐凍剤濃度の低い溶液（前処理液）に比べかなり重
く、胚を前処理後にガラス化保存液に導入すると浮上し
てしまう。従って、ガラス化保存液の上に希釈液を重層
させた場合、胚が希釈液側に移動してしまい、胚の脱ガ
ラス化が起こる危険性が高くなる。 ◎ ストローを室温の水中に浸して希釈する時、希釈液
内に比較的大きな気泡が発生しやすい。気泡が発生して
浮上し、ストロー内のガラス化保存液の付近で結集する
と、気泡が塞ぐ形になり、ガラス化保存液の下降が中断
され、希釈できない。 ◎ ストローを横向きに置いて操作した場合、重層した
ガラス化保存液と希釈液が、比重の差により両液の境界
面が崩れてしまう。従って、重層法では縦向きの操作が
必要だが、この場合、重層と封入に時間を要し、その間
に毒性の影響を受けてしまう。

【００１５】Ishimori et al., (1993）の方法は、２段
階ガラス化法と重層法を組み合わせているが、未だ充分
ではなく、以下の様な問題点が挙げられる。 ◎ −２０〜−２５℃に冷却したガラス化保存液に胚を
注入する方法なので、ガラス化保存液の粘性が増し、操
作がしにくく不確実となる。また、ガラス化保存液の温
度制御に高度な機器を必要としている。 ◎ ガラス化保存液の粘性が強い為、胚をストロー内か
らウシ体内に排出する時に、胚がガラス化保存液に取り
込まれ、ストロー内に付着して残る可能性が若干ある。
そこで、胚を確実に移植する為には、胚がストロー先端
近くに位置していることが好ましいが、この方法では、
希釈によって反対側の綿栓側に移動することになる。

【００１６】Kuwayama et al. (1994）の方法も、簡易
な方法で２段階ガラス化法と重層法を組み合わせて、成
果も挙げているが、この方法も未だ充分なものではな
く、以下の様な問題点が挙げられる。 ◎ 希釈後の胚のストロー内での位置については、Ishi
mori et al.と同様の問題が残る。 ◎ 希釈液の材料に卵黄を用いており、個々の卵黄の質
の差による希釈液の質のばらつき、および希釈液の保存
性に問題がある。

【００１７】◎ ストロー内でのガラス化保存液のカラ
ム（円柱状の層）の作成方法は、希釈液と連続した吸引
による方法を用いている。この方法は、希釈液とガラス
化保存液が接する部分で若干両液の混合が起きるため、
ガラス化保存液の濃度を維持するためには、ガラス化保
存液のカラムの長さは１０ｍｍ程度は必要となり、ガラ
ス化保存液の量が多くなってしまう。ストロー内希釈を
行う際、ガラス化保存液の融解後の希釈倍率を高めるた
めには、ガラス化保存液は量が少ない事が望ましい。実
際には、ガラス化保存液は希釈液にそれほど容易に混合
はしないため、融解後、ガラス化保存液はストローの下
部に下降して沈殿し、胚は希釈液中に止まって浮遊して
いることが多いが、その場合も、ガラス化保存液が量が
多いと、胚がガラス化保存液の中から脱出できない確率
が高くなる。また、胚をストローから家畜等に移植する
場合、ストローを平行に戻して作業する時、あるいは、
胚がストローから子宮内に排出された時に、再度ガラス
化保存液が胚に接触する可能性もあるので、やはりガラ
ス化保存液の量は少ない方が良い。 ◎ 透過性耐凍剤濃度が低く（３０％エチレングリコー
ルまたは３０％グリセロールを使用）、脱ガラス化しや
すい保存液を用いており、希釈液と保存液が接する重層
法では細胞内外の氷晶が生じやすい。 ◎ 前処理に５分間を要しており、多数の胚をガラス化
処理する場合は、長時間を必要とする。

【００１８】以上述べたように、いずれも充分に満足で
きるものではなく、更に大幅な改良、修正が要求され
る。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記し
た当業界における技術の現状及び要望に鑑み、ガラス化
保存法を実用化することを目的として、次のような技術
課題を新たに設定した。

【００２０】ガラス化保存した胚が、融解・希釈後に
ストローの先端に位置する様にする。 希釈液の重層、シール（熱処理によるストロー先端の
封鎖）の操作は、縦向きに行う。 前処理を終えた胚をガラス化保存液内に導入した時、
胚がガラス化保存液内を浮上して希釈液に接触する事を
防ぎ、しかもストロー内のガラス化保存液は、少量に抑
える様にする。 前処理の作業が確実に、能率よく短時間に行えるよう
な前処理液を用いる。 胚のガラス化保存液への注入、希釈液の重層、シール
までの一連の作業を、胚がガラス化保存液の毒性の影響
を受けない時間内に終える様にする。 胚を注入する時のガラス化保存液の温度は、操作を確
実に行える室温とし、温度制御等の高度な機器を使用し
ない。 ストローを融解・希釈する段階で起こりやすい、希釈
液内からの気泡の発生を抑制する。

【００２１】

【課題を解決するための手段】上記したように新たに設
定した技術課題を一挙に解決するため、本発明者（葛
西：高知大学）は、各方面から鋭意研究の結果、従来既
知の方法とは発想を全く異にする下記ａ）〜ｄ）の手段
からなる新しい方法により、上記した技術課題を一挙に
解決できるとの有用な新知見を得た。

【００２２】ａ）ストロー内への溶液の導入における新
しい重層配置方法の使用 スパイナル針、先を長く伸ばしたピペット等を用い、ス
トローの奥（綿栓側）にガラス化保存液のカラムを作
り、その上に直接希釈液を重層する。 ｂ）前処理液、ガラス化保存液の組成の改善 前処理液、ガラス化保存液に、Ficoll, Sucroseなどの
細胞非透過性物質を高濃度に含む溶液を使用する。 ｃ）耐凍剤の毒性を緩和できる処理過程での氷水の利用 胚をガラス化保存液で一定時間平衡させた後、氷水を利
用してガラス化保存液の毒性を停止させ、残りの作業を
行う。 ｄ）気泡の発生を最小に抑える、ストローの冷却および
融解方法 ○冷却は、ストローを液体窒素ガスの中に数分間静置す
ることにより行う。 ○融解・希釈は、ストローを十数秒間室温の空気中で保
持した後、一旦氷水中に浸し、その後室温水中に浸す。
あるいは、ストローを数秒間室温の空気中で保持した
後、綿栓を上にし、ストロー下部（シール部分）の空気
層の部分と、希釈液の端部を数ミリ室温水中に数秒間浸
し、希釈液の先端（空気層との境界）を液状とした後、
ストロー全体を水中に浸す。

【００２３】この新知見を基に、そして他の発明者とも
協力して、遂に本発明は完成されたものであって、本発
明は、ストロー内において、内部に哺乳動物胚を１個又
はそれ以上有するガラス化保存液層と希釈液層とを隣接
して設けるとともにその両端部に空気層を配してなる基
本構造からなるストローに関するものであり、実際の使
用に当っては、液体窒素中に保存した本ストローを、温
水にごく短時間浸漬、融解するだけで、ストロー内で希
釈し終えた生存性の高い胚を確実に得ることができる。

【００２４】このように本発明に係るストローは、実験
室内はもとより野外においても簡単に哺乳動物に対して
使用することができ、しかも、融解したガラス化保存液
によって胚がダメージを受けることがない。以下、本発
明について詳しく述べる。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明に係わるストローを作成す
るには、先ず、対象哺乳動物に合わせて、常用されるプ
ラスチック製の細管からなる人工授精用ストロー又は受
精卵移植用ストローを用意する。ストローから希釈液を
吸引して綿栓（プラグ）に密着させる。あるいは、希釈
液をスパイナル針やピペットを用いて綿栓側に注入す
る。次いで、希釈液から間隔をあけて、ストローの奥
（線栓側）にスパイナル針等を用いてガラス化保存液を
注入する。

【００２６】このガラス化保存カラム内に、予め前処理
液に浮遊、平衡しておいた胚を、長く伸ばしたパスツー
ルピペット等を用いて注入する。この時、前処理液から
ストロー内の該カラム内に胚を移す前に、別途用意した
ガラス化保存液と同じ保存液内で胚をピペッティング処
理すれば、胚の生存率は安定して高くなる。

【００２７】次いでストローを、綿栓部を下にして縦方
向に正立させ、氷水中に浸し、ガラス化保存液カラムの
上に希釈液を静かに重層した後、空気層を介してストロ
ーの先端を熱シールする。得られたストローは、液体窒
素ガス中に静置して冷却するが、この際、必らずしもス
トローを縦方向に正立させる必要はなく、適宜冷却処理
すればよい。なお、冷却時に、ガラス化保存液カラム内
に隣接する希釈液が円錐状に伸長凍結して両者の境界が
不明瞭となる現象が生じてガラス化保存液中の胚がダメ
ージを受ける危険性があるときには、綿栓側の希釈液の
量を増量すればよい。

【００２８】このようにして作成した哺乳動物胚ガラス
化保存ストローは、液体窒素からとりだした後、１分以
内というごく短時間、空気中次いで氷水中に保存した
後、温水に数分間浸すだけで、気泡の発生なしでストロ
ー内希釈が行われる。あるいは、より簡易な融解・希釈
方法として、ストローを液体窒素から取り出した後、数
秒間室温の空気中で保持した後、綿栓を上にし、ストロ
ーの下部（シール部分）の空気層の部分と、希釈液の端
部を数ミリ室温水中に数秒間浸し、希釈液に端部（空気
層との境界）を液状とした後、ストロー全体を水中に数
分間浸す、という方法でも、ストロー内希釈が行われ
る。希釈液の毒性は小さい為、希釈後は、胚をストロー
内で保留させても、数分間は生存性に影響はない。従っ
て、この間に、ストローの熱シール側の空気層の部分を
カットして、綿栓側からストロー内部を押し出せば、生
存性の高く保たれた胚が得られるので、胚移植あるいは
実験等に利用すれば好適である。

【００２９】本発明において、哺乳動物としては、ウ
シ、ウマ、ヤギ、メン羊、ウサギ、マウス、ラット等の
家畜、実験動物のほか、哺乳動物であればすべてのもの
が包含される。そして、保存液に注入する胚の数も、１
個に限定されることなく、２個以上注入することができ
る。

【００３０】本発明において使用するガラス化保存液
は、細胞透過性耐凍剤、細胞非透過性易ガラス化物質、
細胞非透過性脱水促進物質を含有するものである。細胞
透過性耐凍剤としては、エチレングリコール、グリセロ
ール、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、プロピレ
ングリコール、プロパンジオール、１，３−ブタンジオ
ール等が一種又は二種以上使用される。細胞非透過性易
ガラス化物質としては、フィコール（Ficoll）、パーコ
ール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニー
ルピロリドン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等が一種
又は二種以上使用される。細胞非透過性脱水促進物質と
しては、シュークロース、トレハロース、グルコース、
ガラクトース等が一種又は二種以上使用される。

【００３１】ガラス化保存液の好適例としては、エチレ
ングリコールをベースに、フィコールとシュークロース
を加えたＰＢ１液（修正リン酸緩衝生理食塩水）である
ガラス化溶液（ＥＦＳ液）が挙げられる。そして具体的
には、４０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールをベースと
したＥＦＳ４０、２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール
をベースとしたＥＦＳ２０等が例示される。

【００３２】ガラス化保存液は、また、耐凍剤濃度を低
くすれば胚の前処理液としても使用することができる。
そして希釈液としては、シュークロースを添加したＰＢ
１液（具体的には、０．５Ｍ／Ｌシュークロース含有Ｐ
Ｂ１液等）といった常用される希釈液が適宜使用され
る。

【００３３】このようにして、既述した従来法の問題点
〜は、いずれも、既述したａ）〜ｄ）の手段を採用
することによって、すべて解決することができる。

【００３４】すなわち、 ａ）ストロー内への溶液の導入における新しい重層配置
方法の使用 前述したIshimori et alやKuwayama et alの方法は、ガ
ラス化保存液のカラムをストローの入口付近に配置させ
ているので、根本的に方法が異なっている。この方法に
より、前述した、ガラス化保存の実用化の為の課題の
、は解決される。

【００３５】なお、ストロー内に吸引あるいは注入する
希釈液の長さ、及び使用するストロー、スパイナル針等
の長さの違いによって、ガラス化保存液と希釈液の間隔
（空気層の幅）が変わる。空気層の幅が短すぎると、ガ
ラス化保存液と希釈液が接触する恐れがあり、長すぎる
と、後の工程でストローを冷却する際に空気層の縮みの
幅が大きく、ガラス化保存液と、重層した希釈の境界が
崩れてしまう。ストロー冷却後も、ガラス化保存液と、
重層した希釈の境界を明確に保つには、空気層の幅は５
〜７ｍｍとするのが好ましい。その為に、ストロー内に
吸引あるいは注入する希釈液の長さを増量するなどの方
法により調節することが必要である。

【００３６】ｂ）前処理液、ガラス化保存液の組成の改
善 フィコール、シュークロースなどの細胞非透過性物質を
高濃度に含み、細胞透過性物質であるエチレングリコー
ル濃度は低く設定した溶液で胚を処理すると、脱水作用
が強いため、胞胚腔内への透過性耐凍剤の透過は促進さ
れるが、毒性は低い。これは、細胞透過性耐凍剤である
エチレングリコールの毒性がＤＭＳＯ、グリセロール、
プロピレングリコールなどより低く、また分子量が小さ
いため、平衡時の透過や融解後の除去が容易なこと、フ
ィコールはＰＥＧに比べて融解度が高く粘性と毒性は低
い事、さらにシュークロースは脱水を促し、細胞内に透
過するエチレングリコールの量を制限することによって
毒性の影響を緩和し、同時にエチレングリコールの除去
過程の浸透圧的な膨脹も防ぐことなどが、総合的に作用
するためと考えられる。従って、この様な溶液を前処理
液として使用すると、前処理には時間の制限が少なく、
室温で、作業実験に合わせた処理時間で、確実に胚を処
理することができる。同時に、前処理液の比重をガラス
化保存液よりも大きくすれば、前処理した胚をガラス化
保存液に導入すると沈降し、重層する希釈液の反対側へ
移動させることができる。従って、ガラス化保存液のカ
ラムを短くすることができる。ａ）、ｂ）により、前述
の課題の、が解決される。

【００３７】ｃ）耐凍剤の毒性を緩和できる処理過程で
の氷水の利用 胚をガラス化保存するためには、細胞内への耐凍剤の浸
透が必須であり、耐凍剤の浸透を確保するために、室温
でガラス化保存液内で胚を平衡させる必要がある。しか
しガラス化保存液は、耐凍剤濃度が高く毒性が強いた
め、平衡時間を必要以上長くすると、胚の生存性は低下
する。ここで、耐凍剤の浸透性や毒性は、温度に大きく
依存している。そこで、胚を室温のガラス化保存液に移
した後、一定時間保持後は、ストローを氷水に浸すこと
によってガラス化保存液の毒性の影響をほぼ停止させる
ことができる。氷水中で希釈液の重層とシールを行なえ
ば、毒性の影響を受ける心配をせずに、確実な操作が可
能となる。この方法により、前述の課題の、が解決
される。

【００３８】ｄ）気泡の発生を最少に抑える、ストロー
の冷却および融解方法 気泡の発生は、急速な凍結と急速な融解の過程に、水分
の体積が急激に変化することによって生じると推測され
る。従って、気泡の発生の防止のためには、冷却と加温
の時、急速な温度変化を避けることが必要である。そこ
で、冷却は、上記の様に、ストローサンプルを直接液体
窒素に浸すのではなく、液体窒素ガスの中に数分間静置
して冷却速度をやや緩慢にすることにより、気泡の発生
はかなり抑制できる。この冷却法によって生存性が低下
しないことは、すでに確認されている。(Kasai et al.,
1996, Cryobiology, 33, 459-464)。一方融解について
は、ストローを空気中に保持した後、直接温水中に浸す
前に、氷水中に浸すことで急激な温度変化を緩和した。
あるいは、ストローのシール側の希釈液の先端（空気層
との境界）数ミリを、あらかじめ室温水中に数秒間浸し
て液状とすることで、シール側の空気が融解中の希釈液
の層に侵入するのを阻止した。以上の結果、気泡の発生
は、最少に抑制された。この方法により、前述の課題の
が解決される。

【００３９】以上により、前述〜の課題は、すべて
解決される。次に、本発明の実施例について述べる。

【００４０】

【実施例１】上記した本発明の方法によってガラス化保
存し、ストロー内希釈したマウス桑実胚における生存性
について、以下により測定、確認を行った。

【００４１】使用材料および胚の生存性の判定方法を以
下に示す。 （１）保存容器：０．２５ｍｌプラスチックストローを
用いる。 （２）ガラス化保存液（ＥＦＳ４０）：４０％エチレン
グリコール＋１８％Ｆｉｃｏｌｌ（フィコール；分子量
約７０，０００の高分子化合物）＋０．３Ｍシュークロ
ースを添加したＰＢ１液（修正リン酸緩衝生理食塩水）
（Kasai et al., 1990, J.Reprod. Fertil., 89, 91-9
7）を用いる。ＥＦＳ４０の比重；約１．１３９ （３）前処理溶液（ＥＦＳ２０）：２０％エチレングリ
コール＋２４％フィコール＋０．４Ｍシュークロースを
添加したＰＢ１液（Zhu et al., 1993）を用いる。ＥＦ
Ｓ２０の比重；約１．１４８ （４）希釈液：０．５Ｍシュークロースを添加したＰＢ
１液を用いる。 （５）胚の培養液：修正ＫＲＢ液（Toyoda & Chang, 19
74, 36, 9-22）を用いる。 （６）胚の処理温度：２５℃とする。 （７）胚：ＩＣＲ系マウスから採取した、体内受精桑実
胚、およびそれを体外培養して発育させた拡大胚盤胞を
用いる。 （８）胚の生存性の判定：希釈液で希釈した胚は、５分
後にピペットでＰＢ１液に回収し、ついで修正ＫＲＢ液
に移して、炭酸ガス培養器内で培養する。桑実胚の生存
性は拡大胚盤胞への発育能力で、拡大胚盤胞の生存性
は、胞胚腔の再拡大によって、それぞれ判定する。

【００４２】マウス胚のガラス化保存用ストロ−の作
成、冷却、及びストロー内融解、希釈は次のようにして
行う。

【００４３】（Ａ）ストロー内への溶液および胚の導
入：重層法を用いる。 １）ストロー内に希釈液を約１５ｍｍ吸引し移動させ、
綿栓部を塞ぐ。（図１（Ｉ）〜（III）） ２）綿栓を塞いだ希釈液から、約２０ｍｍの空気層を隔
てた箇所に、スパイナル注射針（２１Ｇ×３ １／３、
せき髄麻酔等に用いる長さ約９ｃｍの長針）付注射筒を
用いて、ＥＦＳ４０を５〜１５ｍｍ注入してガラス化保
存液のカラムを作成する。（図１（IV）〜（Ｖ）） ３）胚を１〜５分間、ＥＦＳ２０に浮遊させる前処理を
施す。（図２（VI）） ４）前処理を終えた胚を、少量の前処理液と共に、先を
長く伸ばしたピペットを用いて、ストロー内のガラス化
保存液のカラムの中に注入する。（図２（VII)〜（VII
I）） ５）３０〜６０秒間ガラス化保存液内で胚を平衡させた
後、ストローを、綿栓部を下にして縦向きに正立させ、
氷水中に浸す。（図３（IX）） ６）別のスパイナル注射針付注射筒を用いて、ＥＦＳ４
０の上に直接約７０ｍｍの希釈液を静かに重層する。
（図３（Ｘ）） ７）ストローの先端を熱シールする。（図３（XI））

【００４４】（Ｂ）冷却・保存方法 ８）ストローを氷水中から液体窒素ガス中に移し、縦向
きに静置して希釈液を凍結させる。（図４（XII）） ９）ストローを横向きにして、液体窒素ガス中で数分間
静置する(図４(XIII)） 10）ストローを液体窒素中に
投入する。（保存）（図４（XIV））

【００４５】（Ｃ）ガラス化保存した胚の、ストロー内
での融解・希釈方法 １）ストローを液体窒素から取り出し、十数秒間室温の
空気中で保持する。 ２）ストローを氷水中に浸し、数十秒間保持する。 ３）ストローを氷水中から取り出し、綿栓部を上にして
縦向きに正立させ、２５℃水中で数分間保持する（図５
（XV）〜（XVII）） ４）なお、融解・希釈後にストローをカットする箇所
は、熱シール側の空気層の部分とする。

【００４６】得られた結果を下記表１に示す。従来、緩
慢な凍結方法により凍結・融解された場合の生存率は、
マウス８細胞〜桑実胚では、およそ８０％程度である
（82％, Kasai et al., 1980 ; 72％, Glenister, 1984
; 〜80％, Whittingham, 1980 ; 80％, Quinn and Ker
in, 1986）。また、マウス胚盤胞を同様に処理した場合
の生存率は、８細胞〜桑実胚に比べ若干劣り（７４％、
Whittingham et al., 1979 ; J. Reprod. Fertil. 56,
11-21）、胞胚腔の拡大とともに生存率が低下すること
が示されている（Massip etal., 1984, Cryobiology 2
1, 574-577）。

【００４７】

【表１】

【００４８】表１の結果から、Ａ）〜Ｃ）の方法により
ガラス化保存し、ストロー内希釈をしたマウス胚の生存
率は、桑実胚で９７％、拡大胚盤胞で９５％となり、従
来の緩慢な凍結方法に比べ生存性は著しく上昇した。な
お、一連の実験の中で、今回の様に、ガラス化保存液を
ストロー内で希釈した時の胚の生存率は、ストロー外で
希釈した時の胚の生存率と比べて遜色ない事が判明し
た。ストロー外で希釈する場合は、耐凍剤の毒性を避け
るために希釈の措置を素早く行う必要があり、希釈の操
作に手間取ると、胚の生存性が低下する恐れがある。そ
れに対し、今回考察したストロー内希釈の方法を用いれ
ば、その様なリスクは回避できるので、より安全な胚の
保存方法と言える。

【００４９】

【実施例２：ウシ胚盤胞への応用】胚を前処理溶液（Ｅ
ＦＳ２０）中で１〜５分間平衡化することにより前処理
し、この前処理した胚をストロー内のＥＦＳ４０カラム
に注入する前に、別に用意したＥＦＳ４０内でピペッテ
ィング処理し、その効果確認試験を行った。

【００５０】１．使用材料 １）保存容器：実施例１で記載した材料と同一とした。 ２）ガラス化保存液（ＥＦＳ４０）：実施例１で記載し
た材料と同一とした。 ３）前処理溶液（ＥＦＳ２０）：実施例１で記載した材
料と同一とした。 ４）希釈液：実施例１で記載した材料と同一とした。 ５）胚：Lu et al.（1987.Veterinary Record 121. 259
-260）の方法にて作出した、７〜８日令の黒毛和種また
はホルスタイン種の体外受精由来の胚盤胞および拡大胚
盤胞で、品質は形態的に正常なものを用いた。 ６）胚の処理温度：実施例１で設定した温度（２５℃）
と同一とした。 ７）胚の生存性の判定：ストロー内で希釈した胚を、５
分後にピペットでＰＢ１液に回収し、ついで２５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９（Ｅａｒｌｅ塩）に移し
て、７２時間炭酸ガス培養器内で培養した。胚の生存
は、培養後に元の状態に戻るか否かで判定した。なおそ
の際の共培養細胞として、顆粒膜細胞を用いた。

【００５１】２．試験方法 （Ａ）ストロー内への溶液および胚の導入方法 １）綿栓を塞ぐためにストロー内に吸引する希釈液の長
さは約２８ｍｍとし、ガラス化保存液と希釈液の間の空
気層の幅を約６ｍｍとした。 ３）および５）：ＥＦＳ２０での処理時間を２分、ＥＦ
Ｓ４０での処理時間を３０秒とした。 ４）ＥＦＳ２０で前処理した胚の、ストロー内のガラス
化溶液への導入方法を（ａ）法と（ｂ）法で比較する。 （ａ）法：ＥＦＳ２０で前処理した胚を、少量のＥＦＳ
２０と共にそのままストロー内のＥＦＳ４０のカラムの
中央に導入する。（ピペッティングなし＝従来の方法通
り） （ｂ）法：ＥＦＳ２０で前処理した胚を、別のデッシュ
に用意したＥＦＳ４０内に移し、数回ピペッティング処
理した後、少量のＥＦＳ４０と共にストロー内のＥＦＳ
４０のカラムのほぼ中央に導入する。（ピペッティング
あり）他については、実施例１と同一とした。

【００５２】（Ｂ）冷却・保存方法：実施例１と同一と
した。 （Ｃ）ガラス化保存した胚のストロー内での融解・希釈
方法：実施例１と同一とした。

【００５３】３．結果 得られた結果を下記表２に示す。

【００５４】

【表２】

【００５５】４．考察 マウス桑実胚においては、実施例１で示されていた様
に、前処理液で平衡した後、直接ストロー内のＥＦＳ４
０カラムに導入する方法で、高い生存性が得られた。し
かし、ウシ胚盤胞においては、融解後の生存性は、処理
したストロー毎にばらつきが大きく、また相対的に拡大
胚盤胞で低く、全般では生存率は５０％以下となってい
た。生存した胚は、従来のエチレングリコールを用いた
緩慢凍結法を用いた時に比べて活力が強く、透明帯の脱
出率が高いことから、一連の工程の中で、何か生存率を
下げている具体的な原因があると思われた。

【００５６】本実施例で、胚を前処理液からストロー内
のＥＦＳ４０カラムに移す前に、別に用意したＥＦＳ４
０内でピペッティング処理をする（ｂ）法は、ピペッテ
ィング処理をしない（ａ）法に比べ、生存率、脱出率と
もに急激に高くなり、有意な差（Ｐ＜０．０１）となっ
た。従って、ガラス化処理後の胚の生存率を下げていた
要因は、胚がＥＦＳ４０に導入された後に、前処理時か
ら存在する胚の周囲のＥＦＳ２０がＥＦＳ４０に換わっ
ていなかった為と判明した。

【００５７】ＥＦＳ２０はＥＦＳ４０よりも更に粘性が
高く、両者は容易には混合しない。ＥＦＳ２０内で平衡
した胚を、少量のＥＦＳ２０とともに、直接ストロー内
のＥＦＳ４０に導入した場合、胚が周囲のＥＦＳ２０か
ら抜けださないと、胚の周囲は、ＥＦＳ４０に換わらな
い。ＥＦＳ２０を着色して状況を観察すると、胚は周囲
のＥＦＳ２０と一体となってゆっくり沈降しているのみ
で、胚の周囲のＥＦＳ２０は、それほどＥＦＳ４０と混
合していない。ウシ胚はマウス胚よりも胚の直径が大き
く、胞胚腔も大きいために、胚の周囲がＥＦＳ４０に完
全に換わらないと、胚全体のガラス化が不完全になるも
のと考えられる。以前から融解後の胚の生存率は相対的
には初期の胚盤胞で高く、拡大胚盤胞で低い事は判明し
ていたが、このことも今回判明した原因と一致して説明
づけられる。

【００５８】今回の実験で、ウシ胚盤胞においても、胚
をＥＦＳ２０からストロー内のＥＦＳ４０に移す前に、
別に用意したＥＦＳ４０内でピペッティング処理を行
い、胚の周囲のＥＦＳ２０をＥＦＳ４０に換えれば、高
い生存率が得られる事が判明した。

【００５９】

【実施例３：移植試験】ピペッティング処理を取り入れ
た結果、従来のエチレングリコールを用いた緩慢凍結法
（Voelkel et al., 1992）で処理した胚（緩慢凍結胚）
よりも生存率が上昇したため、ガラス化保存をした体外
受精卵（ガラス化保存胚）での移植試験を開始した。ま
た、緩慢凍結で保存した体外受精胚および体内受精胚も
同時に移植しているので、結果を比較した。

【００６０】１．使用材料 胚は、体内受精胚、体外受精胚ともＤａｙ７の胚を使用
した。胚のステージは、体内受精胚は後期桑実胚または
初期胚盤胞、体外受精胚は、胚盤胞または拡大胚盤胞と
し、すべて形態的に正常なものを用いた。他は実施例２
の通りとした。

【００６１】２．試験方法 ○ガラス化保存および融解・希釈： （Ａ）ストロー内への溶液および胚の導入方法 ４）：実施例２の（ｂ）法と同一の方法でピペッティン
グ処理を行った。他は、すべて実施例３と同一とした。 ○緩慢凍結処理および融解：耐凍剤に１．５Ｍエチレン
グリコールを使用する、ウシ胚のダイレクト・トランス
ファー法（Voelkel et al., 1992, Theriogenology 37,
23-37）で記述されている一般的な緩慢凍結・融解法を
用いた。

【００６２】３．移植 （Ａ）受卵牛：茨城県内の『ひので酪農協』及び『美野
里酪農協』管内の一般酪農家の保有するホルスタイン種
を用いた。 （Ｂ）移植の時期：レシピエントの発情日を０日とし、
７日目に非外科的な方法で移植を実施した。 （Ｃ）移植の期間：９６年５月１６日〜９６年７月２６
日 （Ｄ）受胎の確認方法：発情日から４３日以内に、超音
波診断装置を用いて受胎確認を行なった。

【００６３】４．結果 得られた結果を下記表３に示す。

【００６４】

【表３】

【００６５】５．考察：ガラス化胚の受胎率は、体内受
精胚（緩慢凍結処理）には劣る（有意差はない）もの
の、同じ体外受精胚での緩慢凍結処理胚に対しては、有
意差はないが高い傾向を示した。しかし、実施例２の融
解試験で示された高い生存率を考慮すると、今回はそれ
程高い受胎率は得られなかった。またガラス化保存胚の
受胎率の内訳では、胚盤胞が高く、拡大胚盤胞で低い傾
向が見られた。

【００６６】

【実施例４】胚のＥＦＳ２０およびＥＦＳ４０での平衡
時間についての検討を行った。

【００６７】１．使用材料：実施例２と同一とした。 ２．試験方法 （Ａ）ストロー内への溶液および胚の導入方法 ３）および５）：胚のＥＦＳ２０およびＥＦＳ４０での
平衡時間を下記表４の組み合わせで試験した。他はすべ
て実施例２と同一とした。

【００６８】３．結果 得られた結果を下記表４に示す。

【００６９】

【表４】

【００７０】４．考察 ＥＦＳ２０での平衡時間は、１分以内では短すぎ、２分
で十分であることが示され、１．５分〜５．０分では大
差は見られなかった。ＥＦＳ４０での平衡時間は、２０
秒ではやや短すぎ、６０秒では若干長過ぎる傾向があ
り、３０秒〜４５秒では大差は見られなかった。一連の
実験の中では、ＥＦＳ２０で１．５分、ＥＦＳ４０で３
５秒の組み合わせで良い結果が出ている。作業能率から
考えると、ＥＦＳ２０の平衡時間については、一連の作
業（先を長く延ばしたピペットを用いて、胚をＥＦＳ２
０からＥＦＳ４０に移し、ピペッティング処理を行って
からストロー内のＥＦＳ４０に導入し、胚の確認後、氷
水に浸すまで）は、やや熟練を要し確実に行うには３０
秒程度必要であり、３０秒〜３５秒は作業上で好都合で
ある。

【００７１】

【実施例５】ガラス化保存胚と緩慢凍結胚の、生存率お
よび脱出率の比較を行った。

【００７２】これまでに改善を加えたガラス化処理法を
用いて保存した胚（ガラス化保存胚）と、現在ウシ胚の
保存方法として一般的に実用化されている方法である、
低濃度のエチレングリコール溶液を利用した緩慢凍結法
により保存された胚（緩慢凍結胚）とで、生存率、透明
帯脱出率の比較を行った。

【００７３】１．実験材料 胚は、Ｄａｙ７〜８のウシ体外受精胚（胚盤胞または拡
大胚盤胞）を使用した。他は実施例２と同一の材料を用
いた。

【００７４】２．実験方法 （ａ）胚のガラス化保存 （Ａ）ストロー内への溶液および胚の導入方法 ３）及び５）：胚のＥＦＳ２０およびＥＦＳ４０での平
衡時間は、ＥＦＳ２０で１．５分、ＥＦＳ４０で３５秒
とした。 ４）：実施例３（ｂ）法を用い、ピペッティング処理を
加えた。 他は実施例３と同一の方法とした。

【００７５】（ｂ）エチレングリコールによる胚の緩慢
凍結および融解法 実施例３と同様にＶｏｅｌｋｅｌ ｅｔ ａｌの方法を
用いた。

【００７６】３．結果 得られた結果を下記表５に示す。

【００７７】

【表５】

【００７８】４．考察 今回の実験でＤａｙ７〜８の合計では、生存率、透明帯
脱出率とも、ガラス化胚が緩慢凍結処理胚よりも有意
（Ｐ＜０．０５）に高く、特に透明帯脱出率については
かなりの差があり、ガラス化保存胚は緩慢凍結処理胚よ
りもダメージが少なく活力が高い事が確認された。

【００７９】

【実施例６：方法の改善（１）】融解・希釈方法の簡略
化を図るため、ａ）法を考案し、従来の方法であるｂ）
法と比較を行った。

【００８０】１．使用材料：実施例２と同一とした。 ２．試験方法 （Ａ）ストロー内への溶液および胚の導入方法：実施例
４と同一とした。３）及び５）：胚のＥＦＳ２０および
ＥＦＳ４０での平衡時間は、ＥＦＳ２０で１．５分、Ｅ
ＦＳ４０で３５秒とした。 ４）：実施例２（ｂ）法を用い、ピペッティング処理を
加えた。他は実施例４と同一の方法とした。 （Ｃ）ストロー内での融解・希釈方法：今回考案した
ａ）法と、従来のｂ）法と比較した。

【００８１】ａ）法：ストローを液体窒素から取りだ
し、空気中で１５秒間保持する。 プラグを下にして、２５℃の水にストローの下半分を
浸し、８秒間保持する。（図６（XVIII）） 素早くストローを逆向き（プラグを上）にして、スト
ロー全体を２５℃の水に浸し、ストローを倒さない様に
して、３〜５分間保持する。（図６（XIX）） ｂ）法：ストローを１５秒間室温の空気中で保持したの
ち氷水に３０秒間浸し、その後２５℃水中に浸す。 他はすべて実施例４と同一の方法とする。

【００８２】３．結果：得られた結果を下記表６に示
す。

【００８３】

【表６】

【００８４】４．考察：（ａ）法と（ｂ）法を比べる
と、気泡の発生量の差はほとんど見られず、融解後の胚
の生存率、脱出率においても、両者に差は見られなかっ
た。従来の（ｂ）法は、氷水の準備、ストローの氷水中
での３０秒間の待機、氷水中から２５℃水中への移し換
え作業などがやや繁雑となる。ストローを氷水中に浸す
手順を省略し、２５℃水中のみで融解する方法を試した
場合、気泡の発生する位置をストローの部位別で観察す
ると、シール部分に近い箇所からの発生が大部分であ
る。今回の（ａ）法のように、ストローのプラグ側から
中央までの半分のみを先に７〜８秒間２５℃水中に浸
し、その後ストロー全体を２５℃水中に浸すことで、気
泡の発生はほぼ抑えられた。これにより、庭先でのより
簡便な融解方法として（ａ）法が実用的なことが判明し
た。

【００８５】

【実施例７：方法の改善（２）】融解・気泡発生の原因
を解明し、希釈方法の簡略化を図るため、更に次の様に
方法の改善を行った。

【００８６】使用材料、試験方法は実施例６と同様とし
たが、（Ｃ）ストロー内での融解・希釈は、次のように
して行った。

【００８７】 ストローを液体窒素から取りだし、綿
栓部分を持ち、空気中で７秒間（５〜１０秒間）保持す
る。 綿栓を上にし、ストロー下端（シール部分）の空気
層の部分と、希釈液の端部を０〜５ｍｍ、本実施例では
２ｍｍ、水中（２５℃）に浸し、７秒間（５〜１０秒
間）保持する。（図７（XX）） プラグを上にしたまま、ストロー全体を２５℃の水
に浸し、１分間保持する（図７（XXI）） ストローを空気中に出し、綿栓部分を下にし、３０
秒間保持する（この間にストローの消毒、カット等を行
う。） （を行うことにより、希釈液の先端（空気との境界）
を液状とし、でシール部分の空気が希釈液の層に侵入
するのが防止される。）

【００８８】ガラス化ストローの急速融解時に気泡が発
生する原因は次のとおりである。 （ａ）ガラス化ストローを急激に温水に浸すと、凍結し
ている希釈液は、ストロー壁に接触する表面がランダム
に融解し始め、その際に融解した部分の体積が収縮する
（希釈液のほとんどはまだ凍結したままである）。図８
（XXII）） （ｂ）ストロー壁と、希釈液の融解した表面部分との間
にすき間（真空状態）がまだら（帯状）にできる。（図
８（XXIII）） （ｃ）の工程を省略すると、（ｂ）でできたすき間を
通って、ストロー先端側にある空気が侵入する。（図８
（XXIII）） （ｄ）希釈液が完全に融解し液体になると、すき間に入
って長く伸びていた空気が球状となり、気泡となる。
（図８（XXIV））

【００８９】の工程により、気泡発生が抑制される仕
組みは次のとおりである。（Ａ）で、希釈液のストロ
ー先端側（空気と接触する境界部分）の、端から数ミリ
を、先に２５℃の水に５〜１０秒間浸すことにより、凍
結した希釈液と空気の境界は液状となる（図９（XX
V）） （Ｂ）この結果、でストロー全体を２５℃の水に浸し
て融解する際、ストロー壁と、希釈液の融解した表面部
分との間に真空状態が発生しても、ストロー先端側にあ
る空気は、希釈液との境界にすき間がないため、侵入で
きない。（図９（XXVI）） （Ｃ）希釈液の融解が進み、体積が更に収縮しても、希
釈液と空気の境界が移動するのみで、気泡は発生しな
い。（図９（XXVII）） 以上により、の工程を採用することによって気泡の発
生が抑制される。

【００９０】本実施例によれば、より短時間に処理する
ことができ、融解途中でのストローの向きの変更の必要
もないため、より実用的である。胚が、温度が上昇した
ＥＦＳ４０内から脱出するまでの時間は、本実施例の方
法が最も短かいため、融解・希釈後の胚のダメージをよ
り小さくできる。

【００９１】

【発明の効果】今回の発明により、液体窒素中に保存し
た本ストローを、温水に数分間浸すだけで、ガラス化保
存した哺乳動物胚をストロー内で融解・希釈できるの
で、結果として、細胞の傷害が小さく、高い生存性を保
った胚を容易に得ることができる。保存が可能な胚のス
テージは、桑実期から拡大胚盤胞期まで広く含まれ、胚
の生存性は、従来の緩慢凍結法で胚を凍結・融解した場
合よりも明らかに高い。融解・希釈の操作においては、
以前のガラス化法の場合では必要だった顕微鏡等の機器
を必要とせず、一般に普及している緩慢凍結法における
融解法と比べても簡便性で大差はなく、実用性が高い。
従って、ウシなどの家畜に対し、庭先で胚移植を行う際
には本ストローが活用でき、高い受胎率が期待できる。
マウスなどの実験動物の胚の保存においても、本発明の
方式が最も高い生存率を期待できる確実な保存方法とな
り、貴重な動物の種や系統の保存にも活用できる。

【００９２】また、本発明のストローの作製方法は、以
前のガラス化法の場合よりも短い時間で、かつ胚を安定
して確実に処理できる方式を採用している。従来の緩慢
凍結法で必要であったプログラムフリーザー等の高価な
機器は不要であり、最少の設備で胚の保存ができる。緩
慢凍結の時間（約１時間）を省略することができるの
で、処理する胚（ストロー）の数が特に多くなければ、
胚の保存に必要な時間は、緩慢凍結法よりも短縮するこ
とができる。

【００９３】以上の様に、本発明は実用性が高く、現在
一般に普及している胚の保存方法よりも高い生存率や受
胎率を期待できる、画期的な胚の保存法である。酪農、
畜産業界において、ウシなどの家畜の胚移植における高
受胎率の確保は悲願であり、本発明が業界に貢献できる
可能性は高いと思われる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ガラス化保存用ストローの作製方法を示す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】同上続きを示す。

【図４】ガラス化保存用ストローの凍結、保存方法を示
す。

【図５】哺乳動物胚ガラス化保存用ストローのストロー
内希釈を示す。

【図６】哺乳動物胚ガラス化保存用ストローの融解・希
釈方法の別の実施例を示す。

【図７】哺乳動物胚ガラス化保存用ストローの融解・希
釈方法の更に別の実施例を示す。

【図８】ガラス化ストローの急速融解時に気泡が発生す
る原因を示す。

【図９】気泡発生の抑制方法を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 酒井 清高 東京都中央区京橋２丁目３番６号 明治乳 業株式会社内 (72)発明者 久保田 誠寛 東京都中央区京橋２丁目３番６号 明治乳 業株式会社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストロー内において、内部に哺乳動物胚
   を有するガラス化保存液層と希釈液層とを隣接して設け
   るとともにその両端部に空気層を配してなること、を特
   徴とする哺乳動物胚ガラス化保存用ストロー。
2. 【請求項２】 更に、液体で浸した綿栓側から短い空気
   層を隔てた箇所にガラス化保存液層を設けること、を特
   徴とする請求項１に記載のストロー。
3. 【請求項３】 ガラス化保存液が、細胞透過性耐凍剤、
   細胞非透過性易ガラス化物質、及び、細胞非透過性脱水
   促進物質を含有するものであること、を特徴とする請求
   項１又は２に記載のストロー。
4. 【請求項４】 細胞透過性耐凍剤がエチレングリコー
   ル、プロピレングリコール、グリセロール、プロパンジ
   オール、１，３−ブタンジオール、及び／又は、ジメチ
   ルスルホキシドであり；細胞非透過性易ガラス化物質が
   フィコール、パーコール、ウシ血清アルブミン、ポリビ
   ニールピロリドン、及び／又は、ポリエチレングリコー
   ルであり；細胞非透過性脱水促進物質がシュークロー
   ス、ガラクトース、トレハロース、及び／又は、グルコ
   ースであること、を特徴とする請求項３に記載のストロ
   ー。
5. 【請求項５】 ガラス化保存液が、エチレングリコー
   ル、フィコール、シュークロースを含有するＥＦＳ液で
   あること、を特徴とする請求項３又は４に記載のストロ
   ー。
6. 【請求項６】 ストロー内に希釈液を吸引して移動さ
   せ、綿栓部を塞ぎ；該希釈液から空気層を隔てた個所に
   ガラス化保存液を注入してガラス化保存液のカラムを作
   成し；前処理した哺乳動物胚を、少量の前処理液ととも
   に、ストロー内のガラス化保存液のカラムの中に注入
   し；ストローを綿栓部を下にして縦方向に正立させ、氷
   水中に浸し；ガラス化保存液のカラム上に希釈液を直接
   重層し；空気層を介してストローの先端をシールする；
   ことを特徴とする哺乳動物胚ガラス化保存用ストローの
   作成方法。
7. 【請求項７】 更に、ストローを、液体窒素ガスにて冷
   却し、液体窒素にて保存することを特徴とする請求項６
   に記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜５に記載のストローを液体窒
   素から取り出し、綿栓部を上にして縦方向に正立させて
   その一部を温水中に保持してシール側の希釈液の下方端
   部を融解した後、ストロー全体を温水中に保持するこ
   と、を特徴とする哺乳動物におけるガラス化保存胚のス
   トロー内希釈法。