JP2011036196A - 生物材料用ガラス化液、ガラス化キット、及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物材料用ガラス化液は、耐凍剤を含み、かつ浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内であることを特徴とする。耐凍剤として、エチレングリコール、グリセロール、及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含み、更に糖類として、シュークロース、トレハロース、ラフィノース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、デキストラン、及びグルコースからなる群より選択される物質を含むことを特徴とする生物材料用ガラス化液。
【選択図】なし
Description
本発明にかかる「生物材料用ガラス化液」とは、「耐凍剤」を含み、かつ浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内であるガラス化液であって、特に「生物材料」をガラス化するために用いるものを指す。また、「浸透圧(単位:mol/kg water)」のより好ましい範囲は、32.1以上で38.4以下の範囲内であり、さらに好ましくは33.6以上で38.4以下の範囲内であり、特に好ましくは約33.6である。とりわけ、浸透圧の範囲が上記33.6以上で38.4以下の範囲内にあれば、例えばドライアイス温度下でのガラス化保存後に正常胚が得られる確率(後述の実施例で示す正常%に相当)が95%以上と著しく高まる。
本発明の「生物材料用ガラス化液」を用いたガラス化の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、動物由来の材料が好ましく、哺乳動物由来の材料がより好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、スナネズミ、マストミス、ハタネズミ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物;イヌ、ネコ等の愛玩動物(ペット);ウシ、ウマ、ブタ等の家畜;ヒト;が挙げられる。動物由来の材料として、具体的には例えば、動物の胚(例えば1細胞期(人工授精したものも含む受精卵)、2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑実期)、動物の卵巣組織、動物の未受精卵子、又は動物の細胞等が挙げられ、これらは所定の遺伝子操作を受けていてもよい。動物の細胞は体細胞でも生殖細胞でもよく、具体的には例えば、iPS細胞(Induced Pluripotent Stem Cell)、ES細胞(Embryonic Stem Cell)、等が挙げられる。
本発明にかかる「生物材料用ガラス化液」の特に好適な組成の例示は以下の通りである。これらのガラス化液は、特に、マウス等の哺乳動物の胚をガラス化保存する目的で、極めて好適である。なお、後述する実施例で用いた生物材料用ガラス化液も、以下のガラス化液(1)〜(5)の何れかの条件を満たすものである。
・生物材料用ガラス化液(1):
エチレングリコール(耐凍剤)を30体積%以上で50体積%以下の範囲内、
シュークロース(浸透圧調整剤/糖類)を0.75M以上で1.2M以下の範囲内、
フィコールPM70(登録商標:助剤)を15%以上で20%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100=W/V%)の範囲内で含む、浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内のリン酸緩衝溶液。
・生物材料用ガラス化液(2):
エチレングリコール(耐凍剤)を40体積%以上で50体積%以下の範囲内、
シュークロース(浸透圧調整剤/糖類)を0.75M以上で1.1M以下の範囲内、
フィコールPM70(登録商標:助剤)を15%以上で18%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100=W/V%)の範囲内で含む、浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内のリン酸緩衝溶液。
・生物材料用ガラス化液(3):
エチレングリコール(耐凍剤)を40体積%以上で46体積%以下の範囲内、
シュークロース(浸透圧調整剤/糖類)を1M以上で1.2M以下の範囲内、
フィコールPM70(登録商標:助剤)を15%以上で18%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100=W/V%)の範囲内で含む、浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内のリン酸緩衝溶液。
・生物材料用ガラス化液(4):
エチレングリコール(耐凍剤)を42体積%以上で46体積%以下の範囲内、
シュークロース(浸透圧調整剤/糖類)を0.8M以上で1.1M以下の範囲内、
フィコールPM70(登録商標:助剤)を16%以上で18%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100=W/V%)の範囲内で含む、リン酸緩衝溶液。
・生物材料用ガラス化液(5):
エチレングリコール(耐凍剤)を42体積%以上で45体積%以下の範囲内、
シュークロース(浸透圧調整剤/糖類)を0.8M以上で1.1M以下の範囲内、
フィコールPM70(登録商標:助剤)を16%以上で18%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100=W/V%)の範囲内で含む、リン酸緩衝溶液。
なお、上記例示の生物材料用ガラス化液(4)及び(5)の浸透圧(単位:mol/kg water)はいずれも、好ましくは30.7以上で38.4以下の範囲内であり、より好ましくは33.6以上で38.4以下の範囲内である。
本発明にかかる「生物材料用ガラス化液」の調製方法は、「耐凍剤」、並びに、必要に応じて用いる上記「浸透圧調整剤」及び上記「助剤」等を、液体(例えば、水、又はリン酸緩衝液(例えば、リン酸緩衝水溶液)等)中に溶解、又は混合することで調製される。液体中に溶解、又は混合する手順は特に限定されないが、例えば、「浸透圧調整剤」及び「助剤」などを液体中に溶解した溶液を調製し、次いで当該溶液を用いて「耐凍剤」を所望する倍率に希釈すればよい。「生物材料用ガラス化液」の浸透圧は、「耐凍剤」の希釈倍率、及び「浸透圧調整剤」の濃度の少なくとも一方を制御することにより所望の通り調整できる。
本発明にかかる「生物材料用ガラス化液」は、特にドライアイスを用いた冷却下(約−80℃下)で生物材料を所定の期間保存することに適する。以下、ドライアイスを用いた保存についてより具体的に説明を行うが、本発明の生物材料用ガラス化液の用途は、ドライアイスを用いた保存のみに限定されるものではない。
本発明にかかる「生物材料用ガラス化キット」は、上記の「生物材料用ガラス化液」を備える。また、該ガラス化液より低濃度の耐凍剤を含む上記の「前処理液」を、さらに備えることがより好ましい。「生物材料用ガラス化キット」は、「前処理液」を含む場合、「生物材料用ガラス化液」と互いに混合しない形態である必要があり、例えば、「生物材料用ガラス化液」と「前処理液」とが、別々の容器に格納された上で組み合わされた構成である。
実施例、参考例、及び比較例に共通な実験手法を以下に示す。
1)ガラス化保存液、及び前処理液の調製:
1.5M(モル濃度)のシュークロース(浸透圧調整剤/糖類)と30%(W/V%)のフィコールPM70(助剤)とをPB1培地(Whittingham, DG. : Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature 233:125-126, 1971.)に溶解させて調製したFS−PB1培地(1)で、エチレングリコール(純度99.5+%。和光純薬工業株式会社より購入(耐凍剤))を所望の倍率にて希釈することにより、ガラス化保存液35c・40c・45c・50cを調製した。
・ガラス化保存液40c(EFS40c) エチレングリコール:FS−PB1培地(1)=40:60(体積比)
・ガラス化保存液45c(EFS45c) エチレングリコール:FS−PB1培地(1)=45:55(体積比)
・ガラス化保存液50c(EFS50c) エチレングリコール:FS−PB1培地(1)=50:50(体積比)
1M(モル濃度)のシュークロースと30%(W/V%)のフィコールPM70とを含むFS−PB1培地(2)を調製し、当該FS−PB1培地(2)でエチレングリコールを所望の倍率にて希釈することにより、ガラス化保存液40bを調製した。
・ガラス化保存液40b(EFS40b) エチレングリコール:FS−PB1培地(2)=40:60(体積比)
0.5M(モル濃度)のシュークロースと30%(W/V%)のフィコールPM70とを含むFS−PB1培地(3)を調製し、当該FS−PB1培地(3)でエチレングリコールを所望の倍率にて希釈することにより、ガラス化保存液40a及び前処理液(平衡液)20aを調製した。
・ガラス化保存液40a(EFS40a) エチレングリコール:FS−PB1培地(3)=40:60(体積比)
・前処理液20a(EFS20a) エチレングリコール:FS−PB1培地(3)=20:80(体積比)
ここで調製された各液の浸透圧は、後述の表2に示す。上記の中では、ガラス化保存液45cのみが浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内にある、本発明にかかる「生物材料用ガラス化液」である。なお、ガラス化保存液45cにおけるシュークロースの最終濃度は0.825M、フィコールPM70の最終濃度は16.5%(W/V%)である。
ガラス化保存液、及び前処理液の浸透圧は、全て、対象となる溶液(すなわち、生物材料用ガラス化液、又は前処理液)中の含有水分量と、当該溶液中に含まれる各試薬の量(モル数)とから、各試薬の重量モル濃度(mol/kg water)を算出し、これら重量モル濃度の総和をもとめて浸透圧としている。
C57BL/6JJcl系統の、12週齢以上のオスマウス(日本クレア株式会社より入手)の精巣上体尾部より精子を採取し、定法に従い前培養した。また、同系統の8〜12週齢のメスマウス(日本クレア株式会社より入手)の卵管より未受精卵子を採取した。次いで、採取した卵子と精子とを用いて体外授精を行い、受精した胚はそのまま培養用ディッシュ内で2細胞期胚まで培養して生物材料とした。
マウスの2細胞期胚(生物材料)を、前処理液に、室温下で3分間浸漬した。次いで、2細胞期胚を、直ちに、50μlのガラス化液を格納したクライオチューブ(以下「チューブ」と称する)(内容積1ml)に移してフタを閉め、室温下で1分間浸漬した。その後、チューブごと液体窒素下で急冷して2細胞期胚のガラス化を行なった(ガラス化工程)。次いで、ドライアイスペレットが充填された発泡スチロール箱中に当該チューブを完全に埋め込んで、フタをビニールテープにて密閉した(保存工程)。さらに、後述する実施例2の一部実験では当該発泡スチロール箱をトラックに積載して輸送した。輸送は、理化学研究所筑波研究所(日本国茨城県つくば市)から放射線医学総合研究所(日本国千葉県千葉市)間で行った。
ドライアイス温度下での保存を開始してから48時間後に、液体窒素入りの保管用タンクにチューブを移して保管した。そして、翌日以降に、チューブを室温に30秒間静置した後、チューブの中へ37℃に温めておいた融解液Aを加えて融解を行い、ピペッティング操作によって速やかに胚(生物材料)を加温して回収した。次いで、融解液Bへ胚を移しさらに3分後に当該胚を培養液に移した。なお、ここで使用した融解液Aは、シュークロースを1M(モル濃度)で含むPB1培地であり、融解液Bは、シュークロースを0.25M(モル濃度)で含むより低浸透圧のPB1培地である。
また、回収した2細胞期胚に形態的な異常が認められるか否かを光学顕微鏡にて観察し、形態的な異常が認められない胚を正常胚とした。
後述する実施例1、比較例1、及び参考例1では、回収した正常胚を培養液中で培養して4細胞期以降へ分割するか否かを確認した。後述する実施例3及び実施例4ではさらに桑実期及び胚盤胞期以降ヘ発育するか否かを確認した。ここで、培養液としては、CZB培地に、5.6mM濃度のグルコースを添加したものを用いた。
一方、後述する実施例2では、回収した正常胚をCZB培地に移した後、この胚を、精管結紮した雄との交配を膣栓の存在によって確認した排卵1日目の仮親(Jcl:ICR系統の9〜12週齢のメスマウス)の卵管内に移植した。その後19日目の分娩日当日に、帝王切開を行い、移植胚に由来する着床痕数、及び胎仔の蘇生の可否、雌雄、更に体重を計測すると共に形態的な異常の有無の確認を行なった。
本実施例ではガラス化保存液45cと、前処理液20aとを用いて、ガラス化工程を行なった。また、用いたチューブ数は6本であり、各チューブにはマウスの2細胞期胚を10個ずつ(すなわち合計で60個)格納した。ドライアイス温度下での保存後に回収した胚数(回収胚数)、正常胚数、培養胚数、及び4細胞期以降への分割を確認した胚数(分割数)を表2に示す。
本比較例では表2に示すガラス化保存液と、前処理液液20aとを用いて、ガラス化工程を行なった。また、用いたチューブ数は6本であり、各チューブにはマウスの2細胞期胚を10個ずつ(すなわち合計で60個)格納した。ドライアイス温度下での保存後に回収した胚数(回収胚数)、正常胚数、培養胚数、及び4細胞期以降への分割を確認した胚数(分割数)を表2に示す。
本参考例では、実施例1及び比較例1にて用いたガラス化保存液EFS35c、EFS40c、EFS45c、及びEFS50cを、液体窒素下でのガラス化保存に適用した。具体的には、実施例に記載の方法に従いガラス化工程を行い、そのまま液体窒素下で、48時間のガラス化保存を行った。しかる後に、実施例1及び比較例1の方法に従い、生物材料の融解、回収、及び分割可能な正常胚の観測を行った。なお、表3中の各用語の定義は、表2中の同一用語の定義と同じである。
本実施例では、ドライアイス温度下での保存工程において、トラックによる輸送を行った場合の影響を評価した。
本実施例では、エチレングリコール(耐凍剤)を40体積%で含み、シュークロース(糖類)を1.05M(モル濃度)で含み、かつフィコールPM70(助剤)を18%(W/V%)で含むPB1培地であるガラス化保存液40c-d(EFS40c-d)を調製した。EFS40c-dの浸透圧は32.1(mol/kg water)であり、本発明のガラス化液の条件を満たしていた。
本実施例では、エチレングリコール(耐凍剤)を42.5体積%で含み、シュークロース(糖類)を1.01M(モル濃度)で含み、かつフィコールPM70(助剤)を17.3%(W/V%)で含むPB1培地であるガラス化保存液42.5c-d(EFS42.5c-d)を調製した。EFS42.5c-dの浸透圧は35.1(mol/kg water)であり、本発明のガラス化液の条件を満たしていた。
本実施例では、エチレングリコール(耐凍剤)を45体積%で含み、シュークロース(糖類)を0.963M(モル濃度)で含み、かつフィコールPM70(助剤)を16.5%(W/V%)で含むPB1培地であるガラス化保存液45c-d(EFS45c-d)を調製した。EFS45c-dの浸透圧は38.4(mol/kg water)であり、本発明のガラス化液の条件を満たしていた。
EFS20a: 4.7 Osmol/kg
EFS35c: 8.5 Osmol/kg
EFS40a: 8.7 Osmol/kg
EFS40b: 9.1 Osmol/kg
EFS40c: 9.5 Osmol/kg
EFS40c−d: 9.7 Osmol/kg
EFS42.5c−d: 10.2 Osmol/kg
EFS45c: 10.5 Osmol/kg
EFS45c−d: 10.7 Osmol/kg
EFS50c: 11.5 Osmol/kg
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
Claims (13)
- 耐凍剤を含み、かつ浸透圧(単位:mol/kg water)が28.0を越え40.3未満の範囲内であることを特徴とする生物材料用ガラス化液。
- 上記浸透圧が32.1以上で38.4以下の範囲内であることを特徴とする、請求項1に記載の生物材料用ガラス化液。
- 上記耐凍剤として、エチレングリコール、グリセロール、及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の生物材料用ガラス化液。
- 糖類を含むことで、浸透圧が上記の範囲内に調整されていることを特徴とする請求項1から3の何れか一項に記載の生物材料用ガラス化液。
- 上記糖類として、シュークロース、トレハロース、ラフィノース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、デキストラン、及びグルコースからなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項4に記載の生物材料用ガラス化液。
- 上記耐凍剤による生物材料のガラス化を促進させる作用を持つ助剤を含むことを特徴とする請求項1から5の何れか一項に記載の生物材料用ガラス化液。
- 上記耐凍剤の濃度が、30体積%以上で50体積%以下の範囲内であることを特徴とする請求項1から6の何れか一項に記載の生物材料用ガラス化液。
- 上記耐凍剤としてのエチレングリコールを30体積%以上で50体積%以下の範囲内で含み、
上記糖類としてのシュークロースを0.75M以上で1.2M(モル濃度)以下の範囲内で含み、
上記助剤としてのフィコールPM70(登録商標)を15%以上で20%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100%)の範囲内で含む、ことを特徴とする請求項6に記載の生物材料用ガラス化液。 - エチレングリコールを42体積%以上で46体積%以下の範囲内で含み、
シュークロースを0.8M以上で1.1M(モル濃度)以下の範囲内で含み、
フィコールPM70(登録商標)を16%以上で18%以下(単位:助剤の質量(グラム)/生物材料用ガラス化液の体積(ミリリットル)×100%)の範囲内で含む、ことを特徴とする生物材料用ガラス化液。 - 上記生物材料が、動物由来の材料であることを特徴とする請求項1から9の何れか一項に記載の生物材料用ガラス化液。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の生物材料用ガラス化液を備えることを特徴とする、生物材料用ガラス化キット。
- 上記生物材料用ガラス化液より低濃度にて耐凍剤を含む前処理液を、さらに備える請求項11に記載の生物材料用ガラス化キット。
- 請求項1から10の何れか一項に記載の生物材料用ガラス化液と、生物材料とを、保存用チューブ内に格納して冷却をし、当該生物材料をガラス化するガラス化工程と、
ガラス化された上記生物材料を格納した上記保存用チューブを、ドライアイスにより所定の期間冷却保存する保存工程と、を含むことを特徴とする、生物材料の保存方法。
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