WO2017141991A1 - 動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤 - Google Patents

動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤 Download PDF

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WO2017141991A1
WO2017141991A1 PCT/JP2017/005592 JP2017005592W WO2017141991A1 WO 2017141991 A1 WO2017141991 A1 WO 2017141991A1 JP 2017005592 W JP2017005592 W JP 2017005592W WO 2017141991 A1 WO2017141991 A1 WO 2017141991A1
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animal cell
pll
cell cryopreservation
vitrification
solution
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PCT/JP2017/005592
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French (fr)
Inventor
和明 松村
俊明 中
Original Assignee
国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
澁谷工業株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a vitrification state stabilizer for an animal cell cryopreservation solution and an animal cell cryopreservation solution containing the vitrification state stabilizer.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMSO and glycerin have a sufficient track record for use in cryopreservation of dispersed cells.
  • DMSO and glycerin often cause damage after thawing and leave damage when used in cryopreservation for cell sheets, three-dimensional cell structures, tissues, and the like. Considering that this damage may be caused by ice crystal formation or dehydration shrinkage during freezing, an attempt has been made to vitrify by controlling the crystallization of ice and solidifying it in an amorphous state.
  • the vitrification method has been developed as a method for freezing fertilized eggs, and the conventional vitrification method is generally intended to vitrify an aqueous solution with a rapid freezing rate and a high solute concentration.
  • DAP213 is known as a vitrification solution for fertilized eggs of mice.
  • DAP213 is a solution of DMSO 2M, acetamide 1M, propylene glycol 3M, and has a high concentration and high toxicity.
  • a typical method of use is a method in which water contained in a fertilized egg of a mouse is replaced with this solution and directly immersed in liquid nitrogen to obtain a vitrified state.
  • vitrification with such a vitrification solution is considered to be highly cytotoxic and to be highly damaged by recrystallization upon thawing.
  • Patent Document 1 discloses cryoprotective substances and attempted to improve the vitrification method.
  • Patent Document 2 discloses the production of a sucrose multimeric polymer.
  • the cryopreservation solution containing carboxylated polylysine disclosed in Patent Document 1 is a cryopreservation solution excellent in vitrification ability, but a novel cryopreservation solution having further excellent vitrification ability is demanded.
  • an object of the present invention is to provide a novel animal cell cryopreservation solution having excellent vitrification ability.
  • the present invention includes the following (1) and below.
  • D Vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution comprising epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimeric polymer:
  • A an amphoteric polymer compound carboxylated by reacting ⁇ -poly-L-lysine with butyl succinic anhydride;
  • B an amphoteric polymer compound obtained by reacting ⁇ -poly-L-lysine with butyl succinic anhydride and succinic anhydride; or
  • ⁇ -poly-L-lysine is represented by the following formula I: (However, in the above formula, R1 and R2 are each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or a C1-C6 alkane-diyl group formed by
  • a compound of formula I has the following formula II: (However, in the above formula, R1 and R2 are each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or a C1-C6 alkane-diyl group formed by integrating R1 and R2).
  • the vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation liquids as described in (1) which is a compound represented by these.
  • the proportion of the carboxylated amino group in the side chain amino group of ⁇ -poly-L-lysine is in the range of 50% to 75%.
  • the vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation liquid of description (1) or (2) The vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation liquid of description.
  • the animal cell cryopreservation solution according to (7) further comprising sucrose at a concentration of 0.1 to 1M.
  • (9) Containing 2 to 40% by weight of an amphoteric polymer selected from the group consisting of (a), (b) and (c),
  • the animal cell cryopreservation solution according to any one of (6) to (8) comprising an epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimer polymer at 1 to 30% by weight.
  • the process of thawing animal cells by heating them The animal cell cryopreservation method according to any one of (12) to (13), which is a step of thawing an animal cell without heating and recrystallization.
  • the process of lowering the temperature and freezing The method for cryopreserving animal cells according to any one of (11) to (14), wherein the method is a step of freezing at a temperature lowering rate of 5 ° C / min to 50 ° C / min.
  • (16) The process of heating and thawing The animal cell cryopreservation method according to any one of (12) to (15), wherein the method is a step of thawing by raising the temperature at a temperature elevation rate of 5 ° C / min to 100 ° C / min.
  • an animal cell cryopreservation solution having excellent vitrification ability can be obtained.
  • this animal cell cryopreservation solution crystallization is suppressed even at a lower temperature-lowering rate than before, and cryopreservation can be performed while maintaining a vitrified state.
  • recrystallization is suppressed, and the glass can be thawed while being stably maintained. Therefore, according to the animal cell cryopreservation solution of the present invention, animal cells can be frozen and thawed with a high survival rate.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of DSC measurement of a conventional vitrification solution at a heating rate of 50 ° C./min.
  • FIG. 2a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL.
  • FIG. 2b is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using BSA-PLL.
  • FIG. 2c is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of the vitrification solution using BSA (35) -SA (30) -PLL.
  • FIG. 3a is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL and EG5M.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of DSC measurement of a conventional vitrification solution at a heating rate of 50 ° C./min.
  • FIG. 2a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-
  • FIG. 3b is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using BSA-PLL and EG4.5M.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution with BSA (35) -SA (30) -PLL, EG5.5M.
  • FIG. 5a is a graph showing the results of recrystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL.
  • FIG. 5b is a graph showing the result of recrystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL.
  • FIG. 5c is a graph showing the results of recrystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using BSA (35) -SA (30) -PLL.
  • FIG. 6a is a graph showing the cell viability by each vitrification solution.
  • FIG. 6b is a graph showing the cell viability by each vitrification solution.
  • FIG. 7a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using DMGA-PLL and EG6M.
  • FIG. 7b is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG5M.
  • FIG. 7c is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG4.5M.
  • FIG. 7d is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using DMGA-PLL and EG4M.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using EG 6.5M.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL and EG 6.5M.
  • FIG. 10a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL and EG 5.5M.
  • FIG. 10b is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL and EG5M.
  • FIG. 11 a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL and EG5M.
  • FIG. 11b is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL and EG4.5M.
  • FIG. 12a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using DMGA-PLL and EG4.5M.
  • FIG. 12b is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG4M.
  • FIG. 13a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL and EG6M.
  • FIG. 13b is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL and EG6M.
  • FIG. 13c is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG6M.
  • FIG. 14a is a fluorescence micrograph of a double-stained cell sheet frozen and thawed with a vitrification solution of EG6M.
  • FIG. 14 b is a fluorescence micrograph of a double-stained cell sheet frozen and thawed with a vitrification solution of COOH-PLL and EG6M.
  • FIG. 14c is a fluorescence micrograph of a double-stained cell sheet frozen and thawed with a vitrification solution of BSA-PLL and EG6M.
  • FIG. 14a is a fluorescence micrograph of a double-stained cell sheet frozen and thawed with a vitrification solution of BSA-PLL and EG6M.
  • FIG. 14d is a fluorescence micrograph of a double-stained cell sheet frozen and thawed with a vitrification solution of DMGA-PLL and EG6M.
  • FIG. 15 is a graph showing cell viability after freeze-thawing in each vitrification solution.
  • FIG. 16 is a graph showing the recrystallization behavior of various vitrification solutions.
  • FIG. 17 is a graph showing the recrystallization behavior of DMGA-PLL vitrification solution (DMGA-PLL 25 mM, Su 0.5 M, EG 6.0 M, Ficoll 10%).
  • FIG. 18 shows an appearance after a vitrification solution obtained by adding 25 mM of DMGA-PLL or COOH-PLL (SA-PLL) to EG6M, sucrose 0.5M, Ficoll 10% solution is left at ⁇ 80 ° C. for 3 hours. It is a photograph which shows.
  • FIG. 19 is a photograph showing the appearance after leaving a vitrification solution obtained by adding each polysaccharide to a solution of EG6M, sucrose 0.5M, and DMGA 25 mM at ⁇ 80 ° C. for 3 hours.
  • FIG. 20a is a fluorescence micrograph of a double-stained MSC sheet left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 hour using a vitrification solution (EG6M, Su0.5M).
  • FIG. 20b is a fluorescence micrograph of a double-stained MSC sheet left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 hour using a vitrification solution (COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M).
  • FIG. 20c is a fluorescence micrograph of the MSC sheet left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 hour using a vitrification solution (DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M) and then double-stained.
  • FIG. 20d shows a fluorescence microscope in which an MSC sheet was left in a freezer at ⁇ 80 ° C.
  • FIG. 21a is a fluorescence micrograph of a double-stained MSC sheet left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 day using a vitrification solution (EG6M, Su0.5M).
  • FIG. 21b is a fluorescence micrograph of the MSC sheet left to stand in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 day using a vitrification solution (COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M) and then double-stained.
  • FIG. 21a is a fluorescence micrograph of a double-stained MSC sheet left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 day using a vitrification solution (COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M) and then double-stained.
  • COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M
  • FIG. 21c is a fluorescence micrograph of the MSC sheet left to stand in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 day using a vitrification solution (DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M) and then double-stained.
  • FIG. 21d shows a fluorescence microscope in which an MSC sheet was left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 day using a vitrification solution (DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M, Ficoll 10%) and then double-stained. It is a photograph.
  • the vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution of the present invention is an amphoteric having an amino group and a carboxyl group selected from the group consisting of the following (a), (b) and (c) in the same molecule.
  • a vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution comprising a polymer compound and (d) an epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimer polymer: (A) an amphoteric polymer compound carboxylated by reacting ⁇ -poly-L-lysine with butyl succinic anhydride; (B) an amphoteric polymer compound obtained by reacting ⁇ -poly-L-lysine with butyl succinic anhydride and succinic anhydride; or (c) ⁇ -poly-L-lysine is represented by the following formula I: (However, in the above formula, R1 and R2 are each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or a C1-C6 alkane-diyl group formed by integrating R1 and R2; R3 and R4 are each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or a C1-C6 alkane-diyl
  • [ ⁇ -poly-L-lysine] As ⁇ -poly-L-lysine, known ⁇ -poly-L-lysine can be used.
  • the ⁇ -poly-L-lysine has a molecular weight of, for example, 100 to 100,000, and in a preferred embodiment, the ⁇ having a number average molecular weight of, for example, 1000 to 20,000, 1000 to 10,000 produced by a microorganism or an enzyme.
  • -Poly-L-lysine can be used.
  • ⁇ -Poly-L-lysine is produced exclusively by actinomycetes belonging to the genus Streptomyces and is used exclusively as a food additive.
  • the number average molecular weight or the number average degree of polymerization is measured by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) using, for example, an electrophoresis apparatus manufactured by Ato Co., Ltd. and a densitograph (AE-6920V type). And can be easily measured. It can also be used as a molecular weight of 30,000 or more by increasing the molecular weight by heat treatment. Polylysine having a free carboxyl group only at the terminal end has a primary amino group in the side chain, and this amino group is carboxylated by the reaction described below.
  • the ratio of carboxylated amino groups in the side chain amino groups of ⁇ -poly-L-lysine is, for example, 50% to 75%, The range can be 60% to 70%.
  • BSA-PLL Butyl succinic anhydride (BSA) reacts with the amino group of the side chain of ⁇ -poly-L-lysine (PLL) as shown in the chemical reaction formulas described in the examples to form a carboxylated amphoteric polymer (BSA).
  • -PLL which is an amphoteric polymer compound having an amino group and a carboxyl group in the same molecule, and is a vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solutions of the present invention.
  • BSA-SA-PLL The side chain amino group of ⁇ -poly-L-lysine (PLL) reacts with butyl succinic anhydride (BSA) and succinic anhydride (SA) to give a carboxylated amphoteric polymer (BSA-SA-PLL).
  • BSA butyl succinic anhydride
  • SA succinic anhydride
  • butyl succinic anhydride and succinic anhydride may be reacted at the same time, may be reacted before or after, and either may be reacted before or after.
  • the ratio B / A of the number B of amino groups carboxylated by reaction with butyl succinic anhydride is, for example, in the range 2/30 to 40/30, in the range 10/30 to 40/30, 30/40 to It can be in the range of 40/30.
  • GA-PLL The GA derivative (glutaric anhydride derivative) represented by the following formula I reacts with the amino group of the side chain of ⁇ -poly-L-lysine to produce a carboxylated amphoteric polymer compound (GA-PLL).
  • This is an amphoteric polymer compound having an amino group and a carboxyl group in the same molecule, and is a vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution of the present invention.
  • R1 and R2 can be each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or R1 and R2 can be combined to form a C1-C6 alkane-diyl group.
  • the C1-C4 alkyl group may be, for example, a C1-C3, C1-C2 alkyl group.
  • Examples of the alkane-diyl group include a C1-C3 alkane-1,1-diyl group and a C4-C6 alkylene group.
  • R1 and R2 examples include a hydrogen atom and a hydrogen atom, a hydrogen atom and a methyl group, a hydrogen atom and an ethyl group, a methyl group and a methyl group, a methyl group and an ethyl group, and an ethyl group and an ethyl group.
  • Examples of the C1-C3 alkane-1,1-diyl group include a methane-1,1-diyl group and an ethane-1,1-diyl group.
  • Examples of the C4 to C6 alkylene group include a tetramethylene group (butane-1,4-diyl group) and a pentamethylene group (pentane-1,5-diyl group).
  • R3 and R4 can be each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or R3 and R4 together form a C1-C6 alkane-diyl group. be able to.
  • the C1-C4 alkyl group may be, for example, a C1-C3, C1-C2 alkyl group.
  • Examples of the alkane-diyl group include a C1-C3 alkane-1,1-diyl group and a C4-C6 alkylene group.
  • Examples of the combination of R3 and R4 include a hydrogen atom and a hydrogen atom, a hydrogen atom and a methyl group, a hydrogen atom and an ethyl group, a methyl group and a methyl group, a methyl group and an ethyl group, and an ethyl group and an ethyl group.
  • Examples of the C1-C3 alkane-1,1-diyl group include a methane-1,1-diyl group and an ethane-1,1-diyl group.
  • Examples of the C4 to C6 alkylene group include a tetramethylene group (butane-1,4-diyl group) and a pentamethylene group (pentane-1,5-diyl group).
  • R5 and R6 can be each independently a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group, or R5 and R6 together form a C1-C6 alkane-diyl group. be able to.
  • the C1-C4 alkyl group may be, for example, a C1-C3, C1-C2 alkyl group.
  • Examples of the alkane-diyl group include a C1-C3 alkane-1,1-diyl group and a C4-C6 alkylene group.
  • R5 and R6 examples include a hydrogen atom and a hydrogen atom, a hydrogen atom and a methyl group, a hydrogen atom and an ethyl group, a methyl group and a methyl group, a methyl group and an ethyl group, and an ethyl group and an ethyl group.
  • Examples of the C1-C3 alkane-1,1-diyl group include a methane-1,1-diyl group and an ethane-1,1-diyl group.
  • Examples of the C4 to C6 alkylene group include a tetramethylene group (butane-1,4-diyl group) and a pentamethylene group (pentane-1,5-diyl group).
  • R1 and R2 can be the above groups, and R3, R4, R5, and R6 can be hydrogen atoms. That is, it can be a GA derivative represented by the following formula II.
  • R3 and R4 can be the above groups, and R1, R2, R5 and R6 can be hydrogen atoms. That is, it can be a GA derivative represented by the following formula. Needless to say, this GA derivative is equivalent to a GA derivative in which, in the above formula, R5 and R6 are the above-described groups, and R1, R2, R3, and R4 are hydrogen atoms.
  • GA derivatives include compounds having the following structure:
  • DMGA-PLL 3,3-dimethylglutaric anhydride (DMGA) reacts with the side chain amino group of ⁇ -poly-L-lysine to form a carboxylated amphoteric polymer (DMGA-PLL). ) Can be obtained.
  • DMGA 3,3-dimethylglutaric anhydride
  • epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimeric polymer is a water-soluble polymer comprising a sucrose multimer produced by cross-linking sucrose with epichlorohydrin.
  • Epichlorohydrin crosslinking is crosslinking that occurs when epichlorohydrin is added to a hydroxyl group in a sucrose molecule under basic conditions, and the resulting epoxy is added to a hydroxyl group in an adjacent sucrose molecule.
  • the reaction formula for epichlorohydrin cross-linking is illustrated below:
  • the above reaction formula exemplifies the case where epichlorohydrin is added to all the hydroxyl groups of sucrose.
  • the epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimer polymer thus produced has the structure of the following formula (IV):
  • sucrose multimeric polymer can be carried out according to the disclosure of Example 1, 4, etc. of Patent Document 2 (US Pat. No. 3,300,344), for example.
  • the obtained sucrose multimeric polymer can be appropriately fractionated by a known means to obtain a fraction having a desired molecular weight.
  • Examples of commercially available products include Ficoll PM70 (molecular weight 70,000) manufactured by GE Healthcare.
  • the molecular weight of the epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimer polymer is, for example, 10,000 to 1,000,000, 40,000 to 700,000, 50,000 to 500,000. can do.
  • Epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimeric polymers are used in animal cell cryopreservation solutions, for example, 0.1% or more, 1% or more, 2.5% or more, 5% or more, 7.5% or more, 10% Thus, it can be contained at a concentration by weight of 15% or more, or it can be contained at a concentration by weight of 30% or less, 25% or less, 20% or less, for example, 1% to 30%, 7.5 -30%, 10-30%, 15-25%.
  • a suitable concentration range can be prepared by taking into consideration the types and concentrations of polymer components in animal cell cryopreservation solutions, for example, BSA-PLL, BSA-SA-PLL, GA-PLL, DMGA-PLL, etc. Furthermore, it can be prepared by considering the types and concentrations of other components, for example, the concentrations of sucrose, ethylene glycol, propylene glycol and the like.
  • the animal cell cryopreservation solution of the present invention is a physiological solution containing the above vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution.
  • a physiological solution For example, the physiological saline, PBS, cell culture medium, etc. of a well-known composition can be mention
  • the vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution contained in the animal cell cryopreservation solution can be, for example, 2 to 40 wt%, 3 to 30 wt%, and 5 to 20 wt%.
  • the concentration can be set to 1 to 100 mM, 5 to 50 mM, and 10 to 30 mM, for example.
  • the animal cell cryopreservation solution contains sucrose (Su).
  • the sucrose content can be, for example, in the range of 0.1 to 1M, 0.3 to 0.6M.
  • the animal cell cryopreservation solution contains ethylene glycol (EG) or propylene glycol (PG), preferably ethylene glycol.
  • Ethylene glycol or the like is an effective component in an animal cell cryopreservation solution, but its content is preferably small from the viewpoint of cytotoxicity.
  • the ethylene glycol concentration is set to, for example, 3 to 8 M, 4 to 7 M, 4.5 to 7 M, in order to realize a sufficiently excellent vitrification ability while reducing the content. It can be used by selecting from a range of 5-7M, 4M or more, 4.5M or more.
  • DMGA-PLL 25 mM is used as a polymer (amphoteric polymer), for example, sucrose 0.5M or more, EG6M or more, epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimeric polymer 10% by weight or more, for example A sucrose 0.75M or higher, EG 5.5M or higher (or EG6M or higher), epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimer polymer 10% by weight or higher can be prepared as an animal cell cryopreservation solution.
  • sucrose 0.5M or more, EG6M or more, epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimeric polymer 10% by weight or more for example A sucrose 0.75M or higher, EG 5.5M or higher (or EG6M or higher), epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimer polymer 10% by weight or higher can be prepared as an animal cell cryopreservation solution.
  • COOH-PLL (SA-PLL) 25 mM is used as the polymer (amphoteric polymer), for example, sucrose 0.5 M or more, EG 6.5 M or more, epichlorohydrin cross-linked sucrose Animal cells of 20% by weight or higher of body polymer, for example, sucrose 0.75M or higher, EG6M or higher (or EG6.5M or higher), epichlorohydrin-crosslinked sucrose multimeric polymer It can be a cryopreservation solution.
  • the animal cell cryopreservation method of the present invention is carried out by a method comprising a step of immersing an animal cell in an animal cell cryopreservation solution and a step of cooling and freezing the animal cell in the animal cell cryopreservation solution. Can do.
  • the step of raising the temperature and thawing the frozen animal cell in the animal cell cryopreservation solution can be performed.
  • the cryopreservation solution can be frozen while maintaining a vitrified state (amorphous state) without causing crystallization when the temperature is lowered and frozen. Crystallization is less likely to occur if the cooling rate is increased, but the increase in the cooling rate is accompanied by an increase in restrictions on cell handling, so that the heat capacity is large and heat conduction is not uniform. For organs, cracks due to an increase in temperature drop rate, tissue destruction due to formation of cracks, and the like are difficult options.
  • the temperature can be frozen in a vitrified state without causing crystallization by selecting from a temperature drop rate in the range of 5 ° C./min to 50 ° C./min, 10 ° C./min to 30 ° C./min. Can do.
  • the presence or absence of crystallization can be detected by the DSC measurement shown in the examples.
  • recrystallization is performed by selecting from a temperature increase rate in the range of 5 ° C./min to 100 ° C./min, 5 ° C./min to 50 ° C./min, 10 ° C./min to 50 ° C./min. Can be thawed while maintaining the vitrified state. The presence or absence of the occurrence of recrystallization can be detected by the DSC measurement shown in the examples.
  • the vitrification ability in the present invention is the ability to maintain the glass state and prevent crystallization, and may be, for example, either the ability to prevent crystallization when the temperature is lowered or the ability to prevent recrystallization when the temperature is raised. Or both. If the ability at either the temperature drop or the temperature rise is excellent, the glass will have excellent vitrification ability.
  • Use of animal cell cryopreservation solution with excellent vitrification ability enables good cryopreservation even for three-dimensional cell structures, tissues, organs, etc. with large heat capacity and non-uniform heat conduction Therefore, the animal cell cryopreservation solution of the present invention is suitable for use on animal cells in the form of three-dimensional cell structures, tissues, organs and the like. Therefore, according to the animal cell cryopreservation solution of the present invention, animal cells can be frozen, stored and thawed with a high survival rate.
  • the temperature to be stored after freezing is preferably lower in order to maintain the vitrified state, but according to the present invention, for example, ⁇ 100 ° C. or lower, ⁇ 130 ° C. or lower, or eg ⁇ 196 to ⁇
  • the storage temperature can be 80 ° C, -130 to -100 ° C, for example, 2 hours or more, 6 hours or more, 0.5 days or more, 1 day or more, or 1 day to 10 years or more. Can do.
  • the animal cell cryopreservation solution of the present invention achieves a glass transition point lower than the conventional one by containing the above vitrification state stabilizer for animal cell cryopreservation solution.
  • the glass transition point of the animal cell cryopreservation solution can be, for example, ⁇ 135 ° C. to ⁇ 100 ° C., ⁇ 135 ° C. to ⁇ 80 ° C., ⁇ 120 ° C. to ⁇ 115 ° C.
  • BSA-PLL Butyl succinic anhydride (BSA, Tokyo Kasei) is added so as to be 15 to 50 mol% (or 15 to 65 mol%) with respect to the amino group of ⁇ poly L lysine (25% aqueous solution, JNC, average molecular weight 4000). And reacted at 50 ° C. for 1 hour to prepare butyl carboxylated polylysine (BSA-PLL).
  • BSA-PLL butyl carboxylated polylysine
  • the average molecular weight of PLL is equivalent to 25 mM from the value of 4000.
  • BSA-PLL When the concentration is expressed as 10% by weight in terms of PLL, hereinafter, it may be expressed as 25 mM.
  • the reaction formula for the synthesis of BSA-PLL is shown below. The upper part is the reaction product, and the lower part is the product.
  • BSA-SA-PLL The amino group of ⁇ -poly-L-lysine (25% aqueous solution, JNC, average molecular weight 4000) was subjected to carboxylation with succinic anhydride (SA) in addition to butyl succinic anhydride to give butyl carboxyl -Carboxylated-polylysine (BSA-SA-PLL) was prepared.
  • SA succinic anhydride
  • BSA-SA-PLL butyl carboxyl -Carboxylated-polylysine
  • BSA (35) -SA (30) -PLL is an ampholyte polymer in which 35% of polylysine amino groups are reacted with BSA and 30% are reacted with SA. The total carboxyl group introduction amount was 65%.
  • BSA (15) -SA (50) -PLL and BSA (50) -SA (15) -PLL were also synthesized. Note that when BSA-PLL is simply expressed, it is BSA (50) -PLL in which 50% is replaced only with BSA-PLL and is not reacted with SA.
  • PLL poly L lysine
  • DMGA-PLL 3,3-dimethylglutaric anhydride
  • the reaction formula for the synthesis of DMGA-PLL is shown below. Note that the two types of repeating units in the structural formula of DMGA-PLL are the result of modification reaction by DMGA in the chain of ⁇ -polyL lysine.
  • X and Y are Means the molar fraction of each partial structure in the molecule, and the ratio of Y / (X + Y) is the content of the repeating unit modified by DMGA, for example, 0.5 to 0.70, 0.5 to (It can be in the range of 0.65.)
  • vitrification solution Based on a mixed solution of ethylene glycol (EG) and sucrose (phosphate buffer solution PBS solution), a vitrification solution was prepared by adjusting each carboxylated polylysine to a final concentration of 12.5 mM. The concentration of sucrose was fixed at 0.5M, and the concentration of EG was changed to 4-6.5M.
  • DSC measurement Each vitrification solution was evaluated by a differential scanning calorimeter (DSC) (product name DSC6200, manufactured by Seiko Instruments Inc.) as follows.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of DSC measurement of a conventional vitrification solution at a heating rate of 50 ° C./min. An exothermic peak indicating that recrystallization occurred in DAP was observed. In EG6.5M-Suc0.75M, an exothermic peak indicating that recrystallization occurred similarly was observed. For convenience of confirmation in the graph, these exothermic peaks are surrounded by ellipses. In the vitrification solution to which PLL (0.65) was added, that is, EG6.5M-Suc0.75M-PLL (0.65) 10%, an exothermic peak indicating that recrystallization occurred was not observed.
  • COOH-PLL aqueous solution containing SA (65) -PL 25 mM, ethylene glycol 6M, sucrose 0.5M
  • BSA-PLL aqueous solution containing BSA (65) -PL 25 mM, ethylene glycol 6M, sucrose 0.5M BSA (35) -SA (30) -PLL: Aqueous solution containing BSA (35) -SA (30) -PLL 25 mM, ethylene glycol 6M, sucrose 0.5M
  • FIG. 2a is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL.
  • a peak indicating crystallization was observed at around ⁇ 70 ° C. to ⁇ 80 ° C. That is, crystallization occurred due to the temperature drop.
  • FIG. 2b is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL.
  • the temperature lowering process the upper half of the graph
  • no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • FIG. 2c is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of the vitrification solution using BSA (35) -SA (30) -PLL.
  • BSA 35) -SA (30) -PLL.
  • the temperature lowering process the upper half of the graph
  • no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • -BSA-PLL, EG5M Aqueous solution containing BSA (65) -PL 25 mM, ethylene glycol 5 M, sucrose 0.5 M-BSA-PLL, EG4.5 M: BSA (65) -PLL 25 mM, ethylene glycol 4.5 M, sucrose Aqueous solution containing 0.5M
  • FIG. 3a is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL and EG5M.
  • the temperature lowering process the upper half of the graph
  • no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • FIG. 3b is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL and EG4.5M. In the temperature lowering process (upper half of the graph), a peak indicating crystallization was observed.
  • FIG. 4 is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA (35) -SA (30) -PLL, EG 5.5M. In the temperature lowering process (the upper half of the graph), no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • COOH-PLL aqueous solution containing SA (65) -PL 25 mM, ethylene glycol 6.5M, sucrose 0.5M
  • BSA-PLL aqueous solution containing BSA (65) -PLL 25 mM, ethylene glycol 6M, sucrose 0.5M BSA (35) -SA (30) -PLL: An aqueous solution containing BSA (35) -SA (30) -PLL 25 mM, ethylene glycol 6.5 M, sucrose 0.5 M
  • FIG. 5a is a graph showing the result of recrystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using COOH-PLL.
  • a peak indicating recrystallization was observed at around ⁇ 50 ° C. to ⁇ 20 ° C. That is, recrystallization occurred due to the temperature rise.
  • FIG. 5b is a graph showing the result of recrystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using BSA-PLL. In the temperature raising process (lower half of the graph), no peak indicating recrystallization was observed. That is, the glass transitioned from the vitrified state to the liquid state without causing recrystallization due to the temperature rise.
  • FIG. 5c is a graph showing the result of recrystallization evaluation by DSC measurement of the vitrification solution using BSA (35) -SA (30) -PLL. In the temperature raising process (lower half of the graph), no peak indicating recrystallization was observed. That is, the glass transitioned from the vitrified state to the liquid state without causing recrystallization due to the temperature rise.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • RIKEN BioResource Center RIKEN BioResource Center
  • -BSA-PLL aqueous solution containing BSA (65) -PL 25 mM, ethylene glycol 5M, sucrose 0.5M-COOH-PLL: aqueous solution containing SA (65) -PLL 25mM, ethylene glycol 6.5M, sucrose 0.5M
  • Control An aqueous solution containing ethylene glycol 5M and sucrose 0.5M
  • BSA-SA-PLL BSA (35) -SA (30) -PLL 25 mM, aqueous solution containing ethylene glycol 5.5M, sucrose 0.5M COOH-PLL: SA (65) -PLL 25 mM, ethylene glycol 5M, aqueous solution containing sucrose 0.5M Control: aqueous solution containing ethylene glycol 5M, sucrose 0.5M
  • FIGS. 6a and 6b are graphs showing cell viability by each vitrification solution.
  • BSA-SA-PLL had a higher cell viability than BSA-PLL and exceeded COOH-PLL and Control.
  • DMGA-PLL, EG6M aqueous solution containing DMGA (65) -PLL 25 mM, ethylene glycol 6M, sucrose 0.5M DMGA-PLL, EG5M: DMGA (65) -PLL 25 mM, ethylene glycol 5M, sucrose 0.5M Aqueous solution containing DMGA-PLL, EG4.5M: Aqueous solution containing DMGA (65) -PLL 25mM, ethylene glycol 4.5M, sucrose 0.5M DMGA-PLL, EG4M: DMGA (65) -PLL 25mM, ethylene glycol 4M , Aqueous solution containing 0.5M sucrose
  • FIG. 7a is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG6M.
  • the temperature lowering process the upper half of the graph
  • no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • FIG. 7b is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG5M.
  • the temperature lowering process the upper half of the graph
  • no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • FIG. 7c is a graph showing the result of crystallization evaluation by DSC measurement of a vitrification solution using DMGA-PLL and EG4.5M.
  • the temperature lowering process the upper half of the graph
  • no peak indicating crystallization was observed. That is, a vitrified state was obtained without causing crystallization due to a temperature drop.
  • FIG. 7d is a graph showing the results of crystallization evaluation by DSC measurement of vitrification solution using DMGA-PLL and EG4M. In the temperature lowering process (upper half of the graph), a peak indicating crystallization was observed at around ⁇ 50 ° C. to ⁇ 60 ° C.
  • Reference Example 7 As Reference Example 7, an experiment described later was performed. Unless otherwise specified, other conditions were the same as in Reference Example 1.
  • a vitrification solution Based on a mixed solution (PBS) of ethylene glycol (EG) and sucrose, a vitrification solution was prepared by adjusting each carboxylated polylysine to a final concentration of 25 mM. The concentration of sucrose (Su) was fixed at 0.5M, and the concentration of EG was changed from 4M to 6.5M.
  • the composition of the vitrification solution used is as follows: Control: Su0.5M, EG6.5M: FIG. SA-PLL (COOH-PLL) 25 mM, Su0.5M, EG6.5M: FIG. COOH-PLL 25 mM, Su 0.5 M, EG 5.5 M: FIG. 10 a COOH-PLL 25 mM, Su0.5M, EG5M: FIG.
  • each vitrification liquid was performed as follows. 10 ⁇ L of each vitrification solution was placed on an aluminum pan for DSC, and the temperature was lowered to ⁇ 170 ° C. at 10 ° C./min with liquid nitrogen to confirm the presence or absence of crystallization and vitrification. Furthermore, it heated up to room temperature at 10 degreeC / min from there, and the presence or absence of recrystallization was confirmed.
  • FIG. 8 shows a solution of EG 6.5M and sucrose without polymer as a vitrification solution
  • FIG. 9 shows a decrease in temperature of the COOH-PLL 25 mM, EG 6.5M and sucrose 0.5M solution as a vitrification solution at 10 ° C./min. It is a DSC curve when heated. From FIG. 8, when there was no polymer, a crystallization peak was observed around ⁇ 90 ° C., and a melting peak was observed around ⁇ 30 ° C. On the other hand, when COOH-PLL was added, no crystallization peak was observed, and a glass transition point was observed in the vicinity of ⁇ 130 ° C., indicating that it was vitrified. In addition, a recrystallization peak was observed at around -60 ° C. when the temperature was raised.
  • 10a and 10b show the results when the EG concentration of the COOH-PLL-added vitrification solution was lowered to 5.5M and 5.0M. Vitrification was confirmed at 5.5M, but 5M Then, a crystallization peak was observed. It was confirmed that the crystallization suppressing effect of COOH-PLL was exhibited at EG 5.5M or more.
  • the crystallization inhibition EG concentration of BSA-PLL was 5M from FIGS. 11a and 11b, and the crystallization inhibition EG concentration of DMGA-PLL was 4.5M from FIGS. 12a and 12b. It was confirmed that the crystallization suppression effect of BSA-PLL was exhibited at EG5M or higher. On the other hand, it was confirmed that the crystallization inhibitory effect of DMGA-PLL was exhibited at EG 4.5M or more. From these results, it was confirmed that DMGA-PLL had the highest crystallization suppression effect among the polymers synthesized and compared.
  • FIG. 13a, FIG. 13b, and FIG. 13c show DSC results of EG 6.0M and sucrose 0.5M solutions of three polymers. In all polymers, EG at this concentration does not crystallize, confirming vitrification. On the other hand, from FIGS. 13a and 13b, COOH-PLL and BSA-PLL showed recrystallization when the temperature was raised, whereas FIG. 13c showed no recrystallization in DMGA-PLL. From these results, it was confirmed that DMGA-PLL has higher crystallization suppression effect and recrystallization suppression effect than other polymers.
  • DMGA-PLL DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: FIG. 14d
  • Control EG6M, Su0.5M: a in FIG. COOH-PLL: COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: b in FIG.
  • BSA-PLL BSA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: c in FIG.
  • MSC was cultured in a 37 ° C. incubator using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum. After becoming confluent in a 3.5 cm cell culture dish (IWAKI), a cell sheet cultured continuously for 1 week was used in the experiment. After removing the culture solution, 2 mL of a 20% EG / DMEM solution was added to the MSC sheet and allowed to stand at room temperature for 25 minutes to equilibrate. Then, after removing the solution, 500 ⁇ L of each vitrification solution was added at an ice temperature, and after standing for 20 minutes, the petri dish was maintained at a point of 1 cm from the liquid nitrogen vapor and frozen.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • IWAKI 3.5 cm cell culture dish
  • the freezing speed can be controlled by the distance from the liquid nitrogen vapor at this time, and a freezing speed of about 10 ° C./min is obtained at a point 1 cm from the vapor. Thereafter, it was allowed to stand for 10 minutes in a steam atmosphere, and after sufficiently solidifying, it was immersed in liquid nitrogen to complete freezing. Subsequently, the thawing operation was performed. For thawing, 3 ml of 1M sucrose / DMEM warmed to 37 ° C. was added to an MSC sheet culture dish taken out of liquid nitrogen and removed after 1 minute. Next, 3 mL of 0.5 M sucrose / DMEM solution was added and removed after 3 minutes.
  • FIGS. 14a, 14b, 14c, and 14d are fluorescence micrographs obtained by double-staining the cell sheets frozen and thawed by the above procedure using the respective glass solutions, and the lower right bar of the field of view indicates 100 ⁇ m.
  • live cells are stained green with Calsein AM, and dead cells are stained red with ethidium homodimer.
  • the viability was determined by counting the number of living cells (green stained cells) and dead cells (red stained cells) in the visual fields of FIGS. 14a, 14b, 14c, and 14d. Vitrification liquid without polymer (FIG.
  • the glass transition point of water is around -130 ° C.
  • the glass state once achieved can be maintained semipermanently at the liquid nitrogen temperature. This is because the liquid nitrogen temperature is below the glass transition point of water.
  • water in a glass state is left in a freezer at ⁇ 80 ° C. or the like, in principle, crystallization occurs thermodynamically and ice crystals are formed. Therefore, in order to preserve vitrification in a freezer, it is desirable to raise the glass transition point of water to a temperature above the freezer.
  • the optimal composition of the vitrification solution was studied, such as adding solutes such as ethylene glycol and sucrose at high concentrations.
  • Comparative Examples 1 to 3 three types of vitrification solutions of DAP213, EG6.5M ⁇ sucrose 0.5M, EG6.5M ⁇ sucrose 0.5M ⁇ COOH-PLL25mM are prepared, and DSC measurement is performed. The glass transition point was determined. Each solution was placed in a 10 ⁇ L aluminum pan and immersed in liquid nitrogen to be vitrified once. It was set in a DSC (TA Instruments, Discovery DSC) whose sample chamber had been cooled to ⁇ 170 ° C. in advance, and the temperature was raised at 10 ° C./min to obtain the glass transition point.
  • DSC T Instruments, Discovery DSC
  • FIG. 16 is a graph showing the recrystallization behavior of various vitrification solutions. As shown in FIG. 16, in DAP, the glass transition point was ⁇ 126 ° C., and in the solution of EG 6.5 M / sucrose 0.5 M, it was ⁇ 123 ° C. However, in the case of adding a COOH-PLL vitrification solution, It was possible to raise to 119 ° C.
  • Example 1 10% of sucrose polymer (product name: Ficoll, average molecular weight 70,000, manufactured by GE Health Science) was added as a hydrophilic polysaccharide, and the same test was performed. Then, as shown in FIG. 17, Tg could be raised to ⁇ 113 ° C. Commercially available electric freezers are available at ⁇ 110 ° C. and ⁇ 130 ° C., and they are approaching the range that can be vitrified and stored at ⁇ 110 ° C. freezer.
  • FIG. 17 is a graph showing the recrystallization behavior of DMGA-PLL vitrification solution (DMGA-PLL 25 mM, Su 0.5 M, EG 6.0 M, Ficoll 10%).
  • FIG. 18 and FIG. 19 show the presence or absence of crystallization when each vitrification solution is left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 3 hours.
  • FIG. 18 shows a vitrification solution obtained by adding 25 mM of DMGA-PLL or COOH-PLL (SA-PLL) to 50% EG6M, sucrose 0.5M, Ficoll 10% solution to a 96-well microplate made of polystyrene resin. It is a photograph showing the appearance after injecting one by one and leaving it at ⁇ 80 ° C. for 3 hours. The wells to which COOH-PLL was added became white and opaque, and crystallization was observed (wells in the 7th and 8th rows from the left side of FIG. 18). On the other hand, all the wells to which DMGA-PLL was added remained transparent and did not show crystallization and were in a glass state (wells in the first and second rows from the left side of FIG. 18).
  • SA-PLL COOH-PLL
  • ficoll and pullulan are added to a solution of EG6M, sucrose 0.5M, and DMGA 25 mM, respectively, and 50 ⁇ L is injected into a 96-well microplate made of polystyrene resin. It is a photograph which shows the external appearance after being left for a period of time.
  • the numbers (1) to (4) in the photograph indicate that 3 wells each were injected with a solution having the following composition: (1) EG6M, sucrose 0.5M (2) EG6M, sucrose 0.5M, DMGA 25 mM (3) EG6M, sucrose 0.5M, DMGA 25 mM, Ficoll 10% (4) EG6M, sucrose 0.5M, DMGA 25 mM, pullulan 10%
  • Table 1 summarizes the results obtained by changing the experimental system shown in FIG. 19 with various concentrations of EG and sucrose.
  • Table 1 is a table showing the vitrification evaluation of each vitrification solution after standing at ⁇ 80 ° C. for 3 hours.
  • As the polymer 25 mM of DMGA-PLL or COOH-PLL was added, or no polymer was added.
  • As the hydrophilic polysaccharide Ficoll or pullulan was added, or no hydrophilic polysaccharide was added. The evaluation of vitrification was evaluated by visual observation when all the wells of the corresponding sample were transparent, and it was evaluated that the glass was always vitrified and marked with a circle.
  • MSC human mesenchymal stem cell
  • IWAKI Dulbecco's modified Eagle medium
  • each vitrification solution was added at an ice temperature, and after standing for 20 minutes, the petri dish was maintained at a point of 1 cm from the liquid nitrogen vapor and frozen. It is known that the freezing speed can be controlled by the distance from the liquid nitrogen vapor at this time, and a freezing speed of about 10 ° C./min is obtained at a point 1 cm from the vapor. Thereafter, it was allowed to stand for 10 minutes in a steam atmosphere, and after sufficiently solidifying, it was immersed in liquid nitrogen to complete freezing. Then proceed to the thawing operation. For thawing, 3 ml of 1M sucrose / DMEM warmed to 37 ° C.
  • FIG. 20a, 20b, 20c, and 20d show that the MSC sheets were left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 hour and then thawed and washed on the next day using the vitrification solutions of the respective compositions. It is the dyeing
  • the composition of the vitrification solution used is as follows: EG6M, Su0.5M: FIG. 20a COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: FIG. 20b DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: FIG. 20c DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M, Ficoll 10%: FIG. 20d
  • FIG. 21a, FIG. 21b, FIG. 21c, and FIG. 21d show that the MSC sheet was left in a freezer at ⁇ 80 ° C. for 1 day and then thawed and washed on the next day using the vitrification solutions of the respective compositions. It is the dyeing
  • the combination of DMGA-PLL and Ficoll significantly increased the number of green cells.
  • the composition of the vitrification solution used is as follows: EG6M, Su0.5M: FIG. 21a COOH-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: FIG. 21b DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M: FIG. 21c DMGA-PLL 25 mM, EG6M, Su0.5M, Ficoll 10%: FIG. 21d
  • Table 2 shows the MSC survival rate after standing at ⁇ 80 ° C. with each vitrification solution as the quantitative results. As shown in Table 2, the results show the same tendency as in Table 1.
  • the vitrification solution of EG6M, DMGA-PLL 25 mM, sucrose 0.5 M, Ficoll 10% shows a glass state even at ⁇ 80 ° C. It could be maintained to some extent, and the cell viability could be increased. This indicates that cell structures for regenerative medicine including MSC sheets can be cryopreserved with a commercially available high-performance electric freezer such as ⁇ 130 ° C. without cryopreservation with liquid nitrogen.
  • an animal cell cryopreservation solution having excellent vitrification ability can be obtained.
  • the present invention is industrially useful.

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Abstract

（ａ）ε－ポリ－Ｌ－リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；（ｂ）ε－ポリ－Ｌ－リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；又は（ｃ）ε－ポリ－Ｌ－リジンを、式Ｉで表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物、からなる群から選択された両性高分子化合物と、（ｄ）エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子とを含む動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤、及び該ガラス化状態安定化剤を含有する動物細胞凍結保存液によって、優れたガラス化能を有する動物細胞凍結保存液を提供する。

Description

動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤
　本発明は、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤、及び該ガラス化状態安定化剤を含有する動物細胞凍結保存液に関する。
　近年、再生医療の臨床応用への期待が高まっている。このための基本技術として、細胞、細胞シート、三次元形状の細胞構造体、組織を、凍結保存する技術が必要とされている。このような技術として、凍結保護物質を添加して、対象の損傷を防ぎつつ、凍結保存する技術がある。このような凍結保護物質として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｏ＝Ｓ（ＣＨ3）2）、グリセリンなどが知られている。
　ＤＭＳＯやグリセリンは、分散した細胞に対する凍結保存での使用には、十分な実績がある。しかし、ＤＭＳＯやグリセリンは、細胞シート、三次元形状の細胞構造体、組織などに対する凍結保存での使用では、解凍後にしばしば損傷した状態を生じて、ダメージを残してしまう。この損傷が、凍結時の氷晶形成や脱水収縮から生じるのではないかと考えて、氷の結晶化を制御して、アモルフォスの状態のままで固化させる、ガラス化法が、試みられている。
　ガラス化法は、受精卵の凍結手法として発展してきたものであり、従来のガラス化法は、一般に、急速な凍結速度と濃い溶質濃度によって、水溶液をガラス化させることを意図している。例えば、マウスの受精卵のガラス化溶液として、ＤＡＰ２１３が知られている。ＤＡＰ２１３は、ＤＭＳＯ　２Ｍ、アセトアミド　１Ｍ、プロピレングリコール　３Ｍの溶液であり、濃度が高く、毒性も高くなっている。典型的な使用法は、マウスの受精卵に含有されている水を、この溶液で置換し、液体窒素に直接浸漬して、ガラス化状態を得る手法である。しかし、このようなガラス化溶液によるガラス化では、細胞毒性が高く、さらに解凍時の再結晶化によるダメージも高いとされている。
　そこで、本発明者らは、凍結保護物質を検討して、ガラス化法を改良することを試みてきた（特許文献１）。
　特許文献２には、ショ糖多量体高分子の製造が開示されている。
特許第５６３０９７９号公報 米国特許第３３００４７４号明細書
　特許文献１に開示されたカルボキシル化ポリリジンを含む凍結保存液は、ガラス化能に優れた凍結保存液であるが、さらに優れたガラス化能を有する新規な凍結保存液が、求められている。
　したがって、本発明の目的は、優れたガラス化能を有する新規な動物細胞凍結保存液を提供することにある。
　本発明者は、鋭意研究の結果、以下に示す両性高分子化合物を動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤として使用した動物細胞凍結保存液によって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。
　したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
　以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物と、
　（ｄ）エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子とを含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤：
　（ａ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；
　（ｂ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；　又は
　（ｃ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、次の式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （ただし、上記の式中、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基であり；
　Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基であり；
　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基である）
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
（２）
　式Ｉで表される化合物が、次の式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （ただし、上記の式中、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基である）
で表される化合物である、（１）に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（３）
　両性高分子化合物において、ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合が、５０％～７５％の範囲にある、（１）又は（２）に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（４）
　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物が、
　ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ａに対する、
　ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、ブチル無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ｂの比率Ｂ／Ａが、
　２／３０～４０／３０の範囲にある、（１）～（３）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（５）
　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子の分子量が、１０，０００～１，０００，０００の範囲にある、（１）～（４）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（６）
　（１）～（５）のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
（７）
　（１）～（５）のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有し、
　エチレングリコール又はプロピレングリコールを、３～８Ｍの濃度で含有する、生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
（８）
　さらに、スクロースを、０．１～１Ｍの濃度で含有する、（７）に記載の動物細胞凍結保存液。
（９）
　（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された両性高分子化合物を、２～４０重量％で含有し、
　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子を、１～３０重量％で含有する、（６）～（８）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
（１０）
　動物細胞凍結保存液のガラス転移点が、－１３５℃～－８０℃である、（６）～（９）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
（１１）
　（６）～（１０）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、
　動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、
を含む、動物細胞凍結保存方法。
（１２）
　動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、
　凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、
を含む、（１１）に記載の動物細胞凍結保存方法。
（１３）
　動物細胞を、降温して凍結する工程が、
　動物細胞を、降温してガラス化状態で凍結する工程、である、（１１）～（１２）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１４）
　動物細胞を、昇温して解凍する工程が、
　動物細胞を、昇温して再結晶化することなく解凍する工程、である、（１２）～（１３）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１５）
　降温して凍結する工程が、
　降温速度５℃／分～５０℃／分で降温して凍結する工程、である、（１１）～（１４）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１６）
　昇温して解凍する工程が、
　昇温速度５℃／分～１００℃／分で昇温して解凍する工程、である、（１２）～（１５）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１７）
　動物細胞を、降温して凍結する工程の後で、
　凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程の前に、
　凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、－１９６℃～－７５℃で保存する工程、
を含む、（１２）～（１６）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
　本発明によれば、優れたガラス化能を有する動物細胞凍結保存液を得ることができる。この動物細胞凍結保存液を使用すれば、従来よりも遅い降温速度であっても結晶化が抑制されて、ガラス化状態を維持しつつ、凍結保存できる。また、昇温時においても、再結晶化が抑制されて、ガラス化状態が安定に維持されつつ、解凍することができる。そのために、本発明の動物細胞凍結保存液によれば、動物細胞を高い生存率で凍結解凍することができる。
図１は、昇温速度５０℃／ｍｉｎでの従来のガラス化液のＤＳＣの測定の結果を示すグラフである。 図２ａは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図２ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図２ｃは、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図３ａは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図３ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図４は、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図５ａは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。 図５ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。 図５ｃは、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。 図６ａは、各ガラス化液による細胞生存率を示すグラフである。 図６ｂは、各ガラス化液による細胞生存率を示すグラフである。 図７ａは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図７ｂは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図７ｃは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図７ｄは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図８は、ＥＧ６．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図９は、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ、ＥＧ６．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１０ａは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１０ｂは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１１ａは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１１ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１２ａは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１２ｂは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１３ａは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１３ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１３ｃは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。 図１４ａは、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図１４ｂは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図１４ｃは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図１４ｄは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図１５は、各ガラス化液における凍結解凍後の細胞の生存率を示すグラフである。 図１６は、各種ガラス化液の再結晶化挙動を示すグラフである。 図１７は、ＤＭＧＡ－ＰＬＬガラス化液（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、Ｓｕ　０．５Ｍ、ＥＧ６．０Ｍ、Ｆｉｃｏｌｌ１０％）の再結晶化挙動を示すグラフである。 図１８は、ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、フィコール１０％溶液に対して、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ又はＣＯＯＨ－ＰＬＬ（ＳＡ－ＰＬＬ）を２５ｍＭ添加したガラス化液を－８０℃に３時間放置した後の外観を示す写真である。 図１９は、ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、ＤＭＧＡ２５ｍＭの溶液に対して各多糖類を添加したガラス化液を－８０℃に３時間放置した後の外観を示す写真である。 図２０ａは、ガラス化液（ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１時間放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２０ｂは、ガラス化液（ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１時間放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２０ｃは、ガラス化液（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１時間放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２０ｄは、ガラス化液（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ、Ｆｉｃｏｌｌ　１０％）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１時間放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２１ａは、ガラス化液（ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１日放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２１ｂは、ガラス化液（ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１日放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２１ｃは、ガラス化液（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１日放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。 図２１ｄは、ガラス化液（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６Ｍ、Ｓｕ０．５Ｍ、Ｆｉｃｏｌｌ　１０％）を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１日放置した後、二重染色した蛍光顕微鏡写真である。
　具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤］
　本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物と、（ｄ）エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子とを含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤にある：
　（ａ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；
　（ｂ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；　又は
　（ｃ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、次の式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （ただし、上記の式中、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基であり；
　Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基であり；
　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基である）
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
［ε－ポリ－Ｌ－リジン］
　ε－ポリ－Ｌ－リジンは、公知のε－ポリ－Ｌ－リジンを使用することができる。ε－ポリ－Ｌ－リジンは、例えば分子量が１００～１００，０００であり、好適な実施の態様において、微生物または酵素により生産される数平均分子量が例えば１０００～２万、１０００～１万のε－ポリ－Ｌ－リジンを使用することができる。ε－ポリ－Ｌ－リジンは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられており、重合度１５～３５のものの他、重合度が２０以下のものの生産も試みられている。数平均分子量または数平均重合度の測定は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、例えば、アトー（株）製の電気泳動装置及びデンシトグラフ（ＡＥ－６９２０Ｖ型）を用いて容易に測定することができる。加熱処理による高分子量化により分子量３万以上として用いることもできる。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に１級アミノ基を有しており、このアミノ基が、後述する反応によってカルボキシル化される。
［ε－ポリ－Ｌ－リジンのアミノ基のカルボキシル化］
　アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物は、ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合を、例えば５０％～７５％、６０％～７０％の範囲とすることができる。
［ＢＳＡ－ＰＬＬ］
　ブチル無水コハク酸（ＢＳＡ）は、実施例に記載の化学反応式の通り、ε－ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）の側鎖のアミノ基と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＢＳＡ－ＰＬＬ）を生成し、これはアミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物であり、本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤である。
［ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬ］
　ε－ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）の側鎖のアミノ基が、ブチル無水コハク酸（ＢＳＡ）及び無水コハク酸（ＳＡ）と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬ）は、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物であり、本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤である。ε－ポリ－Ｌ－リジンとの反応は、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸を、同時に反応させてもよく、前後して反応させてもよく、いずれを前又は後に反応させてもよい。ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ａに対する、ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、ブチル無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ｂの比率Ｂ／Ａを、例えば、２／３０～４０／３０の範囲、１０／３０～４０／３０の範囲、３０／４０～４０／３０の範囲とすることができる。
［ＧＡ－ＰＬＬ］
　次の式Ｉで表されるＧＡ誘導体（グルタル酸無水物誘導体）は、ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＧＡ－ＰＬＬ）を生成し、これはアミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物であり、本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ただし、上記の式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができ、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって、Ｃ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基を形成することができる。Ｃ１～Ｃ４のアルキル基は、例えばＣ１～Ｃ３、Ｃ１～Ｃ２のアルキル基とすることができる。アルカン－ジイル基としては、例えば、Ｃ１～Ｃ３のアルカン－１，１－ジイル基、Ｃ４～Ｃ６のアルキレン基をあげることができる。Ｒ１とＲ２の組み合わせとして、例えば、水素原子と水素原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチル基とメチル基、メチル基とエチル基、エチル基とエチル基をあげることができる。Ｃ１～Ｃ３のアルカン－１，１－ジイル基として、例えば、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基をあげることができる。Ｃ４～Ｃ６のアルキレン基として、例えば、テトラメチレン基（ブタン－１，４－ジイル基）、ペンタメチレン基（ペンタン－１，５－ジイル基）をあげることができる。
　上記の式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができ、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって、Ｃ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基を形成することができる。Ｃ１～Ｃ４のアルキル基は、例えばＣ１～Ｃ３、Ｃ１～Ｃ２のアルキル基とすることができる。アルカン－ジイル基としては、例えば、Ｃ１～Ｃ３のアルカン－１，１－ジイル基、Ｃ４～Ｃ６のアルキレン基をあげることができる。Ｒ３とＲ４の組み合わせとして、例えば、水素原子と水素原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチル基とメチル基、メチル基とエチル基、エチル基とエチル基をあげることができる。Ｃ１～Ｃ３のアルカン－１，１－ジイル基として、例えば、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基をあげることができる。Ｃ４～Ｃ６のアルキレン基として、例えば、テトラメチレン基（ブタン－１，４－ジイル基）、ペンタメチレン基（ペンタン－１，５－ジイル基）をあげることができる。
　上記の式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができ、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって、Ｃ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基を形成することができる。Ｃ１～Ｃ４のアルキル基は、例えばＣ１～Ｃ３、Ｃ１～Ｃ２のアルキル基とすることができる。アルカン－ジイル基としては、例えば、Ｃ１～Ｃ３のアルカン－１，１－ジイル基、Ｃ４～Ｃ６のアルキレン基をあげることができる。Ｒ５とＲ６の組み合わせとして、例えば、水素原子と水素原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチル基とメチル基、メチル基とエチル基、エチル基とエチル基をあげることができる。Ｃ１～Ｃ３のアルカン－１，１－ジイル基として、例えば、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基をあげることができる。Ｃ４～Ｃ６のアルキレン基として、例えば、テトラメチレン基（ブタン－１，４－ジイル基）、ペンタメチレン基（ペンタン－１，５－ジイル基）をあげることができる。
　好適な実施の態様において、上記の式中、Ｒ１及びＲ２を上述の基として、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６を水素原子とすることができる。すなわち、次の式ＩＩで表されるＧＡ誘導体とすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　好適な実施の態様において、上記の式中、Ｒ３及びＲ４を上述の基として、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６を水素原子とすることができる。すなわち、次の式で表されるＧＡ誘導体とすることができる。このＧＡ誘導体は、言うまでもなく、上記の式中、Ｒ５及びＲ６を上述の基として、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４を水素原子としたＧＡ誘導体と等価である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　このようなＧＡ誘導体として、具体的には、例えば、以下の構造の化合物をあげることができる：
３，３－ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
グルタル酸無水物（ＧＡ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
３－メチルグルタル酸無水物（ＭＧＡ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
２，２－ジメチルグルタル酸無水物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
３，３－テトラメチレングルタル酸無水物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
３－オキサスピロ［５，５］ウンデカン－２，４－ジオン（３，３－ペンタメチレングルタル酸無水物）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［ＤＭＧＡ－ＰＬＬ］
　好適な実施の態様において、３，３－ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ）が、ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ）を得ることができる。
［エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子］
　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子は、ショ糖をエピクロロヒドリン架橋して製造されたショ糖多量体からなる水溶性高分子である。エピクロロヒドリン架橋は、塩基性条件下で、ショ糖分子中の水酸基にエピクロロヒドリンが付加し、生じたエポキシが隣接したショ糖分子中の水酸基へと付加して生じる架橋である。エピクロロヒドリン架橋の反応式を次に例示して示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記の反応式ではショ糖の水酸基の全てにエピクロロヒドリンが付加する場合を例示している。このようにして生じたエピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子は、次の式（ＩＶ）の構造を備えている：
式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　式ＩＶにおいて、ａは、１であり、
　ｂは、ショ糖単位の水酸基のうち、エピクロロヒドリンと反応することなく残された水酸基の数（ショ糖単位１個に対する平均数）を示し、例えば０～８、１～６、２～５の範囲であり（ただし、８は除く）、
　ｃは、ショ糖の水酸基に由来するＯ（酸素）とＯ（酸素）とを結合するエピクロロヒドリン架橋（Ｏ）－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－（Ｏ）の数（ショ糖単位１個に対する平均数）を示し、例えば０～８、１～６、２～５の範囲であり（ただし、０は除く）、
　ａとｂとｃとは、　８×ａ＝ｂ＋ｃ　の関係式を満たし、
　ｎは、ショ糖多量体高分子の平均重合度を示し、例えば１０～２，０００、５０～１，５００、１００～１，２００の範囲である。
　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子の合成は、具体的には、例えば特許文献２（米国特許第３３００４７４号）のＥｘａｍｐｌｅ　１、４等の開示にしたがって行うことができる。得られたショ糖多量体高分子は、公知の手段によって適宜分画して、所望の分子量の画分を得ることができる。市販の製品として、例えば、ＧＥヘルスケア社製のＦｉｃｏｌｌ　ＰＭ７０（分子量７万）などをあげることができる。
　好適な実施の態様において、エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子の分子量は、例えば１０，０００～１，０００，０００、４０，０００～７００，０００、５０，０００～５００，０００とすることができる。
　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子は、動物細胞凍結保存液において、例えば０．１％以上、１％以上、２．５％以上、５％以上、７．５％以上、１０％以上、１５％以上の重量％濃度で含有させることができ、あるいは例えば３０％以下、２５％以下、２０％以下の重量％濃度で含有させることができ、例えば１％～３０％、７．５～３０％、１０％～３０％、１５％～２５％とすることができる。好適な濃度範囲は、動物細胞凍結保存液のポリマー成分の種類と濃度、例えばＢＳＡ－ＰＬＬ、ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬ、ＧＡ－ＰＬＬ、ＤＭＧＡ－ＰＬＬなどの濃度を考量して、調製することができ、さらに他の成分の種類と濃度、例えばスクロース、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの濃度を考量して、調製することができる。
［動物細胞凍結保存液］
　本発明の動物細胞凍結保存液は、上記動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液である。生理溶液としては、特に制限はなく、例えば、公知の組成の生理食塩水、ＰＢＳ、細胞培養培地等をあげることができる。動物細胞凍結保存液に含有される動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤は、例えば２～４０重量％、３～３０重量％、５～２０重量％とすることができる。あるいは、両性高分子の分子量が２０００～２００００の場合に、例えば１～１００ｍＭ、５～５０ｍＭ、１０～３０ｍＭの濃度とすることができる。
［スクロース］
　好適な実施の態様において、動物細胞凍結保存液には、スクロース（Ｓｕ）が、含有される。スクロースの含有量は、例えば０．１～１Ｍ、０．３～０．６Ｍの範囲とすることができる。
［エチレングリコール、プロピレングリコール］
　好適な実施の態様において、動物細胞凍結保存液には、エチレングリコール（ＥＧ）又はプロピレングリコール（ＰＧ）が含有され、好ましくはエチレングリコールが含有される。エチレングリコール等は、動物細胞凍結保存液において有効な成分であるが、その含有量は細胞毒性の観点から少ないほうが好ましい。本発明によれば、この含有量を低減しつつ、十分に優れたガラス化能を実現することができるために、エチレングリコール濃度を、例えば３～８Ｍ、４～７Ｍ、４．５～７Ｍ、５～７Ｍ、４Ｍ以上、４．５Ｍ以上などの範囲から選択して使用することができる。
［動物細胞凍結保存液の好適な組成］
　好適な実施の態様において、ポリマー（両性高分子）としてＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭを使用して、例えばスクロース０．５Ｍ以上、ＥＧ６Ｍ以上、エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子１０重量％以上、例えばスクロース０．７５Ｍ以上、ＥＧ５．５Ｍ以上（又はＥＧ６Ｍ以上）、エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子１０重量％以上の動物細胞凍結保存液とすることができる。
　好適な実施の態様において、ポリマー（両性高分子）としてＣＯＯＨ－ＰＬＬ（ＳＡ－ＰＬＬ）２５ｍＭを使用して、例えばスクロース０．５Ｍ以上、ＥＧ６．５Ｍ以上、エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子２０重量％以上、例えばスクロース０．７５Ｍ以上、ＥＧ６Ｍ以上（又はＥＧ６．５Ｍ以上）、エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子１０重量％以上（又は２０重量％以上）の動物細胞凍結保存液とすることができる。
［動物細胞凍結保存方法］
　本発明の動物細胞凍結保存方法は、動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、を含む方法によって実施することができる。
　好適な実施の態様において、動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、を行うことができる。
［降温と結晶化］
　動物細胞の損傷を防ぐためには、降温して凍結する際に、凍結保存液に結晶化が生じることなく、ガラス化状態（アモルフォス状態）を維持したままで、凍結できることが好ましい。降温速度を大きくすれば結晶化が生じにくくなるが、降温速度の増大には、細胞の取り扱いについての制約の増大が伴うために、熱容量が大きく熱伝導が不均一な三次元細胞構造体、組織、臓器等では、降温速度の増大によるひび割れ、クラックの形成などによる組織の破壊などのため、困難な選択肢となる。本発明によれば、例えば５℃／分～５０℃／分、１０℃／分～３０℃／分の範囲の降温速度から選択して、結晶化を生じることなく、ガラス化状態で凍結することができる。結晶化の発生の有無は、実施例に示すＤＳＣ測定によって、検出することができる。
［昇温と再結晶化］
　動物細胞をいったんガラス化状態で凍結しても、昇温して解凍する際に、ガラス化状態が破れて、凍結保存液の再結晶化が生じてしまうことがあり、動物細胞の凍結保存による損傷を防ぐためには、この再結晶化を防いで、解凍できることが好ましい。昇温速度を大きくすれば再結晶化が生じにくくなるが、昇温速度の増大には、降温速度と同様に、細胞の取り扱いについての制約の増大が伴うために、熱容量が大きく熱伝導が不均一な三次元細胞構造体、組織、臓器等では、昇温速度の増大によるひび割れ、クラックの形成などによる組織の破壊などのため、困難な選択肢となる。本発明によれば、例えば５℃／分～１００℃／分、５℃／分～５０℃／分、１０℃／分～５０℃／分の範囲の昇温速度から選択して、再結晶化を生じることなく、ガラス化状態を維持して解凍することができる。再結晶化の発生の有無は、実施例に示すＤＳＣ測定によって、検出することができる。
［ガラス化能］
　本発明におけるガラス化能とは、ガラス状態を維持して結晶化を防ぐ能力であり、例えば、降温時に結晶化を防ぐ能力、あるいは昇温時に再結晶化を防ぐ能力のいずれであってもよく、両方であってもよい。降温時又は昇温時のいずれかにおける能力が優れていれば、優れたガラス化能を有することとなる。優れたガラス化能を備えた動物細胞凍結保存液を使用すれば、熱容量が大きく熱伝導が不均一な三次元細胞構造体、組織、臓器等に対しても、良好な凍結保存を可能とするので、本発明の動物細胞凍結保存液は、三次元細胞構造体、組織、臓器等の形態の動物細胞に対する使用に好適なものである。そのために、本発明の動物細胞凍結保存液によれば、動物細胞を高い生存率で、凍結することができ、保存することができ、解凍することができる。
［凍結保存］
　一般に、急激に液体窒素に浸漬するようなガラス化法の場合、いったん達成されたガラス状態は、水のガラス転移点（一般に－１３０℃付近）以下である液体窒素温度では半永久的にガラス状態を維持できる。しかし、これより高温である電気フリーザー中で放置した場合には、それが熱力学的にいずれは結晶化して、氷晶が形成される。そこで、利便性の高い電気フリーザーを利用して、凍結保存を実現するために、より高い温度下で凍結保存ができるような、優れたガラス化状態を維持できることが求められていた。本発明の動物細胞凍結保存液によれば、ガラス化状態が極めて安定して維持されるために、より高い保存温度での凍結保存（実施例において例えば－８０℃で１日保存）によっても、高い細胞生存率を維持することができる。凍結した後に保存する温度は、ガラス化状態維持のためにはより低い温度が好ましいことは言うまでもないが、本発明によれば、例えば－１００℃以下、－１３０℃以下、あるいは例えば－１９６～－８０℃、－１３０～－１００℃の保存温度とすることができ、例えば２時間以上、６時間以上、０．５日以上、１日以上、あるいは１日～１０年以上の保存日数とすることができる。
［ガラス転移点］
　本発明の動物細胞凍結保存液は、上記動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有することによって、従来よりも低いガラス転移点を達成している。好適な実施の態様において、動物細胞凍結保存液のガラス転移点は、例えば－１３５℃～－１００℃、－１３５℃～－８０℃、－１２０℃～－１１５℃とすることができる。
　以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」はそれぞれ重量％及び重量部を示す。
［ＣＯＯＨ－ＰＬＬの合成］
　無水コハク酸（ＳＡ、東京化成）を、εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、１５～５０ｍｏｌ％（あるいは１５～６５ｍｏｌ％）となるように添加し、５０℃で１時間反応させ、カルボキシル化ポリリジン（ＣＯＯＨ－ＰＬＬ）を作成した。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＣＯＯＨ－ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。このカルボキシル化ポリリジンは、以下において、ＳＡ－ＰＬＬ、又はＣＯＯＨ－ＰＬＬと記載することがある。特に記載がない場合には、ＣＯＯＨ－ＰＬＬのカルボキシル基導入量はεポリＬリジンの側鎖のアミノ基に対して６５％であり、これをＰＬＬ（０．６５）又はＳＡ（６５）－ＰＬＬと記載することがある。このＣＯＯＨ－ＰＬＬの合成の反応式を、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［ＢＳＡ－ＰＬＬの合成］
　ブチル無水コハク酸（ＢＳＡ、東京化成）を、εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、１５～５０ｍｏｌ％（あるいは１５～６５ｍｏｌ％）となるように添加し、５０℃で１時間反応させ、ブチルカルボキシル化ポリリジン（ＢＳＡ－ＰＬＬ）を作成した。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＢＳＡ－ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。このＢＳＡ－ＰＬＬの合成の反応式を、以下に示す。上段が反応物、下段が生成物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬの合成］
　εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、上記ブチル無水コハク酸によるブチル化に加えて、上記無水コハク酸（ＳＡ）によるカルボキシル化を行って、ブチルカルボキシル化－カルボキシル化－ポリリジン（ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬ）を作成した。後述する略号中のカッコ内の数字は、ポリリジンのアミノ基に対するそれぞれのカルボキシル基の導入率を示す。例えばＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬは、ポリリジンのアミノ基のうち、３５％をＢＳＡと反応させ、３０％をＳＡと反応させた両性電解質ポリマーを示す。トータルのカルボキシル基導入量を６５％とした。他にＢＳＡ（１５）－ＳＡ（５０）－ＰＬＬ、ＢＳＡ（５０）－ＳＡ（１５）－ＰＬＬも合成した。なお、単にＢＳＡ－ＰＬＬと表記した場合には、５０％をＢＳＡ－ＰＬＬとのみ置換したＢＳＡ（５０）－ＰＬＬであり、ＳＡと反応させていないものである。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。
［ＤＭＧＡ－ＰＬＬの合成］
　３，３－ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ、シグマアルドリッチ）を、εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、１５－５０ｍｏｌ％（あるいは１５－６５ｍｏｌ％）となるように添加し、５０℃で１時間反応させ、ジメチルグルタルカルボキシル化ポリリジン（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ）（３，３ジメチル無水グルタル化ポリリジン）を作成した。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＤＭＧＡ－ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。この３，３－ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ）の構造式を以下に示す。（このＤＭＧＡ－ＰＬＬの合成の反応式を、以下に示す。なお、ＤＭＧＡ－ＰＬＬの構造式中の２種類の繰り返し単位は、εポリＬリジンの鎖中にＤＭＧＡによる修飾反応がなされた結果として、必ずしも規則的あるいは周期的に出現するものではなく、ポリマーの鎖中に存在する割合のみを規定することが通常であることを当業者は理解している。つまり、繰り返しの値Ｘ及びＹは、分子内における各部分構造のモル分率を意味する。Ｙ／（Ｘ＋Ｙ）の比率は、ＤＭＧＡによって修飾された繰り返し単位の含有率であり、例えば０．５～０．７０、０．５～０．６５の範囲とすることができる。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
［ガラス化液の調製］
　エチレングリコール（ＥＧ）とスクロースの混合溶液（リン酸緩衝液ＰＢＳ溶液）をベースとし、各カルボキシル化ポリリジンを最終１２．５ｍＭとなるように調整したガラス化液を作成した。スクロースの濃度は０．５Ｍで固定し、ＥＧの濃度を４－６．５Ｍまで変えた。
［ＤＳＣ測定］
　示差走査熱量計（ＤＳＣ）（セイコーインスツル社製、製品名ＤＳＣ６２００）による各ガラス化液の評価を以下のように行った。
　各ガラス化液を、１０μＬ、ＤＳＣ用のアルミパンに乗せ、液体窒素によって、１０℃／ｍｉｎで温度を－１２０度まで下げていき、ＤＳＣ測定のグラフのピークの有無から結晶化の有無を確認した。さらにそこから１０℃／ｍｉｎで室温まで昇温し、ＤＳＣ測定のグラフのピークの有無から再結晶化の有無を確認した。
［参考比較例１］
［ＤＳＣによる従来のガラス化液の再結晶化評価］
　従来のガラス化液の特性を、液体窒素でいったん凍結した後に、上記のＤＳＣ測定の手順で、ただし５０℃／ｍｉｎの昇温速度として、評価した。従来のガラス化液としては、以下のものを使用した。これらのＤＳＣ測定結果を図１に示す。
・ＤＡＰ２１３：　ＤＭＳＯ　２Ｍ、アセトアミド　１Ｍ、プロピレングリコール　３Ｍ　を含む水溶液
・ＥＧ６．５Ｍ－Ｓｕｃ０．７５Ｍ：　エチレングリコール　６．５Ｍ、スクロース０．７５Ｍ　を含む水溶液
・ＥＧ６．５Ｍ－Ｓｕｃ０．７５Ｍ－ＰＬＬ（０．６５）１０％：　エチレングリコール　６．５Ｍ、スクロース０．７５Ｍ、ＳＡ（６５）－ＰＬＬ　１０重量％　を含む水溶液
　図１は昇温速度５０℃／ｍｉｎでの従来のガラス化液のＤＳＣの測定の結果を示すグラフである。ＤＡＰは再結晶化が生じたことを示す発熱ピークが観察された。ＥＧ６．５Ｍ－Ｓｕｃ０．７５Ｍでも、同様に再結晶化が生じたことを示す発熱ピークが観察された。グラフにおいて確認の便宜のために、これらの発熱のピークを楕円で囲んだ。ＰＬＬ（０．６５）を添加したガラス化液、すなわちＥＧ６．５Ｍ－Ｓｕｃ０．７５Ｍ－ＰＬＬ（０．６５）１０％では、再結晶化が生じたことを示す発熱ピークが観察されなかった。
［参考例１］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
　各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。ＤＳＣ測定結果を、図２ａ（ＣＯＯＨ－ＰＬＬ）、図２ｂ（ＢＳＡ－ＰＬＬ）、図２ｃ（ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ）にそれぞれ示す。
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ：　ＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＢＳＡ－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　図２ａは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、－７０℃～－８０℃付近で、結晶化を示すピークが観察された。すなわち、降温によって結晶化が生じた。
　図２ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
　図２ｃは、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
［参考例２］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
　各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。これらは、参考例１のＢＳＡ－ＰＬＬにおいて、エチレングリコール濃度を、６Ｍから、それぞれ５Ｍ及び４．５Ｍへと減少させたガラス化液である。ＤＳＣ測定結果を、図３ａ（ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ）、図３ｂ（ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ）にそれぞれ示す。
・ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ：　ＢＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ：　ＢＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　４．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　図３ａは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
　図３ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークが観察された。
［参考例３］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
　各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。これらは、参考例１のＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬにおいて、エチレングリコール濃度を、６Ｍから、５．５Ｍへと減少させたガラス化液である。ＤＳＣ測定結果を、図４（ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍ）に示す。
・ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　５．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　図４は、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
［参考例４］
［ＤＳＣによるガラス化液の再結晶化試験］
　各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度４０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。ＤＳＣ測定結果を、図５ａ（ＣＯＯＨ－ＰＬＬ）、図５ｂ（ＢＳＡ－ＰＬＬ）、図５ｃ（ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ）にそれぞれ示す。
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ：　ＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＢＳＡ－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　図５ａは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果示すグラフである。昇温過程（グラフの下半分）において、－５０℃～－２０℃付近で、再結晶化を示すピークが観察された。すなわち、昇温によって再結晶化が生じた。
　図５ｂは、ＢＳＡ－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。昇温過程（グラフの下半分）において、再結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、昇温によって再結晶化が生じることなく、ガラス化状態から液体状態へと移行した。
　図５ｃは、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。昇温過程（グラフの下半分）において、再結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、昇温によって再結晶化が生じることなく、ガラス化状態から液体状態へと移行した。
［参考例５］
［細胞生存率試験］
　各ガラス化液の細胞毒性を以下の細胞生存率試験によって評価した。
　ＭＳＣ（間葉系幹細胞）（理研バイオリソースセンター）をシャーレで培養して、細胞シートを調製した。次に、調製した細胞シートを以下に示す各ガラス化液に０℃で２０分間浸漬した。その後、細胞シートをＴｒｉｐａｎ　Ｂｌｕｅ染色した後に、倒立位相差顕微鏡で観察して、生存率を測定した。
　次のガラス化液について得られた結果を図６ａに示す。
・ＢＳＡ－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ：　ＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・Ｃｏｎｔｒｏｌ：　エチレングリコール　５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　次のガラス化液について得られた結果を図６ｂに示す。
・ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬ：　ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　５．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ：　ＳＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・Ｃｏｎｔｒｏｌ：　エチレングリコール　５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　図６ａ及び図６ｂは、各ガラス化液による細胞生存率を示すグラフである。ＢＳＡ－ＳＡ－ＰＬＬは、ＢＳＡ－ＰＬＬよりも細胞生存率が向上して、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ及びＣｏｎｔｒｏｌを超える値となっていた。
［参考例１～５及び参考比較例１の結果のまとめ］
　無水コハク酸のみで６５％カルボキシル化したＣＯＯＨ－ＰＬＬでは、降温過程で結晶化を抑制するのに必要なＥＧの濃度は６．５Ｍ必要であったが、ＢＳＡ－ＰＬＬではＥＧを５Ｍまで下げてもガラス化が可能であった。ＢＳＡ－ＰＬＬのガラス化能の高さが確認された。
　ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬを使用した場合、ＥＧの濃度が５．５Ｍまで下げてもガラス化を確認できた。ＢＳＡが多い方がガラス化能は高いが、細胞生存率がやや減少する（細胞毒性がやや大きくなる）傾向にあるが、ＢＳＡ（３５）－ＳＡ（３０）－ＰＬＬは十分に細胞生存率が大きかった。
　昇温過程では、４０℃／ｍｉｎにすると、ＣＯＯＨ－ＰＬＬでは再結晶化が見られていたところ、ＢＳＡ－ＰＬＬでは再結晶化のピークも消失した。このように、ＢＳＡ－ＰＬＬでは、再結晶化も抑制されることが分かり、ガラス状態の安定性が確認された。
［参考例６］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
　各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。ＤＳＣ測定結果を、図７ａ（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍ）、図７ｂ（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ）、図７ｃ（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ）、図７ｄ（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍ）にそれぞれ示す。
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍ：　ＤＭＧＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　６Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ：　ＤＭＧＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ：　ＤＭＧＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　４．５Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍ：　ＤＭＧＡ（６５）－ＰＬＬ　２５ｍＭ、エチレングリコール　４Ｍ、スクロース　０．５Ｍ　を含む水溶液
　図７ａは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
　図７ｂは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
　図７ｃは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
　図７ｄは、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、－５０℃～－６０℃付近で、結晶化を示すピークが観察された。
［参考例７］
　参考例７として、後述する実験を行った。特に記載のない限り、その他の条件は参考例１と同様にして行った。
［ガラス化液の調製］
　エチレングリコール（ＥＧ）とスクロースの混合溶液（ＰＢＳ）をベースとし、各カルボキシル化ポリリジンを最終２５ｍＭになるように調整したガラス化液を作成した。スクロース（Ｓｕ）の濃度は０．５Ｍで固定し、ＥＧの濃度を４Ｍから６．５Ｍまで変えた。使用したガラス化液の組成は、以下の通りである：
・Ｃｏｎｔｒｏｌ　：　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ６．５Ｍ　：　図８
・ＳＡ－ＰＬＬ（ＣＯＯＨ－ＰＬＬ）２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ６．５Ｍ　：　図９
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ５．５Ｍ　：　図１０ａ
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ５Ｍ　：　図１０ｂ
・ＢＳＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ５Ｍ　：　図１１ａ
・ＢＳＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ４．５Ｍ　：　図１１ｂ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ４．５Ｍ　：　図１２ａ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ４Ｍ　：　図１２ｂ
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ６Ｍ　：　図１３ａ
・ＢＳＡ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ６Ｍ　　　：　図１３ｂ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　ＥＧ６Ｍ　：　図１３ｃ
［ＤＳＣ測定］
　各ガラス化液の評価を以下の様に行った。
　各ガラス化液を１０μＬ、ＤＳＣ用のアルミパンに載せ、液体窒素によって１０℃／ｍｉｎで温度を－１７０℃まで下げていき、結晶化およびガラス化の有無を確認した。さらにそこから１０℃／ｍｉｎで室温まで昇温し、再結晶化の有無を確認した。
　図８はガラス化液としてポリマー無しのＥＧ６．５Ｍ、スクロース０．５Ｍの溶液、図９はガラス化液としてＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ、ＥＧ６．５Ｍ、スクロース０．５Ｍ溶液を１０℃／ｍｉｎで降温、昇温した時のＤＳＣカーブである。図８より、ポリマーが無い時は－９０℃付近に結晶化のピークが、－３０℃付近に融解のピークが見られた。一方、ＣＯＯＨ－ＰＬＬを添加した際は、結晶化のピークが見られず、－１３０℃付近にガラス転移点が見られ、ガラス化していることが示された。また、昇温時には－６０℃付近に再結晶化のピークも確認された。
　図１０ａと図１０ｂは、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ添加ガラス化液のＥＧの濃度を５．５Ｍおよび５．０Ｍに低下させた時の結果であるが、５．５Ｍではガラス化が確認されたが、５Ｍでは結晶化のピークが見られた。ＣＯＯＨ－ＰＬＬの結晶化抑制効果はＥＧ５．５Ｍ以上で発揮されることが確認できた。
　一方で、図１１ａ、図１１ｂからＢＳＡ－ＰＬＬの結晶化抑制ＥＧ濃度は５Ｍであり、図１２ａ、図１２ｂよりＤＭＧＡ－ＰＬＬの結晶化抑制ＥＧ濃度は４．５Ｍとなった。ＢＳＡ－ＰＬＬの結晶化抑制効果はＥＧ５Ｍ以上で発揮されることが確認できた。一方、ＤＭＧＡ－ＰＬＬの結晶化抑制効果はＥＧ４．５Ｍ以上で発揮されることが確認できた。これらの結果から、合成して比較したポリマー中で、ＤＭＧＡ－ＰＬＬが最も高い結晶化抑制効果を持つことが確認できた。
　図１３ａ、図１３ｂ、図１３ｃに、３種のポリマーのＥＧ６．０Ｍ、スクロース０．５Ｍ溶液のＤＳＣ結果を示す。すべてのポリマーにおいてこの濃度のＥＧでは結晶化は起こらず、ガラス化していることが確認される。一方、図１３ａ、図１３ｂから、ＣＯＯＨ－ＰＬＬとＢＳＡ－ＰＬＬでは昇温時に再結晶化が見られたのに対し、図１３ｃからはＤＭＧＡ－ＰＬＬでは再結晶化も見られなかった。これらの結果より、ＤＭＧＡ－ＰＬＬでは結晶化抑制効果、再結晶化抑制効果ともに、他のポリマーよりも効果が高いことが確認された。
［参考例８］
［細胞生存率試験］
　次に、これらポリマーを使用したガラス化液でヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（理研バイオリソースセンター）シートをガラス化保存して、細胞の生存率を確認する実験を、後述の手順で行った。この実験の手順の概要を示す説明を、スキーム１として示す。使用したガラス化液の組成は、以下の通りである：
・ｃｏｎｔｒｏｌ：　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１４ａ
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ：　ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１４ｂ
・ＢＳＡ－ＰＬＬ：　ＢＳＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１４ｃ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ：　ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１４ｄ
・ｃｏｎｔｒｏｌ：　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１５のａ
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ：　ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１５のｂ
・ＢＳＡ－ＰＬＬ：　ＢＳＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１５のｃ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ：　ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図１５のｄ
　スキーム１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　ＭＳＣは１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用し、３７℃のインキュベータ中で培養した。３．５ｃｍ細胞培養用シャーレ（ＩＷＡＫＩ）にコンフルエントになった後、１週間継続して培養した細胞シートを実験に用いた。
　培養液を除去した後、ＭＳＣシートに２０％ＥＧ／ＤＭＥＭ溶液を２ｍＬ添加し、室温で２５分放置し、平衡化させた。その後、溶液を除去した後、氷温で各ガラス化液を５００μＬ添加し、２０分放置後、液体窒素蒸気から１ｃｍの地点にシャーレを維持し、凍結した。このときの液体窒素蒸気からの距離で凍結スピードを制御することが可能であり、蒸気から１ｃｍの地点では約１０℃／ｍｉｎの凍結スピードが得られることが分かっている。その後、蒸気雰囲気下で１０分放置し、十分固化した後、液体窒素の浸漬し、凍結を完了させた。続いて解凍操作にうつった。解凍は、液体窒素から取り出したＭＳＣシート培養ディッシュに３７℃に暖めた１Ｍスクロース／ＤＭＥＭを３ｍｌ加え、１分後に除去した。次に０．５Ｍスクロース／ＤＭＥＭ溶液を３ｍＬ加え、３分後に除去した。続いてＤＭＥＭを３ｍＬ加え、５分後に除去を２回くり返し、最後はＤＭＥＭを２ｍＬ添加して３７℃のインキュベーター中で培養にうつった。翌日、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイにより生存率を評価した。
　この実験の結果を図１４ａ、図１４ｂ、図１４ｃ、図１４ｄに示す。図１４ａ～１４ｄはそれぞれのガラス液を使用して上記手順で凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真であり、視野の右下のバーは１００μｍを示す。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイによって、生細胞はＣａｌｓｅｉｎＡＭで緑色に染色されており、死細胞はエチジウムホモダイマーで赤色に染色されている。図１４ａ、図１４ｂ、図１４ｃ、図１４ｄの視野中の生細胞（緑色染色細胞）と死細胞（赤色染色細胞）の数をそれぞれカウントして生存率を求めた。ポリマー無しのガラス化液（図１４ａ）では３０％程度の生存率であったのに対し、ＣＯＯＨ－ＰＬＬの系（図１４ｂ）では７５％、ＢＳＡ－ＰＬＬ系（図１４ｃ）では５５％、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ系（図１４ｄ）では９３％であった。この値を棒グラフにして、図１５として示す。図１５の横軸のａ、ｂ、ｃ、ｄは、それぞれ図１４のａ、ｂ、ｃ、ｄに対応する。この結果から、ＤＭＧＡ－ＰＬＬの効果が高いことが確認された。
［実施例１、比較例１～３］
［ガラス転移点の向上］
　一般に水のガラス転移点は－１３０℃付近である。急激に液体窒素に浸漬するようなガラス化法の場合、一度達成されたガラス状態は、液体窒素温度では半永久的にガラス状態を維持できる。それは液体窒素温度が水のガラス転移点以下であるからである。一方、ガラス状態の水を－８０℃などのフリーザー中で放置した場合、原理的には、熱力学的にいずれは結晶化を起こし、氷晶が形成されることになる。従ってフリーザー中でガラス化保存するためには、水のガラス転移点をフリーザーの温度以上に上げることが望ましい。このためにエチレングリコールやスクロースなど溶質を高濃度に添加するなど最適なガラス化液の組成を検討した。
　具体的には、比較例１～３として、ＤＡＰ２１３、ＥＧ６．５Ｍ・スクロース０．５Ｍ、ＥＧ６．５Ｍ・スクロース０．５Ｍ・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭの３種類のガラス化液を用意し、ＤＳＣ測定を行い、ガラス転移点を求めた。それぞれの溶液を１０μＬアルミ製パンに入れ、液体窒素に浸漬することで一旦ガラス化させた。それをあらかじめ－１７０℃に試料室を冷やしたＤＳＣ（ＴＡインスツルメンツ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ＤＳＣ）にセットし、１０℃／ｍｉｎで昇温し、ガラス転移点を求めた。
　図１６は、各種ガラス化液の再結晶化挙動を示すグラフである。図１６に示すように、ＤＡＰではガラス転移点は－１２６℃、ＥＧ６．５Ｍ・スクロース０．５Ｍの溶液では－１２３℃であったが、ＣＯＯＨ－ＰＬＬ系のガラス化液を添加し溶液では－１１９℃まで上昇させることが可能であった。
　次に、実施例１として、親水性多糖類としてショ糖多量体高分子（製品名　Ｆｉｃｏｌｌ（フィコール）、平均分子量７万、ＧＥヘルスサイエンス製）を１０％添加して、同様の試験をした。すると、図１７に示すようにＴｇは－１１３℃まで上昇させることが可能であった。入手容易な市販の電気的フリーザーには－１１０℃および－１３０℃のものがあり、－１１０℃のフリーザーにてガラス化保存可能な範囲まで近づいている。図１７は、ＤＭＧＡ－ＰＬＬガラス化液（ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、Ｓｕ　０．５Ｍ、ＥＧ　６．０Ｍ、Ｆｉｃｏｌｌ　１０％）の再結晶化挙動を示すグラフである。
［ガラス化評価試験］
　各ガラス化液を－８０℃のフリーザー中で３時間放置した場合の結晶化の有無について図１８、図１９に示す。
　図１８は、ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、フィコール１０％溶液に対して、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ又はＣＯＯＨ－ＰＬＬ（ＳＡ－ＰＬＬ）を２５ｍＭ添加したガラス化液を、ポリスチレン樹脂製９６ウェルマイクロプレートへ、５０μＬずつ注入して、－８０℃に３時間放置した後の外観を示す写真である。ＣＯＯＨ－ＰＬＬを添加したウェルでは白く不透明となって、結晶化が見られた（図１８の左側から７列目及び８列目のウェル）。これに対し、ＤＭＧＡ－ＰＬＬを添加したウェルではすべて透明のままであり、結晶化が見られずガラス状態であった（図１８の左側から１列目及び２列目のウェル）。
　図１９ではＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、ＤＭＧＡ２５ｍＭの溶液に対して、フィコール、プルラン（シグマアルドリッチ製）をそれぞれ添加し、ポリスチレン樹脂製９６ウェルマイクロプレートへ、５０μＬずつ注入して、－８０℃に３時間放置した後の外観を示す写真である。写真中の（１）～（４）の番号は、それぞれ３ウェルずつ以下の組成の溶液を注入したことを示す：
　（１）　ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ
　（２）　ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、ＤＭＧＡ２５ｍＭ
　（３）　ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、ＤＭＧＡ２５ｍＭ、フィコール１０％
　（４）　ＥＧ６Ｍ、スクロース０．５Ｍ、　ＤＭＧＡ２５ｍＭ、プルラン１０％
　図１９において、フィコール添加の場合（上記（３））のみが、完全に透明を維持してガラス状態であった。ＤＭＧＡ無し、多糖類無し、プルラン添加の系では、すべて白く不透明となって、結晶化が見られた（上記（１）、（２）、（４））。
　図１９に示した実験系をＥＧの濃度、スクロースの濃度を種々変えて行った結果を表１にまとめた。表１は各ガラス化液の－８０℃３時間放置した後のガラス化評価を示す表である。ポリマーとしては、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ　又はＣＯＯＨ－ＰＬＬ　を２５ｍＭ添加するか、あるいはポリマーを加えなかった。親水性多糖類として、フィコール又はプルランを添加するか、あるいは親水性多糖類を加えなかった。ガラス化の評価は、目視観察によって、該当する試料の全てのウェルが透明であった場合には、常にガラス化していたと評価して、○（マル）を付した。該当する試料の全てのウェルが白く不透明となっていた場合には、常に結晶化していたと評価して、×（バツ）を付した。該当する試料のウェルの一部が透明であり一部が白く不透明となっていた場合には、ガラス化する試料と結晶化する試料があると評価して、△（三角）を付した。表１のように、ＥＧの濃度が高いほどガラス状態が維持される傾向があり、ＤＭＧＡの方がＣＯＯＨ－ＰＬＬよりも効果が高く、フィコールの効果も顕著であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
［細胞保存試験］
　次に、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（理研バイオリソースセンター）シートをガラス化保存する実験を行った。
　ＭＳＣは１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用し、３７℃のインキュベータ中で培養した。３．５ｃｍ細胞培養用シャーレ（ＩＷＡＫＩ）にコンフルエントになった後、１週間継続して培養した細胞シートを実験に用いた。
　培養液を除去した後、ＭＳＣシートに２０％ＥＧ／ＤＭＥＭ溶液を２ｍＬ添加し、室温で２５分放置し、平衡化させた。その後、溶液を除去した後、氷温で各ガラス化液を５００μＬ添加し、２０分放置後、液体窒素蒸気から１ｃｍの地点にシャーレを維持し、凍結した。このときの液体窒素蒸気からの距離で凍結スピードを制御することが可能であり、蒸気から１ｃｍの地点では約１０℃／ｍｉｎの凍結スピードが得られることが分かっている。その後、蒸気雰囲気下で１０分放置し、十分固化した後、液体窒素の浸漬し、凍結を完了させた。続いて解凍操作にうつる。解凍は、液体窒素から取り出したＭＳＣシート培養ディッシュに３７℃に温めた１Ｍスクロース／ＤＭＥＭを３ｍｌ加え、１分後に除去する。次に０．５Ｍスクロース／ＤＭＥＭ溶液を３ｍＬ加え、３分後に除去する。続いてＤＭＥＭを３ｍＬ加え、５分後に除去を２回くり返し、最後はＤＭＥＭを２ｍＬ添加して３７℃のインキュベーター中で培養にうつる。翌日、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイにより生存率を評価した。二重染色した蛍光顕微鏡写真において、ＣａｌｓｅｉｎＡＭで染色された緑の細胞が生細胞で、エチジウムホモダイマーで染色された赤色の細胞が死細胞である。
　図２０ａ、図２０ｂ、図２０ｃ、図２０ｄは、それぞれの組成のガラス化液を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１時間放置した後、解凍洗浄し、翌日に二重染色した蛍光顕微鏡写真である。黒い部分が多いのは、細胞の剥離が見られたためであるが、明らかにＣＯＯＨ－ＰＬＬやＤＭＧＡ－ＰＬＬの存在で緑色の生細胞の数が多く見られる。使用したガラス化液の組成は以下である：
・ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図２０ａ
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図２０ｂ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図２０ｃ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　Ｆｉｃｏｌｌ　１０％　：　図２０ｄ
　図２１ａ、図２１ｂ、図２１ｃ、図２１ｄは、それぞれの組成のガラス化液を使用して、ＭＳＣシートを、－８０℃のフリーザー中で１日放置した後、解凍洗浄し、翌日に二重染色した蛍光顕微鏡写真である。この場合、ＤＭＧＡ－ＰＬＬとフィコールの組み合わせで有意に緑色の細胞数が多い結果となった。使用したガラス化液の組成は以下である：
・ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図２１ａ
・ＣＯＯＨ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図２１ｂ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ　２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ　：　図２１ｃ
・ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ，　ＥＧ６Ｍ，　Ｓｕ０．５Ｍ，　Ｆｉｃｏｌｌ　１０％　：　図２１ｄ
　表２にこれらの定量結果として、各ガラス化液で－８０℃で放置した後のＭＳＣ生存率を示す。表２に記載されているように、表１と同様の傾向を示す結果であり、ＥＧ６Ｍ、ＤＭＧＡ－ＰＬＬ２５ｍＭ、スクロース０．５Ｍ、フィコール１０％のガラス化液では、－８０℃においてもガラス状態がある程度維持でき、細胞の生存率を高めることが可能であった。このことは、液体窒素による凍結保存を行わなくても、ＭＳＣシートを始めとした再生医療用細胞構造体を－１３０℃などの市販の高性能電気冷凍庫によって凍結保存できることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　本発明によれば、優れたガラス化能を有する動物細胞凍結保存液を得ることができる。本発明は産業上有用な発明である。

Claims (17)

  1. 　以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物と、
    　（ｄ）エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子とを含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤：
    　（ａ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；
    　（ｂ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；　又は
    　（ｃ）　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、次の式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ただし、上記の式中、
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基であり；
    　Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基であり；
    　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基である）
    で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
  2. 　式Ｉで表される化合物が、次の式ＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ただし、上記の式中、
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１～Ｃ６のアルカン－ジイル基である）
    で表される化合物である、請求項１に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
  3. 　両性高分子化合物において、ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合が、５０％～７５％の範囲にある、請求項１又は請求項２に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
  4. 　ε－ポリ－Ｌ－リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物が、
    　ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ａに対する、
    　ε－ポリ－Ｌ－リジンの側鎖のアミノ基のうち、ブチル無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ｂの比率Ｂ／Ａが、
    　２／３０～４０／３０の範囲にある、請求項１～３のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
  5. 　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子の分子量が、１０，０００～１，０００，０００の範囲にある、請求項１～４のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
  7. 　請求項１～５のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有し、
    　エチレングリコール又はプロピレングリコールを、３～８Ｍの濃度で含有する、生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
  8. 　さらに、スクロースを、０．１～１Ｍの濃度で含有する、請求項７に記載の動物細胞凍結保存液。
  9. 　（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された両性高分子化合物を、２～４０重量％で含有し、
    　エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子を、１～３０重量％で含有する、請求項６～８のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
  10. 　動物細胞凍結保存液のガラス転移点が、－１３５℃～－８０℃である、請求項６～９のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
  11. 　請求項６～１０のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、
    　動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、
    を含む、動物細胞凍結保存方法。
  12. 　動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、
    　凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、
    を含む、請求項１１に記載の動物細胞凍結保存方法。
  13. 　動物細胞を、降温して凍結する工程が、
    　動物細胞を、降温してガラス化状態で凍結する工程、である、請求項１１～１２のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
  14. 　動物細胞を、昇温して解凍する工程が、
    　動物細胞を、昇温して再結晶化することなく解凍する工程、である、請求項１２～１３のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
  15. 　降温して凍結する工程が、
    　降温速度５℃／分～５０℃／分で降温して凍結する工程、である、請求項１１～１４のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
  16. 　昇温して解凍する工程が、
    　昇温速度５℃／分～１００℃／分で昇温して解凍する工程、である、請求項１２～１５のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
  17. 　動物細胞を、降温して凍結する工程の後で、
    　凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程の前に、
    　凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、－１９６℃～－７５℃で保存する工程、
    を含む、請求項１２～１６のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
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