JPWO2020149394A1

JPWO2020149394A1 - 細胞凍結保存液

Info

Publication number: JPWO2020149394A1
Application number: JP2020566496A
Authority: JP
Inventors: 憲司河野; 茂範岡
Original assignee: Nagase and Co Ltd
Current assignee: Nagase and Co Ltd
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2021-11-25
Also published as: TW202043452A; EP3913046A4; US20220117221A1; EP3913046A1; WO2020149394A1

Abstract

細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちの少ない細胞凍結保存液の提供を目的とする。本発明は、１．０〜２５．０ｖ／ｖ％の細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）、１００〜１０００ｍＭの糖類（ｂ）、および合計０．５〜１０．０ｗ／ｖ％のフィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を含む、細胞凍結保存液である。

Description

本発明は、細胞凍結保存液に関する。

培養細胞は、継代を繰り返すことによって、細胞変質、遺伝的変異および雑菌汚染を生じる可能性があることから、長期間、細胞を安定的に利用するために、培養細胞を凍結保存しておくことが行われている。例えば、細胞を培地や血清などにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセリンなどを加えた保存液に懸濁し、これをクライオバイアルに充填し、速度制御フリーザー等で制御的に温度を下げて細胞を凍結し、液体窒素中に保存することが行われている。

この細胞凍結のための保存液については、これまで、その用途に応じて、種々の保存液が開発されている。保存液に使用される成分の一つであるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）については、培養細胞の分化を誘導するために使用される事例や、凍結保存に用いることにより細胞の分化形質が変化してしまう可能性についての報告等もある。このため、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用しない保存液が開発されている（特許文献１）。

ところで、これまでの細胞凍結保存液においては、保存細胞に与える影響や保存効果の高さの観点から開発が行われていたことから、その操作性については未だ不十分なものが多い。例えば、泡立ちやすい細胞凍結保存液では、懸濁操作の際に生じた泡がはじけて、細胞へダメージを与えることやコンタミネーションの原因となることが危惧される。したがって、このような細胞保存液を使用する際には、非常に慎重な操作が必要となり、操作性が低下してしまうという問題がある。

特開２０１０−２７３５４９号公報

したがって、本発明の目的は、上記で説明した事情を鑑み、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちの少ない細胞凍結保存液の提供にある。

また、本発明の他の目的は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を必須の成分としない細胞凍結保存液の提供にある。

本発明者らは、上記目的のため鋭意検討を行った結果、細胞凍結保存液を調製するのに、１．０〜２５．０ｖ／ｖ％の細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）、１００〜１０００ｍＭの糖類（ｂ）、および合計０．５〜１０．０ｗ／ｖ％のフィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を主な成分として用いることによって、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちの少ない細胞凍結保存液が得られることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下に関する。

（１）１．０〜２５．０ｖ／ｖ％の細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）、１００〜１０００ｍＭの糖類（ｂ）、および合計０．５〜１０．０ｗ／ｖ％のフィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を含む、細胞凍結保存液。
（２）基礎溶液が、緩衝液、または基礎培地である、前記（１）に記載の細胞凍結保存液。
（３）細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）が、エチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種である、前記（１）または（２）に記載の細胞凍結保存液。
（４）細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）として、エチレングリコールのみを含む、前記（３）に記載の細胞凍結保存液。
（５）糖類（ｂ）が、オリゴ糖である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞凍結保存液。
（６）糖類（ｂ）が、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびマルトトリオースからなる群より選択された少なくとも１種である、前記（５）に記載の細胞凍結保存液。
（７）さらに、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞凍結保存液。

また、本発明は以下にも関する。

（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞凍結保存液を使用することを特徴とする、細胞の緩慢凍結方法。

本発明によれば、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちの少ない細胞凍結保存液を提供することができる。また、この細胞凍結保存液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を必須の成分としていないことから、予期しない細胞の分化が誘導される危険性が低く、安全に使用することができる。

図１は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図２は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図３は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図４は、各細胞凍結保存液のＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞）に対する保存効果を示すグラフである。図５は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞またはヒト骨髄由来間葉系幹細胞に対する保存効果を示すグラフである。図６は、各細胞凍結保存液の泡切れ試験における泡の残存状態を示す代表的な写真である。図７は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図８は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図９は、各細胞凍結保存液の、２種のヒト骨髄由来間葉系幹細胞またはヒト脂肪組織由来幹細胞に対する保存効果を示すグラフである。図１０は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図１１は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞または骨髄由来間葉系幹細胞に対する保存効果を示すグラフである。図１２は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。図１３は、各細胞凍結保存液の正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対する保存効果を示すグラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。

［細胞凍結保存液］
本発明の細胞凍結保存液は、１．０〜２５．０ｖ／ｖ％の細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）、１００〜１０００ｍＭの糖類（ｂ）、および合計０．５〜１０．０ｗ／ｖ％のフィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を含む。本発明の細胞凍結保存液は、このような組成を有しており、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちが少ない。

＜細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）＞
本発明において、細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）は、細胞膜を透過可能な多価アルコール類であり、基本的に低分子量の多価アルコール類である。本発明に使用される細胞膜透過性多価アルコール類としては、特に制限はないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ブチレングリコール、イソプレングリコール、ジプロピレングリコールおよびグリセリンが好ましく、エチレングリコールおよびプロピレングリコールがより好ましく、プロピレングリコールが特に好ましい。これらの細胞膜透過性多価アルコール類は、単独でまたは二種以上組み合わせて使用できる。

本発明の細胞凍結保存液において、細胞膜透過性多価アルコール類は、単独でまたは二種以上組み合わせて使用できるが、単独で使用することが好ましい。そこで、本発明の細胞凍結保存液は、細胞膜透過性多価アルコール類として、プロピレングリコールのみを含むことが好ましく、また、エチレングリコールのみを含むことも好ましい。

本発明の細胞凍結保存液における細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）の含有量は、１．０〜２５．０ｖ／ｖ％である。より好ましい細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）の含有量は、２．０〜２０．０ｖ／ｖ％であり、さらに好ましい含有量は、２．５〜１７．５ｖ／ｖ％であり、さらには５．０〜１５．０ｖ／ｖ％であり、特に好ましい含有量は、８．０〜１２．０ｖ／ｖ％である。

＜糖類（ｂ）＞
本発明において、糖類（ｂ）は、単糖およびオリゴ糖ならびにこれらの誘導体を意味する。ここで、オリゴ糖は、単糖が２分子から１０分子結合したオリゴマーを指し、具体的には、二糖、三糖、四糖、五糖、七糖等が挙げられる。単糖としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース等が挙げられ、オリゴ糖としては、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、ラクトース等の二糖、マルトトリオース等の三糖、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘプタオース等が挙げられる。本発明に使用される糖類としては、オリゴ糖が好ましく、二糖および三糖がより好ましく、これらのなかでもトレハロース、スクロース、ラクトース、およびマルトトリオースが好ましく、トレハロース、スクロース、およびマルトトリオースがより好ましく、トレハロースおよびスクロースがさらにより好ましく、トレハロースが特に好ましい。なお、これらの糖類は、単独でまたは二種以上組み合わせて使用できる。

本発明の細胞凍結保存液において、糖類は、単独でまたは二種以上組み合わせて使用できるが、単独で使用することが好ましい。そこで、本発明の細胞凍結保存液は、糖類として、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびマルトトリオースからなる群より選択された１種のみを含むことが好ましく、トレハロース、スクロース、およびマルトトリオースからなる群より選択された１種のみを含むことが好ましく、トレハロースおよびスクロースからなる群より選択された１種のみを含むことがさらにより好ましく、トレハロースのみを含むことが特に好ましい。

本発明の細胞凍結保存液における糖類（ｂ）の含有量は、１００〜１０００ｍＭである。より好ましい糖類（ｂ）の含有量は、１００〜６００ｍＭであり、さらに好ましい含有量は、１００〜４００ｍＭであり、さらに好ましい含有量は、１００〜３００ｍＭであり、特に好ましい含有量は、２００〜３００ｍＭである。

＜フィコールおよび／またはポリエチレングリコール（ｃ）＞
本発明の細胞凍結保存液は、フィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を含む。フィコールおよびポリエチレングリコールは、それぞれ単独でまたは組み合わせて使用できる。本発明において、フィコールおよび／またはポリエチレングリコールは、上記細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）および糖類（ｂ）と組み合わされて本発明の細胞凍結保存液を構成するが、このような細胞凍結保存液は、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちが少ない細胞凍結保存液である。

本発明の細胞凍結保存液は、フィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を含むが、より確実に、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちが少ない細胞凍結保存液を得るために、これら以外の細胞膜非透過性高分子は含まないことが好ましい。ここで、細胞膜非透過性高分子とは、細胞膜を透過しない高分子をいい、例えば、アルブミン（血清アルブミン等）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等が含まれ、本発明における糖類（ｂ）、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド等は含まれない。そこで、本発明の細胞凍結保存液は、アルブミン（血清アルブミン等）を含まないことがより好ましく、アルブミン（血清アルブミン等）およびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含まないことがさらに好ましく、フィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）以外の細胞膜非透過性高分子を一切含まない（細胞膜非透過性高分子として、フィコールおよび／またはポリエチレングリコールのみを含む）ことが特に好ましい。とりわけ、本発明の細胞凍結保存液は、細胞膜非透過性高分子として、ポリエチレングリコールのみを含むことが好ましい。

フィコール（ポリスクロース）は、ショ糖から作られた側鎖に富む、中性、親水性の合成多糖類である（なお、フィコールはＧＥヘルスケア社の登録商標）。本発明に使用されるフィコールとしては、平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のものが好ましく、３００，０００〜５５０，０００のものが特に好ましい。ここで、平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のフィコールの具体的な製品としては、ＧＥヘルスケア社のＦｉｃｏｌｌＰＭ７０（平均分子量６０，０００〜８０，０００）、ＦｉｃｏｌｌＰＭ４００（平均分子量３００，０００〜５００，０００）等が例示でき、平均分子量が３００，０００〜５５０，０００のフィコールの具体的な製品としては、ＧＥヘルスケア社のＦｉｃｏｌｌＰＭ４００等が例示できる。なお、フィコールはＧＥヘルスケア社の登録商標であるが、本発明におけるフィコールには、これと同一の構成分子を有するポリマーも含まれ、具体的な製品としては、富士フイルム和光純薬社のポリスクロース４００（平均分子量３５０，０００〜５５０，０００）等が例示できる。

ポリエチレングリコールは、エチレングリコールが重合した構造をもつ高分子化合物である。本発明に使用されるポリエチレングリコールとしては、平均分子量が２００〜５０，０００のものが好ましく、特に、６，０００〜３０，０００のものが好ましい。ここで、平均分子量が２００〜５０，０００のポリエチレングリコールの具体的な製品としては、ナカライテスク社のポリエチレングリコール＃２００、＃３００、＃４００、＃６００、＃１，０００、＃１，５００、＃１，５４０、＃２，０００、＃４，０００、＃６，０００、＃２０，０００等が例示でき、平均分子量が６，０００〜３０，０００のポリエチレングリコールの具体的な製品としては、ナカライテスク社の＃６，０００、＃２０，０００等が例示できる。

本発明の細胞凍結保存液におけるフィコールおよび／またはポリエチレングリコール（ｃ）の含有量は、合計０．５〜１０．０ｗ／ｖ％である。好ましい含有量の下限は、合計０．５ｗ／ｖ％、合計１．０ｗ／ｖ％、合計１．５ｗ／ｖ％、合計２．０ｗ／ｖ％、合計２．５ｗ／ｖ％、合計４．０ｗ／ｖ％、合計４．５ｗ／ｖ％であり、好ましい含有量の上限は、合計１０．０ｗ／ｖ％、合計９．０ｗ／ｖ％、合計８．０ｗ／ｖ％、合計７．５ｗ／ｖ％、合計６．０ｗ／ｖ％、合計５．５ｗ／ｖ％である。範囲として、好ましい含有量は、合計１．０〜１０．０ｗ／ｖ％である。より好ましい含有量は、合計２．０〜１０．０ｗ／ｖ％である。さらに好ましい含有量は、合計２．５〜７．５ｗ／ｖ％である。さらにより好ましい含有量は、合計４．０〜６．０ｗ／ｖ％であり、特に好ましい含有量は、合計４．５〜５．５ｗ／ｖ％である。また、合計１．５〜６．０ｗ／ｖ％、合計２．０〜６．０ｗ／ｖ％、合計２．５〜６．０ｗ／ｖ％も好ましい。

＜他の成分＞
本発明の細胞凍結保存液には、本発明の効果を損なわない範囲で他の成分を配合することで、本発明の効果を高めたり、さらなる効果を付与したりすることができる。かかる成分としては、例えば、上記成分以外の細胞凍結保護剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、賦形剤、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、保湿剤、防腐剤等が挙げられる。なかでも、本発明の細胞凍結保存液には、抗酸化剤を配合することが好ましい。なお、本発明の細胞凍結保存液において、これら他の成分はそれぞれ単独でまたは二種以上を組み合わせて配合してもよい。

これらのうち、抗酸化剤は、本発明の細胞凍結保存液に配合した場合、細胞保存効果がさらに向上することから、本発明の細胞凍結保存液に好ましく配合される。とくに、抗酸化剤は、本発明の細胞凍結保存液に配合した場合、多能性幹細胞、とりわけ骨髄由来間葉系幹細胞等の間葉系幹細胞に対する細胞保存効果がさらに向上することから、本発明の細胞凍結保存液に好ましく配合される。抗酸化剤としては、例えば、グルタチオン、α−トコフェリルリン酸ナトリウム（ＴＰＮａ：なお、ＴＰＮａは昭和電工株式会社の登録商標）、アスコルビン酸、これらの誘導体等が挙げられる。アスコルビン酸誘導体の具体例としては、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸セスキマグネシウム水和物、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸エステル三ナトリウム等が挙げられる。これらのうち、好ましくはアスコルビン酸またはアスコルビン酸誘導体であり、さらに好ましくはＬ−アスコルビン酸２−グルコシドである。

なお、本発明の細胞凍結保存液において、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は必須の成分ではない。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、培養細胞の分化を誘導するために使用されたり、凍結保存に用いることにより細胞の分化形質が変化してしまう可能性が指摘されていることから、本発明の細胞凍結保存液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まないことが好ましい。

＜基礎溶液＞
本発明の細胞凍結保存液は、上記成分を基礎溶液に分散させてなる。この基礎溶液には、例えば、水系またはアルコール系の溶液を使用できるが、好ましくは水溶液を使用できる。水溶液としては、例えば、等張液、各種の緩衝液（緩衝効果のある等張液を含む）、または各種の細胞もしくは組織用の基礎培地を使用できる。等張液としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、ハンクス液等が挙げられる。緩衝液としては、例えば、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）等が挙げられ、さらには、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の緩衝効果のある生理食塩水が挙げられる。基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等が挙げられる。

本発明に使用される基礎溶液としては、緩衝液または基礎培地が好適に使用される。ここで、基礎培地とは、組成が明らかであって、由来不明の生体高分子（例えば、血清、あるいは成長因子、アルブミン、細胞外マトリックス等のタンパク質成分等）を含まない、アミノ酸、ビタミン、無機塩およびグルコース等の炭素源等からなる培地のことである。このような基礎溶液を使用することで、より確実に細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちが少ない細胞凍結保存液を得ることができる。なかでも、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が特に好ましく使用される。

＜ｐＨ＞
本発明の細胞凍結保存液のｐＨは、通常ｐＨ６．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．０〜７．５である。なお、このｐＨは、上記のｐＨ調整剤の使用により調整することができる。

［細胞の凍結保存方法］
本発明の細胞凍結保存液は、各種の凍結保存方法により保存対象となる細胞を凍結保存することができる。本発明の細胞凍結保存液が使用できる凍結保存方法には、特に制限はなく、各種の凍結保存方法により保存対象となる細胞を凍結保存することができるが、特に緩慢凍結法に好適に使用できる。緩慢凍結法による細胞の凍結保存方法は、例えば、保存対象となる細胞を、本発明の細胞凍結保存液に懸濁させ、その後、緩慢に冷却して細胞を凍結し、この凍結細胞を適切に保存（例えば、超低温フリーザー中、液体窒素中等に保存）することで実施できる。

そこで、本発明は、本発明の細胞凍結保存液を使用することを特徴とする、細胞の緩慢凍結方法にも関する。

具体的には、本発明の細胞の緩慢凍結方法は、例えば、保存対象となる細胞を本発明の細胞凍結保存液に懸濁する工程と、細胞を懸濁した細胞凍結保存液を緩慢に冷却して細胞を凍結する工程とを含む、細胞の緩慢凍結方法である。

本発明の細胞の緩慢凍結方法は、本発明の細胞凍結保存液を使用することから、細胞を細胞凍結保存液に懸濁させる際に泡立ちを気にしなくてもよいため操作性に優れ、また緩慢凍結法であることから、例えば、ガラス化法で必要となる液体窒素や特別な器具などを準備する必要がなく、実施が簡便である。さらに、本発明の細胞の凍結保存方法は、高い保存効率で細胞を保存することができる。

＜保存対象となる細胞＞
保存対象となる細胞としては、特に制限はなく、一般に凍結保存される細胞であれば本発明の細胞凍結保存液によって保存可能である。例えば、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞等、いずれの形式のものであっても保存可能であり、さらに、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の各種の幹細胞も保存可能である。また、本発明の細胞凍結保存液は、これら細胞だけでなく、例えば、各種の組織や臓器も保存可能である。

細胞の由来は特に制限されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞であってよく、好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳動物細胞、ニワトリ、ダチョウ等の鳥類、ワニ等の爬虫類、カエル等の両生類、ゼブラフィッシュ、メダカ等の魚類を含む脊椎動物の細胞が挙げられ、また、蚕、蛾、ショウジョウバエ等の昆虫を含む非脊椎動物の細胞が挙げられる。

これらのうち、本発明の細胞凍結保存液は、間葉系細胞および間葉系幹細胞に好適に使用される。間葉系細胞および間葉系幹細胞としては、例えば、骨細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、筋細胞、心筋細胞、腱細胞、脂肪細胞、毛乳頭細胞、歯髄細胞およびこれらの幹細胞が挙げられる。特に、本発明の細胞凍結保存液は、骨髄由来間葉系幹細胞および脂肪組織由来幹細胞に好適に使用できる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［実施例１］細胞の保存効果試験
１．材料
＜細胞凍結保存液＞
下記の各成分および基礎溶液を用いて、各種組成の細胞凍結保存液を調製した。また、細胞凍結保存液は、それぞれ０．２２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製）でろ過滅菌して試験に用いた。

（各成分）
細胞凍結保存液の各成分は、以下のものを使用した。
・プロピレングリコール：ナカライテスク製
・トレハロース：林原製
・スクロース：ナカライテスク製
・ラクトース：ナカライテスク製
・マルトトリオース：林原製
・フィコール：ナカライテスク製
・ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃２００、ＰＥＧ＃６００、ＰＥＧ＃２０００、ＰＥＧ＃６０００、ＰＥＧ＃２００００：ナカライテスク製
・ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）：ＳＩＧＭＡ製
・プルラン：林原製
・ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）：ナカライテスク製
・Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド：林原製

（基礎溶液）
基礎溶液は、以下のものを使用した。
・ＤＭＥＭ：ナカライテスク製
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：ナカライテスク製
なお、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、最終濃度が１×、０．５×、０．２×となるように細胞凍結保存液を調製した。

＜細胞＞
実験には、以下の細胞を使用した。
・正常ヒト皮膚繊維芽細胞（クラボウから入手した）
・ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞）（ＥＣＡＣＣから入手した）
・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａから入手した）

２．方法
細胞の保存効果は、各細胞凍結保存液を用いて保存対象の細胞を凍結保存し、解凍後の細胞の生存率を測定することによって評価した。具体的には、まず、各細胞凍結保存液に、保存対象の細胞を、細胞濃度が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブに１ｍｌずつ分注した上、これら細胞を−８０℃で緩慢凍結させた。このように凍結させた細胞を、−８０℃で所定の期間保存した後、３７℃にて解凍した。解凍した細胞を、所定の密度で播種し、細胞培養用培地で一晩培養した。そして、それぞれの生細胞数を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製）を使用して、添付のプロトコルに従い測定した。なお、本測定法では、生存率は、生細胞数に比例する蛍光強度によって示される。

３．結果
（１）試験１
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。なお、以下の組成において、単位「％」は、プロピレングリコールの場合「ｖ／ｖ％」であり、それ以外の成分の場合「ｗ／ｖ％」である（以下、実施例１および２の試験において同様）。

試験１では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において３週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝２）。ここで、解凍後の細胞は、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。また、参考例として、市販の細胞凍結保存液であるＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＤＭＳＯＦｒｅｅＧＭＰｇｒａｄｅ（日本全薬工業製、参考例１）についても試験した。結果を、図１に示す。

図１に示すように、１０％プロピレングリコールおよび２５０ｍＭトレハロースの他に、５％のフィコールまたは５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ＃２００、ＰＥＧ＃６００、ＰＥＧ＃２０００、ＰＥＧ＃６０００、ＰＥＧ＃２００００）を含む細胞凍結保存液は、５％のフィコールまたは５％のポリエチレングリコールに代えて５％のヒドロキシエチルスターチ、５％のプルラン、または５％のヒト血清アルブミンを含む細胞凍結保存液と比較して高い生存率を示し、また市販の細胞凍結保存液と比較しても高い生存率を示した。

（２）試験２
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験２では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において１０日間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を、図２に示す。

図２に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、および５％のフィコールを含む細胞凍結保存液と同様、２５０ｍＭトレハロースに代えて２５０ｍＭスクロースを含む細胞凍結保存液も高い生存率を示した。

（３）試験３
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験３では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において２週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を、図３に示す。

図３に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、および５％のフィコールを含む細胞凍結保存液と同様、トレハロースの濃度が１００ｍＭ、２００ｍＭ、または３００ｍＭである細胞凍結保存液も高い生存率を示した。

（４）試験４
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験４では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞）を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において２週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。また、試験４では、参考例として、市販の細胞凍結保存液であるＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＤＭＳＯＦｒｅｅＧＭＰｇｒａｄｅ（日本全薬工業製、参考例１）についても試験した。結果を、図４に示す。

図４に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、および５％のフィコールを含む細胞凍結保存液は、基礎溶液としてＰＢＳ（１×、０．５×、０．２×の濃度）を使用した場合においても、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞）に対して、市販の細胞凍結保存液と比較して高い生存率を示した。
（５）試験５
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験５では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞またはヒト骨髄由来間葉系幹細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において２週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝１）。ここで、解凍後の細胞は、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を、図５に示す。図５では、各細胞に対する保存効果を、保存液１９の測定値（蛍光強度）を１００％としたときの相対値として示す。

図５に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、および５％のフィコールの他、さらに５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む細胞凍結保存液は、５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含まない細胞凍結保存液と比較して、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞において高い生存率を示した。

［実施例２］細胞凍結保存液の泡切れ試験
１．材料
＜細胞凍結保存液＞
実施例１と同様にして、各種組成の細胞凍結保存液を調製した。

２．方法
細胞凍結保存液の泡切れは、各細胞凍結保存液を強制的に泡立たせて、その泡が消えるまでの時間を測定することによって評価した。具体的には、まず、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を懸濁した各細胞凍結保存液を２ｍＬの遠心チューブ（エッペンドルフ製）中に調製した。次いで、２００μＬのチップを装填したマイクロピペット（２０−２００）を用いて、２００μＬの気泡を各細胞凍結保存液中で発生させた。遠心チューブを室温に静置し、経時的に遠心チューブ中の細胞凍結保存液に泡が残存しているか否かを調べた。

３．結果
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

また、参考例として、市販の細胞凍結保存液であるＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＤＭＳＯＦｒｅｅＧＭＰｇｒａｄｅ（日本全薬工業製、参考例１）、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（日本全薬工業製、参考例２）、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１ｐｌｕｓ（日本全薬工業製、参考例３）についても試験した。結果を、表７および図６に示す。表７は、各細胞凍結保存液について、それぞれ４本の遠心チューブを用いて上記の方法で泡切れ試験を行い、各時間において泡が残存していた遠心チューブの数を示す表である。図６は、気泡発生操作後、１時間、３時間、２４時間の時点での、各細胞凍結保存液における泡の残存状態を示す代表的な写真である。なお、この泡切れ試験は２０回繰り返したが全て同様の結果であった。

表７および図６に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、５％のフィコールまたはＰＥＧ＃２００００、および５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む細胞凍結保存液は、市販の細胞凍結保存液と比較して非常に泡切れがよいことが示された。また、５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含まない保存液２１も、気泡発生操作後１０秒以内に遠心チューブ中の全ての泡が消失した（ｎ＝２０）。

また、保存液２２において、トレハロースに代えて、スクロース、ラクトースまたはマルトトリオースを使用した保存液について試験したが、いずれも、気泡発生操作後約１０秒以内には遠心チューブ中の全ての泡が消失した。また、保存液２２において、フィコールに代えて、ヒト血清アルブミンを使用した保存液について試験したところ、気泡発生操作後２４時間後にも、遠心チューブ中に泡が残存していた。

［実施例３］細胞の保存効果試験２
１．材料
＜細胞凍結保存液＞
下記の各成分および基礎溶液を用いて、各種組成の細胞凍結保存液を調製した。また、細胞凍結保存液は、それぞれ０．２２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製）でろ過滅菌して試験に用いた。

（各成分）
細胞凍結保存液の各成分は、以下のものを使用した。
・プロピレングリコール：ナカライテスク製
・エチレングリコール：ナカライテスク製
・トレハロース：林原製
・スクロース：ナカライテスク製
・マルトトリオース：林原製
・ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃２００００：ナカライテスク製
・Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド：林原製
なお、基礎溶液は、いずれの細胞凍結保存液についても、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ナカライテスク製）を、最終濃度が０．５×となるように調整して使用した。

＜細胞＞
実験には、以下の細胞を使用した。
・正常ヒト皮膚繊維芽細胞（クラボウから入手した）
・ヒト脂肪組織由来幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手した）
・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞１（Ｌｏｎｚａから入手した）
・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手した）

２．方法
細胞の保存効果は、各細胞凍結保存液を用いて保存対象の細胞を凍結保存し、解凍後の細胞の生存率を測定することによって評価した。具体的には、まず、各細胞凍結保存液に、保存対象の細胞を、細胞濃度が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブに０．２ｍｌ（試験８）または１ｍｌ（試験６〜７および試験９〜１１）ずつ分注した上、これら細胞を−８０℃で緩慢凍結させた。このように凍結させた細胞を、−８０℃で所定の期間保存した後、３７℃にて解凍した。そして、それぞれの生細胞数について、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイもしくはトリパンブルー染色法によって測定した。ここで、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイは、解凍した細胞を、所定の密度で播種し、細胞培養用培地で一晩培養した後、実施例１と同様にして行った。トリパンブルー染色法では、解凍した細胞について、トリパンブルーにより染色を行ったのち、血球計算盤上で全細胞数および生細胞数を測定し、全細胞に対する生細胞の割合から生存率を算出した。

３．結果
（１）試験６
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。なお、以下の組成において、単位「％」は、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの場合「ｖ／ｖ％」であり、それ以外の成分の場合「ｗ／ｖ％」である（以下、実施例３の試験において同様）。

試験６では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において２週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を図７に示す。

図７に示すように、プロピレングリコール、トレハロース、ポリエチレングリコールを含む細胞凍結保存液において、プロピレングリコールの濃度を５％、１０％、１５％と変化させたとき、いずれの濃度でも高い生存率を示したが、とくに１０％の濃度で高い生存率を示した。

（２）試験７
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験７では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において２週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を、図８に示す。

図８に示すように、プロピレングリコール、トレハロース、ポリエチレングリコールを含む細胞凍結保存液において、ポリエチレングリコールの濃度を２．５％、５．０％、７．５％と変化させたとき、いずれの濃度であっても高い生存率を示した。

（３）試験８
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験８では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞１（Ｌｏｎｚａから入手）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手）、ヒト脂肪組織由来幹細胞、または正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において１〜５日間保存し（骨髄由来間葉系幹細胞は２日、脂肪組織由来幹細胞は一晩、皮膚繊維芽細胞は５日）、保存後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞１（Ｌｏｎｚａから入手）を保存対象としたときの結果を図９Ａにし、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手）を保存対象としたときの結果を図９Ｂに示し、ヒト脂肪組織由来幹細胞を保存対象としたときの結果を図９Ｃに示す。また、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象としたときの結果を図１０に示す。なお、試験８では、参考例として、市販の細胞凍結保存液であるＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＧＭＰｇｒａｄｅ（ＤＭＳＯ含有、日本全薬工業製、参考例４）についても試験した（正常ヒト皮膚繊維芽細胞には試験せず）。

図９に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、および５％のポリエチレングリコールを含む細胞凍結保存液は、いずれの幹細胞に対しても、市販の細胞凍結保存液と比較して同等かそれ以上の高い生存率を示した。さらに、プロピレングリコールに代えてエチレングリコールを含む細胞凍結保存液は、プロピレングリコールを含む細胞凍結保存液と同等かそれ以上の高い生存率を示し、また、図１０に示すように、正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対しても、プロピレングリコールを含む細胞凍結保存液よりも高い生存率を示した。

（４）試験９
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験９では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞または骨髄由来間葉系幹細胞１（Ｌｏｎｚａから入手）を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において１０日間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞についてトリパンブルー染色法によって生細胞数を測定し、生存率を算出した。正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象としたときの結果を図１１Ａに示し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞１を保存対象としたときの結果を図１１Ｂに示す。また、試験９では、参考例として、市販の細胞凍結保存液であるＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＤＭＳＯＦｒｅｅＧＭＰｇｒａｄｅ（日本全薬工業製、参考例１）、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（日本全薬工業製、参考例２）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＧＭＰｇｒａｄｅ（日本全薬工業製、参考例４）についても試験した（正常ヒト皮膚繊維芽細胞では参考例２のみ）。

図１１に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、５％のポリエチレングリコール、および５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む細胞凍結保存液は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞１のいずれに対しても、市販の細胞凍結保存液と比較して同等かそれ以上の高い生存率を示した。

（５）試験１０
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験１０では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において１週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝４）。ここで、解凍後の細胞は、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を、図１２に示す。なお、試験１０では、参考例として、市販の細胞凍結保存液であるＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）ＧＭＰｇｒａｄｅ（ＤＭＳＯ含有、日本全薬工業製、参考例４）についても試験した。

図１２に示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭスクロース、および５％のポリエチレングリコールを含む細胞凍結保存液は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞に対して、市販の細胞凍結保存液と比較して同等かそれ以上の高い生存率を示した。また、スクロースに代えてマルトトリオースを含む細胞凍結保存液も、同様に高い生存率を示した。

（６）試験１１
以下の組成の細胞凍結保存液を試験した。

試験１１では、正常ヒト皮膚繊維芽細胞を保存対象とし、各種細胞凍結保存液において１週間保存した後の細胞の生存率を測定した（ｎ＝３）。ここで、解凍後の細胞は、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）の細胞密度で播種し、これについてａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＲｅａｇｅｎｔを使用して生細胞数を測定した。結果を、図１３ＡおよびＢに示す。図１３ＡおよびＢでは、各細胞凍結保存液の細胞に対する保存効果を、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドを含まない細胞凍結保存液（保存液３７、３９）の測定値（蛍光強度）を１００％としたときの相対値として示す。

図１３ＡおよびＢに示すように、１０％プロピレングリコール、２５０ｍＭトレハロース、および５％のポリエチレングリコールの他、さらに５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む細胞凍結保存液は、５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含まない細胞凍結保存液と比較して、高い生存率を示した。また、プロピレングリコールに代えてエチレングリコールを含む細胞凍結保存液も、５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む細胞凍結保存液の方が、５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドを含まない細胞凍結保存液よりも高い生存率を示した。

（７）泡切れ試験
保存液２５〜２７、２９〜４０について、各保存液に細胞を懸濁させなかった以外は、実施例２と同様にして泡切れ試験を実施したが、いずれの保存液も、気泡発生操作後約１０秒以内には遠心チューブ中の全ての泡が消失した。

本発明によれば、細胞の保存効果に優れ、かつ泡立ちの少ない細胞凍結保存液を提供することができる。このような細胞凍結保存液は、医療用幹細胞や分化細胞（細胞製剤等を含む）などの保存剤、また基礎研究用試薬として有用に使用できる。

Claims

１．０〜２５．０ｖ／ｖ％の細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）、１００〜１０００ｍＭの糖類（ｂ）、および合計０．５〜１０．０ｗ／ｖ％のフィコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種（ｃ）を含む、細胞凍結保存液。
基礎溶液が、緩衝液、または基礎培地である、請求項１記載の細胞凍結保存液。
細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）が、エチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項１または２記載の細胞凍結保存液。
細胞膜透過性多価アルコール類（ａ）として、エチレングリコールのみを含む、請求項３記載の細胞凍結保存液。
糖類（ｂ）が、オリゴ糖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞凍結保存液。
糖類（ｂ）が、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびマルトトリオースからなる群より選択された少なくとも１種である、請求項４記載の細胞凍結保存液。
さらに、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞凍結保存液。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞凍結保存液を使用することを特徴とする、細胞の緩慢凍結方法。