JP2024048991A - 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法 - Google Patents
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Abstract
Description
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第1の容器を、2-プロパノールで満たされた第2の容器内に設置するするサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第2の容器を冷凍庫内に載置して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含み、
前記凍結ステップでは、前記サンプルを載置した前記冷凍庫内を、前記サンプルが超過冷却状態となる温度まで徐冷するとともに、当該温度で所定時間維持する、
細胞凍結方法としている。
<糖類を含む細胞凍結保存液>
実施例に係る細胞凍結保存液の特性を評価するために、主添加剤や副添加剤の種類が異なる様々な凍結保存液を用いた細胞懸濁液をサンプルとして作製し、そのサンプルを凍結させ、解凍後の細胞生存率を調べた。なお、凍結対象となる細胞組織としては、ヒト胎児由来腎細胞株(HEK293A)を培養して得たHEK293細胞を用いた。以下に、サンプルの作製手順と評価手順を例示する。
上述した手順により作製したサンプルを以下の手順で凍結させる。まず、第1の容器であるクライオチューブ(以下、「チューブ」と言うことがある。)に500μlのサンプルを入れ、次いで、サンプルが入ったチューブを、2-プロパノールで満たされた第2の容器である凍結保存容器内に設置し、その凍結保存容器(以下、「容器」と言うことがある。)を、後述する凍結方法によりサンプルを凍結させる。
細胞懸濁液を凍結させるための一般的な方法は、プログラムフリーザーの冷凍庫内にサンプルを載置し、冷凍庫内を室温から所定の降温速度(例えば、-1℃/min)で-80℃程度の極低温にまで冷却して凍結させる方法(以下、緩慢凍結法)がある。なお、-80℃の温度に設定した冷凍庫内にサンプルを投入する凍結方法もあるが、近年では、緩慢凍結法が主流になりつつある。
図1に示したように、細胞毒性のある添加剤を含まず食品由来の糖類であるフルクトオリゴ糖を添加剤とした細胞凍結保存液を用いるとともに、新規凍結法を採用することで、少なくとも70%に近い細胞生存率が得られることがわかった。次に、細胞生存率をさらに向上させるために、主添加剤であるフルクトオリゴ糖に、副添加剤として、オボアルブミン(OVA)、コンドロイチン硫酸、及びコラーゲンペプチドのいずれかを含む細胞凍結保存液を用いてサンプルを作製した。そして、上述したように、新規凍結方法によりサンプルを凍結させた上で-80℃の温度で1週間保管したのち、上記と同様の手順でサンプルを解凍する凍結解凍試験を行って、サンプルの細胞生存率を調べた。
実施例に係る細胞凍結保存液には、主添加剤としてフルクトオリゴ糖が含まれている。周知のごとく、フルクトオリゴ糖は、サッカロースのフルクトース残基にフルクトースがβ-1,2結合したオリゴ糖で、1-Kestose, Nystose、及び1-Fructofuranosyl-D-Nystoseの混合物である。フルクトオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖剤、難消化性及び難齲蝕性剤の研究に使用されている。
Claims (6)
- 生理食塩水であるD-PBSを溶媒とし、主添加剤と副添加剤とを含み、
前記主添加剤は、フルクトオリゴ糖であり、
前記副添加剤は、オボアルブミン、コンドロイチン硫酸、及びコラーゲンペプチドのいずれか一つである、
細胞凍結保存液。 - 請求項1に記載の細胞凍結保存液であって、前記生理食塩水の中に10wt%以上30wt%以下の割合で前記フルクトオリゴ糖が含まれるフルクトオリゴ糖溶液に前記副添加剤が添加されてなり、当該副添加剤が0.1vol%以上10vol%以下の割合で含まれている、細胞凍結保存液。
- 請求項2に記載の細胞凍結保存液であって、前記オボアルブミンが0.5vol%以上1.0vol%以下の割合で含まれている、細胞凍結保存液。
- 請求項2に記載の細胞凍結保存液であって、前記コンドロイチン硫酸が3.0vol%以上10.0vol%以下の割合で含まれている、細胞凍結保存液。
- 請求項2に記載の細胞凍結保存液であって、前記コラーゲンペプチドが5.0vol%以上10.0vol%以下の割合で含まれている、細胞凍結保存液。
- 請求項1~請求項5のいずれかに記載の細胞凍結保存液を用いて細胞を凍結させる方法であって、
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第1の容器を、2-プロパノールで満たされた第2の容器内に設置するするサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第2の容器を冷凍庫内に載置して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含み、
前記凍結ステップでは、前記サンプルを載置した前記冷凍庫内を、前記サンプルが超過冷却状態となる温度まで徐冷するとともに、当該温度で所定時間維持する、
細胞凍結方法。
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