TW202043452A - 細胞冷凍保存液 - Google Patents

Abstract

本發明的目的在於提供一種細胞冷凍保存液，其細胞的保存效果優異且起泡少。本發明是一種細胞冷凍保存液，其包含：1.0～25.0v/v%的細胞膜通透性多元醇類(a)；100～1000mM的糖類(b)；及，合計為0.5～10.0w/v%的選自由聚蔗糖及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)。

Description

細胞冷凍保存液

本發明關於一種細胞冷凍保存液。

培養細胞會由於重覆進行繼代而可能產生細胞變性、遺傳性變異及雜菌汙染的情況，所以為了要長時間且穩定地利用，目前實行有將培養細胞預先冷凍保存的方法。例如，已實行有下述方法：在保存液中使細胞懸浮後，將該液體填充於冷凍小管，並利用程式降溫儀等控制性地降低溫度來使細胞冷凍，然後保存於液態氮中，該保存液是在培養基或血清中等添加二甲基亞碸(DMSO)或甘油等而成。

有關這種用以冷凍細胞的保存液，截至目前為止，已依據各種用途而開發出各式各樣的保存液。針對被用於保存液中的成分之一的二甲基亞碸(DMSO)，已發現有下述情形：被用來用以誘導培養細胞的分化的事例、或用於冷凍保存時可能會對細胞的分化形態造成變化的報告等。因此，正在開發一種不使用二甲基亞碸(DMSO)之保存液(專利文獻1)。

但是，因為目前的細胞冷凍保存液是從對保存細胞造成的影響或保存效果好壞的觀點來進行開發，所以其操作性大多仍不充分。例如，在易於起泡的細胞冷凍保存液中，在懸浮操作時所生的泡沫會飛散，而會有對細胞造成損傷或成為污染的原因等的疑慮。從而，當使用這樣的細胞保存液時，需要非常慎重地操作，並且會有操作性降低這樣的問題。 [先前技術文獻] (專利文獻)

專利文獻1：日本特開2010-273549號公報。

[發明所欲解決的問題] 從而，有鑑於上述說明的事由，本發明的目的在於提供一種細胞冷凍保存液，其細胞的保存效果優異且起泡少。

又，本發明的其他目的在於，提供一種細胞冷凍保存液，其中，二甲基亞碸(DMSO)不為必要成分。 [解決問題的技術手段]

本發明人為了上述目的努力研究的結果，發現要調製細胞冷凍保存液時，藉由使用下述成分作為主要成分，可獲得一種細胞冷凍保存液，其細胞的保存效果優異且起泡少，進而完成本發明，該成分是：1.0～25.0v/v%的細胞膜通透性多元醇類(a)；100～1000mM的糖類(b)；及，合計為0.5～10.0w/v%的選自由聚蔗糖(Ficoll)及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)。

亦即，本發明關於以下技術。

(1) 一種細胞冷凍保存液，其包含：1.0～25.0v/v%的細胞膜通透性多元醇類(a)；100～1000mM的糖類(b)；及，合計為0.5～10.0w/v%的選自由聚蔗糖(Ficoll)及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)。 (2) 如前述(1)所述之細胞冷凍保存液，其中，基礎溶液為緩衝溶液或基礎培養基。 (3) 如前述(1)或(2)所述之細胞冷凍保存液，其中，細胞膜通透性多元醇類(a)為選自由乙二醇及丙二醇所組成之群組中的至少1種。 (4) 如前述(3)所述之細胞冷凍保存液，其中，作為細胞膜通透性多元醇類(a)，僅包含乙二醇。 (5) 如前述(1)～(4)中任一項所述之細胞冷凍保存液，其中，糖類(b)為寡糖。 (6) 如前述(5)所述之細胞冷凍保存液，其中，糖類(b)為選自由海藻糖、蔗糖、乳糖及麥芽三糖所組成之群組中的至少1種。 (7) 如前述(1)～(6)中任一項所述之細胞冷凍保存液，其中，進一步包含L-抗壞血酸2-葡萄糖苷。

又，本發明關於以下技術。

一種細胞的漸凍方法，該漸凍方法的特徵在於：使用前述(1)～(7)中任一項所述之細胞冷凍保存液。 [發明的效果]

根據本發明，能夠提供一種細胞冷凍保存液，其細胞的保存效果優異且起泡少。又，因為在該細胞冷凍保存液中二甲基亞碸(DMSO)不為必要成分，所以誘導出預期外的細胞分化的危險性較低，而能夠安全地使用。

以下，詳細地說明本發明。再者，本說明書中所使用的用語，若未特別說明，則解釋為該技術領域中通常所用的意義。

[細胞冷凍保存液] 本發明的細胞冷凍保存液，其包含：1.0～25.0v/v%的細胞膜通透性多元醇類(a)；100～1000mM的糖類(b)；及，合計為0.5～10.0w/v%的選自由聚蔗糖及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)。本發明的細胞冷凍保存液具有這樣的組成，因而細胞的保存效果優異且起泡少。

〈細胞膜通透性多元醇類(a)〉 本發明中，細胞膜通透性多元醇類(a)是一種能夠通過細胞膜的多元醇類，基本上是低分子量的多元醇類。作為本發明所使用的細胞膜通透性多元醇類，並無特別限制，較佳是乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、異戊二醇、二丙二醇及甘油，更佳是乙二醇及丙二醇，特佳是丙二醇。該等細胞膜通透性多元醇類，能夠單獨使用或組合兩種以上來使用。

在本發明的細胞冷凍保存液中，細胞膜通透性多元醇類能夠單獨使用或組合兩種以上來使用，但是較佳為單獨使用。因此，本發明的細胞冷凍保存液，較佳是僅包含丙二醇，並且僅包含乙二醇亦較佳。

本發明的細胞冷凍保存液中的細胞膜通透性多元醇類(a)的含量，為1.0～25.0v/v%。更佳的細胞膜通透性多元醇類(a)的含量是2.0～20.0v/v%，進一步較佳的含量是2.5～17.5v/v%，進一步更佳是5.0～15.0v/v%，特佳的含量是8.0～12.0v/v%。

〈糖類(b)〉 在本發明中，糖類(b)意指單糖和寡糖、及該等衍生物。此處，寡糖意指2分子～10分子的單糖連結而成的寡聚物，具體而言，可列舉：二糖、三糖、四糖、五糖、七糖等。作為單糖，可列舉：葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、甘露糖等；作為寡糖，可列舉：海藻糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、乳糖等的二糖；麥芽三糖等的三糖；麥芽四糖；麥芽五糖；麥芽七糖等。作為使用於本發明的糖類，較佳是寡糖，更佳是二糖及三糖，該等二糖及三糖之中，較佳是海藻糖、蔗糖、乳糖及麥芽三糖，更佳是海藻糖、蔗糖及麥芽三糖，進一步較佳是海藻糖及蔗糖，特佳是海藻糖。再者，該等糖類能夠單獨使用或組合兩種以上來使用。

在本發明的細胞冷凍保存液中，糖類能夠單獨使用或組合兩種以上來使用，但較佳是單獨使用。因此，本發明的細胞冷凍保存液，作為糖類，較佳是僅包含選自由海藻糖、蔗糖、乳糖及麥芽三糖所組成之群組中的1種，並且，較佳是僅包含選自由海藻糖、蔗糖及麥芽三糖所組成之群組中的1種，更佳是僅包含選自由海藻糖、蔗糖所組成之群組中的1種，特佳是僅包含海藻糖。

本發明的細胞冷凍保存液中的糖類(b)的含量，為100～1000mM。更佳的糖類(b)含量為100～600mM，進一步較佳的含量為100～400mM，進一步更佳的含量為100～300mM，特佳的含量為200～300mM。

〈聚蔗糖及/或聚乙二醇(c)〉 本發明的細胞冷凍保存液，包含選自由聚蔗糖及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)。聚蔗糖及聚乙二醇能夠各自單獨使用或組合來使用。在本發明中，聚蔗糖及/或聚乙二醇，可與上述細胞膜通透性多元醇類(a)及糖類(b)組合來構成本發明的細胞冷凍保存液，並且這樣的細胞冷凍保存液，會是細胞的保存效果優異且起泡少的細胞保存液。

本發明的細胞冷凍保存液雖然包含選自由聚蔗糖及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)，但是，為了獲得細胞的保存效果優異且起泡少的細胞保存液，較佳是不包含上述成分以外的細胞膜非通透性高分子。此處，所謂細胞膜非通透性高分子，意指不會通過細胞膜的高分子，其包含例如：白蛋白(血清白蛋白等)、聚乙烯醇(PVA)等，但是不包含本發明中的糖類(b)、L-抗壞血酸2-葡萄糖苷等。因此，本發明的細胞冷凍保存液，更佳是不包含白蛋白(血清白蛋白等)，進一步較佳是不包含白蛋白(血清白蛋白等)及聚乙烯醇(PVA)，並且特佳是完全不包含選自由聚蔗糖及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)以外的細胞膜非通透性高分子(作為細胞膜非通透性高分子，僅包含聚蔗糖及/或聚乙二醇)。尤其是，本發明的細胞冷凍保存液，較佳是僅包含聚乙二醇作為細胞膜非通透性高分子。

聚蔗糖(polysucrose)，是一種中性且親水性的合成多糖類，其富含由蔗糖所構成的側鏈(其中，Ficoll是GE醫療股份有限公司的註冊商標)。作為用於本發明中的聚蔗糖，較佳是平均分子量為10000～1000000者，特佳是300000～550000者。此處，作為平均分子量為10000～1000000的聚蔗糖的具體製品，能夠例示GE醫療股份有限公司製造的Ficoll PM70(平均分子量60000～80000)、Ficoll PM400(平均分子量300000～500000)等，作為平均分子量為300000～550000的聚蔗糖的具體製品，能夠例示GE醫療股份有限公司製造的Ficoll PM400等。再者，雖然聚蔗糖為GE醫療股份有限公司的註冊商標，但是在本發明的聚蔗糖中，包含了與Ficoll具有相同的分子結構之聚合物，作為具體的製品，能夠例示富士軟片和光純藥股份有限公司製造的Polysucrose 400(平均分子量350000～550000)等。

聚乙二醇，是一種高分子化合物，其具有乙二醇聚合而成的結構。作為用於本發明的聚乙二醇，較佳的平均分子量是200～50000，特佳是6000～30000。此處，作為平均分子量為200～50000的聚乙二醇的具體製品，能夠例示Nacalai Tesque公司製造的#200、#300、#400、#600、#1000、#1500、#1,540、#2000、#4000、#6000、#20000等，作為平均分子量為6000～30000，能夠例示Nacalai Tesque公司製造的#6000、#20000等。

本發明的細胞冷凍保存液中的聚蔗糖及/或聚乙二醇(c)的含量，合計為0.5～10.0w/v%。較佳含量的下限是：合計為0.5w/v%、合計為1.0w/v%、合計為1.5w/v%、合計為2.0 w/v%、合計為2.5w/v%、合計為4.0w/v%、合計為4.5 w/v%，並且較佳含量的上限是：合計為10.0w/v%、合計為9.0w/v%、合計為8.0w/v%、合計為7.5w/v%、合計為6.0w/v%、合計為5.5w/v%。作為較佳含量的範圍，是合計為1.0～10.0w/v%。更佳的含量是合計為2.0～10.0w/v%。進一步較佳的含量是合計為2.5～7.5w/v%。進一步更佳的含量是合計為4.0～6.0w/v%，特佳的含量是合計為4.5～5.5w/v%。又，較佳是合計為1.5～6.0w/v%、合計為2.0～6.0w/v%、合計為2.5～6.0w/v%。

〈其他成分〉 本發明的細胞冷凍保存液中，藉由在不損害本發明的效果的範圍內調配其他成分，能夠提高本發明的效果或賦予更進一步的效果。作為該成分，可列舉例如：上述成分以外的細胞冷凍保護劑、抗氧化劑、pH調整劑、賦形劑、黏合劑、香料、緩衝劑、增黏劑、著色劑、穩定劑、保濕劑、防腐劑等。該等之中，較佳是在本發明的細胞冷凍保存液中調配有抗氧化劑。再者，在本發明的細胞冷凍保存液中，該等其他成分可以是分別單獨一種或組合兩種以上來進行調配。

該等之中，當抗氧化劑被調配在本發明的細胞冷凍保存液中時，可進一步提升細胞保存效果，因此，較佳是將抗氧化劑調配在本發明的細胞冷凍保存液中。尤其，當抗氧化劑被調配在本發明的細胞冷凍保存液中時，能夠進一步提升對於多潛能幹細胞，尤其是骨髓來源的間質幹細胞等的間質幹細胞的細胞保存效果，故可較佳地調配於本發明的細胞冷凍保存液中。作為抗氧化劑，可列舉例如：麩胱甘胺酸、α-生育酚磷酸鈉(TPNa：TPNa為昭和電工股份有限公司的註冊商標)、抗壞血酸、該等的衍生物等。作為抗壞血酸衍生物的具體例，可列舉：L-抗壞血酸2-葡萄糖苷、L-抗壞血酸2-磷酸酯鎂水合物(L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate)、L-抗壞血酸2-磷酸酯三鈉等。該等之中，較佳是抗壞血酸或抗壞血酸衍生物，進一步較佳是L-抗壞血酸2-葡萄糖苷。

再者，在本發明的細胞冷凍保存液中，二甲基亞碸(DMSO)不為必要成分。由於二甲基亞碸(DMSO)被指出可用來用以誘導培養細胞的分化或用於冷凍保存可能會對細胞的分化形態造成變化，所以本發明的細胞冷凍保存液，較佳是不包含二甲基亞碸(DMSO)。

〈基礎溶液〉 本發明的細胞冷凍保存液，是將上述成分分散於基礎溶液中而成。針對該基礎溶液，例如能夠使用水系或醇系溶液，但是較佳是能夠使用水溶液。作為水溶液，例如能夠使用等張溶液、各種緩衝溶液(包含具有緩衝效果的等張溶液)、或各種細胞用或組織用的基礎培養基。作為等張溶液，可列舉例如：生理食鹽水、林格氏溶液、漢克氏溶液(Hank's balanced salt solution)等。作為緩衝溶液，可列舉例如：古德氏緩衝溶液(Good's Buffers)、磷酸緩衝溶液、咪唑緩衝溶液、三乙醇胺鹽酸鹽緩衝溶液(TEA)等，進一步可列舉：磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、TRIS緩衝溶液(TBS)、HEPES緩衝生理食鹽水等的具有緩衝效果之生理食鹽水。作為基礎培養基，可列舉例如：DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等。

作為用於本發明的基礎溶液，可適當地使用緩衝溶液或基礎培養基。此處，所謂基礎培養基，意指由胺基酸、維生素、無機鹽及葡萄糖等的碳源等所構成的培養基，該培養基的組成明確且不包含來源不明的生物高分子(例如：血清或成長因子、白蛋白、胞外基質等的蛋白質成分等)。藉由使用這樣的基礎溶液，能夠更確實地獲得細胞的保存效果優異且起泡少的細胞冷凍保存液。其中，特別較佳可使用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)。

〈pH值〉 本發明的細胞冷凍保存液的pH值，通常是pH6.0～8.0，較佳是pH7.0～7.5。再者，該pH值能夠使用上述的pH值調整劑來調整。

[細胞冷凍保存方法] 本發明的細胞冷凍保存液，能夠藉由各種冷凍保存方法來將設為保存對象的細胞進行冷凍保存。能夠使用本發明的細胞冷凍保存液的冷凍保存方法，並無特別限制，能夠藉由各種冷凍保存方法來將設為保存對象的細胞進行冷凍保存，尤其能夠適合使用於漸凍方法。藉由漸凍方法的細胞冷凍保存方法，例如能夠藉由下述方式實施：將設為保存對象的細胞懸浮於本發明的細胞冷凍保存液中，之後緩慢地進行冷卻來冷凍細胞，並將該冷凍細胞適當地保存(例如，保存於超低溫冷凍櫃中、液態氮中等)。

因此，本發明亦關於一種細胞的漸凍方法，其特徵在於：使用本發明的細胞冷凍保存液。

具體而言，本發明的細胞漸凍方法，例如是包含下述步驟的細胞漸凍方法：將設為保存對象的細胞懸浮於本發明的細胞冷凍保存液中的步驟；及，使懸浮有細胞的細胞冷凍保存液緩慢地冷卻來將細胞冷凍的步驟。

本發明的細胞漸凍方法，因為使用本發明的細胞冷凍保存液，所以在使細胞懸浮於細胞冷凍保存液中時無需在意起泡而操作性優異，又因為是漸凍方法，例如不必準備氣化法所需的液態氮與特別的儀器等，而實施簡易。進一步，本發明的細胞冷凍保存方法，能夠以高保存效率來保存細胞。

〈設為保存對象的細胞〉 作為設為保存對象的細胞，並無特別限制，只要是一般性可進行冷凍保存的細胞，就能夠藉由本發明的細胞冷凍保存液來保存。作為培養細胞，能夠保存例如：經株化的細胞、由生物組織獲得的未經株化的正常細胞、藉由基因工程方法所獲得的轉化細胞等的任一形式的細胞，並進一步能夠保存下述各種幹細胞：誘導性富潛能幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)等的多潛能幹細胞；間質幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等。又，本發明的細胞冷凍保存液，不僅能夠保存這些細胞，亦能夠保存例如各種組織和臟器。

細胞的來源並無特別限制，可以是微生物、細菌、動物細胞、植物細胞，較佳是動物細胞。作為動物細胞，可列舉例如：哺乳動物細胞，該哺乳動物是小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔、貓、狗、羊、豬、牛、馬、山羊、猴、人等；脊椎動物的細胞，該脊椎動物是鳥類、爬蟲類、兩棲類及魚類，該鳥類是雞、鴕鳥等，該爬蟲類是鱷魚等，該兩棲類是青蛙等，該魚類是斑馬魚、青鱂魚等；及，包含昆蟲之非脊椎動物細胞，該昆蟲是蠶、蛾、果蠅等。

該等之中，本發明的冷凍細胞保存液，可適合地使用於間質細胞和間質幹細胞。作為間質細胞和間質幹細胞，可列舉例如：骨細胞、軟骨細胞、骨髓細胞、肌肉細胞、心肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、真皮乳頭細胞、牙髓細胞及該等細胞的幹細胞。尤其，本發明的冷凍細胞保存液，能夠適合地使用於骨髓來源的間質幹細胞和脂肪組織來源的幹細胞。 [實施例]

以下，藉由實施例詳細地說明本發明，但是本發明並未限定於該等實施例。

[實施例1]細胞的保存效果試驗 1.材料 〈細胞冷凍保存液〉 使用下述的各成分及基礎溶液，來調製各種組成的細胞冷凍保存液。又，細胞冷凍保存液分別利用0.22μm的過濾器(Nalgene(賽默飛世爾科技)製造)進行過濾滅菌再用於試驗中。

(各成分) 細胞冷凍保存液的各成分使用以下成分。 ‧丙二醇：Nacalai Tesque公司製造。 ‧海藻糖：林原公司製造。 ‧蔗糖：Nacalai Tesque公司製造。 ‧乳糖：Nacalai Tesque公司製造。 ‧麥芽三糖：林原公司製造。 ‧聚蔗糖：Nacalai Tesque公司製造。 ‧聚乙二醇(PEG)#200、PEG#600、PEG#2000、PEG#6000、PEG#20000：Nacalai Tesque公司製造。 ‧羥乙基澱粉(HES)：西格瑪奧瑞奇公司製造。 ‧支鏈澱粉：林原公司製造。 ‧人類血清白蛋白(HSA)：Nacalai Tesque公司製造。 ‧L-抗壞血酸2-葡萄糖苷：林原公司製造。

(基礎溶液) 基礎溶液使用以下成分。 ‧DMEM：Nacalai Tesque公司製造。 ‧磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)：Nacalai Tesque公司製造。 再者，磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)是以最終濃度成為1×、0.5×、0.2×的方式調製成細胞冷凍保存液。

〈細胞〉 實驗中使用以下細胞。 ‧正常人類皮膚纖維母細胞(自倉敷紡績股分有限公司購入) ‧NIH3T3細胞(小鼠纖維母細胞)(自ECACC(European Collection of Cell Cultures，歐洲細胞培養中心)購入) ‧人類骨髓來源的間質幹細胞(自龍沙集團股份有限公司購入)

2.方法 細胞的保存效果，藉由下述方式來評價：使用各細胞冷凍保存液來將保存對象的細胞進行冷凍保存，然後測定解凍後的細胞生存率。具體而言，將保存對象的細胞以細胞濃度成為1.0×10⁶ cells/ml的方式懸浮於各冷凍細胞保存液中，並將其各自以每管1mL的方式分注於冷凍小管後，使該等細胞在－80℃中進行漸凍。將經過如此操作而被冷凍的細胞保存在－80℃中特定的期間後，在37℃中進行解凍。經解凍的細胞以特定的密度進行播種，並在細胞培養用培養基中培養一晚。然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent(Invitrogen(賽默飛世爾科技)製造)，並依照內建的步驟準則來測定各自的活細胞數。再者，在本測定法中，生存率是藉由與活細胞數成正比的螢光強度來表示。

3.結果 (1)試驗1 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。再者，在以下的組成中，單位「%」，在表示丙二醇時為「v/v%」，除此之外的其他成分是「w/v%」(以下，在實施例1和2的試驗中亦同)。

[表1]

成分	保存液1	保存液2	保存液3	保存液4	保存液5	保存液6	保存液7	保存液8	保存液9
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM
聚蔗糖	5%	-	-	-	-	-	-	-	-
HES	-	3%	-	-	-	-	-	-	-
PEG#200	-	-	5%	-	-	-	-	-	-
PEG#600	-	-	-	5%	-	-	-	-	-
PEG#2000	-	-	-	-	5%	-	-	-	-
PEG#6000	-	-	-	-	-	5%	-	-	-
PEG#20000	-	-	-	-	-	-	5%	-	-
支鏈澱粉	-	-	-	-	-	-	-	5%	-
HSA	-	-	-	-	-	-	-	-	5%
基礎溶液	DMEM

試驗1中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存3週後的細胞生存率(n＝2)。此處，解凍後的細胞，是以1.0×10⁵ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。又，作為參考例，亦對市售的細胞冷凍保存液也就是STEM-CELLBANKER(註冊商標) DMSO Free GMP grade(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例1)進行試驗。將結果顯示於表1。

如第1圖所示，相較於除了10%丙二醇及250mM海藻糖以外還包含有以5%的羥乙基澱粉、5%分支澱粉或5%人類血清白蛋白來取代5%聚蔗糖或5%聚乙二醇之細胞冷凍保存液，包含有5%聚蔗糖或5%聚乙二醇(PEG#200、PEG#600、PEG#2000、PEG#6000、PEG#20000)之細胞冷凍保存液顯示了較高的生存率，並且其相較於市售的細胞冷凍保存液也顯示了較高的生存率。

(2)試驗2 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表2]

成分	保存液10	保存液11
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM	-
蔗糖	-	250 mM
聚蔗糖	5%
基礎溶液	0.5× PBS

試驗2中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存10天後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以1.0×10⁵ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第2圖。

如第2圖所示，與包含有10%丙二醇、250mM海藻糖及5%聚蔗糖之細胞冷凍保存液相同，包含有以250mM蔗糖來取代250mM海藻糖之細胞冷凍保存液亦顯示了高生存率。

(3)試驗3 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表3]

成分	保存液12	保存液13	保存液14	保存液15
丙二醇	10%
海藻糖	100 mM	200 mM	250 mM	300mM
聚蔗糖	5%
基礎溶液	0.5× PBS

試驗3中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存2週後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以1.0×10⁵ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第3圖。

如第3圖所示，與包含有10%丙二醇、250mM海藻糖及5%聚蔗糖之細胞冷凍保存液相同，海藻糖濃度為100mM、200mM或300mM之細胞冷凍保存液亦顯示了高生存率。

(4)試驗4 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表4]

成分	保存液16	保存液17	保存液18
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM
聚蔗糖	5%
基礎溶液	1× PBS	0.5× PBS	0.2× PBS

試驗4中，以NIH3T3細胞(小鼠纖維母細胞)作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存2週後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以1.0×10⁵ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。又，試驗4中，作為參考例，使用市售的細胞冷凍保存液也就是STEM-CELLBANKER(註冊商標) DMSO Free GMP grade(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例1)進行試驗。將結果顯示於第4圖。

如第4圖所示，相比於市售的冷凍保存液，包含10%丙二醇、250mM海藻糖及5%聚蔗糖之細胞冷凍保存液，即便在使用PBS(1×、0.5×、0.2×的濃度)作為基礎溶液時，保存NIH3T3細胞(小鼠纖維母細胞)時仍顯示了較高的生存率。 (5)試驗5 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表5]

成分	保存液19	保存液20
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM
聚蔗糖	5%
L-抗壞血酸2-葡萄糖苷	-	5 mM
基礎溶液	1× PBS

試驗5中，以正常人類皮膚纖維母細胞或人類骨髓來源的間質幹細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存2週後的細胞生存率(n＝1)。此處，解凍後的細胞，是以1.0×10⁵ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第5圖。在第5圖中，將對於各細胞的保存效果，以當將保存液19的測定值(螢光強度)設為100%時的相對值來表示。

如第5圖所示，相比於不包含5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液，除了10%丙二醇、250mM海藻糖及5%的聚蔗糖以外又進一步包含有5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液，在保存人類骨髓來源的間質幹細胞時顯示了較高的生存率。

[實施例2]細胞冷凍保存液的消泡試驗 1.材料 〈細胞冷凍保存液〉 與實施例1相同地操作，來調製各種組成的細胞冷凍保存液。

2.方法 細胞冷凍保存液的消泡，是藉由強制性地使各細胞冷凍保存液起泡，來測定截至該氣泡消失為止的時間來進行評價。具體而言，首先在2mL的離心管(艾本德(eppendorf)公司製造)中調製懸浮有NIH-3T3細胞(1.0×10⁶ cells/mL)之各細胞冷凍保存液。繼而，使用安裝有200μL的微量吸管尖之微量吸管(20-200)，使200μL的氣泡產生在各細胞冷凍保存液中。將離心管靜置於室溫中，並經時性地檢查是否有氣泡殘留在離心管中的細胞冷凍保存液中。

3.結果 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。 [表6]

成分	保存液21	保存液22	保存液23
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM
聚蔗糖	5%	-
PEG#20000	-	5%
L-抗壞血酸2-葡萄糖苷	-	5 mM	5 mM
基礎溶液	0.5× PBS

又，作為參考例，亦針對市售的細胞冷凍保存液進行試驗，該市售的細胞冷凍保存液是STEM-CELLBANKER(註冊商標) DMSO Free GMP grade(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例1)、CELLBANKER(註冊商標)1(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例2)、CELLBANKER(註冊商標)1 plus(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例3)。將結果顯示於表7和第6圖。表7，是顯示在各時間點時仍殘留有氣泡的離心管的數量的表，該離心管是針對各細胞冷凍保存液，各自使用4支離心管並利用上述方法來實行消泡試驗者。第6圖是顯示氣泡殘留狀態的代表性的照片，該氣泡殘留狀態是在氣泡產生步驟後經過1小時、3小時、24小時的時間點時的狀態。再者，重複20次該消泡試驗後，全部都獲得相同的結果。 [表7]

	開始	10 秒	10 分鐘	30 分鐘	60 分鐘	90 分鐘	120 分鐘	180 分鐘	24 小時
保存液22	4	0	0	0	0	0	0	0	0
保存液23	4	0	0	0	0	0	0	0	0
參考例1	4	4	4	4	4	4	4	4	0
參考例2	4	4	4	4	4	4	4	4	4
參考例3	4	4	4	4	4	4	4	4	4

如表7和第6圖所示，相比於市售的細胞冷凍保存液，包含有10%丙二醇、250mM海藻糖、5%的聚蔗糖或PEG#20000、及5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液顯示了非常好的消泡結果。又，在不包含5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之保存液21中，在氣泡產生操作後的10秒以內離心管中的全部氣泡亦消失了(n＝20)。

又，針對保存液22，以使用了蔗糖、乳糖或麥芽三糖來取代海藻糖之保存液進行試驗，在氣泡產生操作後約10秒以內，每一保存液的離心管中的全部氣泡都消失了。又，針對保存液22，以使用了人類血清白蛋白來取代聚蔗糖之保存液進行試驗，在氣泡產生操作後的24小時後，離心管中仍有氣泡殘留。

[實施例3]細胞的保存效果試驗2 1.材料 〈細胞冷凍保存液〉 使用下述的各成分及基礎溶液，來調製各種組成的細胞冷凍保存液。又，細胞冷凍保存液分別利用0.22μm的過濾器(Nalgene(賽默飛世爾科技)製造)過濾滅菌再用於試驗中。

(各成分) 細胞冷凍保存液的各成分使用以下成分。 ‧丙二醇：Nacalai Tesque公司製造。 ‧乙二醇：Nacalai Tesque公司製造。 ‧海藻糖：林原公司製造。 ‧蔗糖：Nacalai Tesque公司製造。 ‧麥芽三糖：林原公司製造。 ‧聚乙二醇(PEG)#20000：Nacalai Tesque公司製造。 ‧L-抗壞血酸2-葡萄糖苷：林原公司製造。 再者，針對任一細胞冷凍保存液，基礎溶液皆是以將磷酸緩衝生理食鹽水(PBS，Nacalai Tesque公司製造)的最終濃度調整成為0.5×的方式來使用。

〈細胞〉 實驗中使用以下細胞 ‧正常人類皮膚纖維母細胞(自倉敷紡績股分有限公司購入) ‧人類脂肪組織來源的幹細胞(自PromoCell公司購入) ‧人類骨髓來源的間質幹細胞1(自龍沙集團股份有限公司購入) ‧人類骨髓來源的間質幹細胞2(自PromoCell公司購入)

2.方法 細胞的保存效果，藉由下述方式來評價：使用各細胞冷凍保存液來將保存對象的細胞進行冷凍保存，然後測定解凍後的細胞生存率。具體而言，將保存對象的細胞以細胞濃度成為1.0×10⁶ cells/ml的方式懸浮於各冷凍細胞保存液中，並將其各自以每管0.2mL(試驗8)或1mL(試驗6～7及9～11)的方式分注於冷凍小管後，使該等細胞在－80℃中進行漸凍。將經過如此操作而被冷凍的細胞保存在－80℃中特定的期間後，在37℃中進行解凍。繼而，藉由alamarBlue測定法或者台酚藍染色法來測定各自的活細胞數。此處，alamarBlue測定法是將解凍後的細胞以特定的密度進行播種，並在細胞培養用培養基中培養一晚後，與實施例1同樣地操作來實行。台酚藍染色法則是對於解凍後的細胞藉由台酚藍來實行染色後，在血球計數器上測定總細胞數及活細胞數，然後由活細胞相對於總細胞的比例來算出生存率。

3.結果 (1)試驗6 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。再者，在以下的組成中，單位「%」，在表示丙二醇及乙二醇時為「v/v%」，除此之外的其他成分是「w/v%」(以下，在實施例3的試驗中亦同)。

[表8]

成分	保存液24	保存液25	保存液26	保存液27
丙二醇	-	5%	10%	15%
海藻糖	250 mM
PEG#20000	5%
基礎溶液	0.5× PBS

試驗6中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存2週後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以5.0×10⁴ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第7圖。

如第7圖所示，針對包含有丙二醇、海藻糖、聚乙二醇之細胞冷凍保存液，當使丙二醇濃度變化為5%、10%、15%時，在任一濃度中皆顯示了高生存率，其中，在濃度為10%的情況下顯示了特別高的生存率。

(2)試驗7 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表9]

成分	保存液28	保存液29	保存液30	保存液31
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM
PEG#20000	-	2.5%	5.0%	7.5%
基礎溶液	0.5× PBS

試驗7中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存2週後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以5.0×10⁴ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第8圖。

如第8圖所示，針對包含有丙二醇、海藻糖、聚乙二醇之細胞冷凍保存液，當使聚乙二醇濃度變化為2.5%、5.0%、7.5%時，在任一濃度中皆顯示了高生存率。

(3)試驗8 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表10]

成分	保存液32	保存液33
丙二醇	10%	-
乙二醇	-	10%
海藻糖	250 mM
PEG#20000	5%
基礎溶液	0.5× PBS

試驗8中，以人類骨髓來源的間質幹細胞1(由龍沙集團股份有限公司購入)、人類骨髓來源的間質幹細胞2(由Promo Cell公司購入)、人類脂肪組織來源的幹細胞或正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，在各種細胞冷凍保存液中保存1～5天(人類骨髓來源的間質幹細胞為2天；脂肪組織來源的幹細胞為1晚；皮膚纖維母細胞為5天)，來測定保存後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以5.0×10⁴ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將以人類骨髓來源的間質幹細胞1(由龍沙集團股份有限公司購入)作為保存對象時的結果顯示於第9圖A，將以人類骨髓來源的間質幹細胞2(由Promo Cell公司購入)作為保存對象時的結果顯示於第9圖B，將以人類脂肪組織來源的幹細胞作為保存對象時的結果顯示於第9圖C。並且，將以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象時的結果顯示於第10圖。再者，試驗8中，作為參考例，亦對市售的細胞冷凍保存液也就是STEM-CELLBANKER(註冊商標) GMP grade(含有DMSO，日本全藥工業股份有限公司製造，參考例4)進行試驗(並未針對正常人類皮膚纖維母細胞進行試驗)。

如第9圖所示，包含有10%丙二醇、250mM海藻糖及5%的聚乙二醇之細胞冷凍保存液，對於任一種幹細胞，與市售的細胞冷凍保存液相比，都顯示了相同或較高的生存率。進一步，包含有以乙二醇來取代丙二醇之細胞冷凍保存液，與包含有丙二醇之細胞冷凍保存液相比，顯示了相同或較高的生存率，並且，如第10圖所示，即便是在保存正常人類皮膚纖維母細胞時，相比於包含有丙二醇之細胞冷凍保存液，包含有乙二醇者仍顯示了較高的生存率。

(4)試驗9 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表11]

成分	保存液34
丙二醇	10%
海藻糖	250 mM
PEG#20000	5%
L-抗壞血酸2-葡萄糖苷	5 mM
基礎溶液	0.5× PBS

試驗9中，以正常人類皮膚纖維母細胞或人類骨髓來源的間質幹細胞1(由龍沙集團股份有限公司購入)作為保存對象，在各種細胞冷凍保存液中保存10天後，測定細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是藉由台酚藍染色法來對解凍後的細胞測定活細胞數，來算出生存率。將以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象時的結果顯示於第11圖A，將以人類骨髓來源的間質幹細胞1作為保存對象時的結果顯示於第11圖B。又，試驗9中，作為參考例，亦針對市售的細胞冷凍保存液進行試驗(其中，針對正常人類皮膚纖維母細胞僅使用參考例2)，該市售的細胞冷凍保存液是STEM-CELLBANKER(註冊商標) DMSO Free GMP grade(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例1)、CELLBANKER(註冊商標)1(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例2)、STEM-CELLBANKER(註冊商標) GMP grade(日本全藥工業股份有限公司製造，參考例4)。

如第11圖所示，包含有10%丙二醇、250mM海藻糖、5%的聚乙二醇及5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液，在保存正常人類皮膚纖維母細胞、人類骨髓來源的間質幹細胞1中的任一種細胞時，皆顯示了與市售的冷凍保存液相比相同或較高的生存率。

(5)試驗10 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表12]

成分	保存液35	保存液36
丙二醇	10%
蔗糖	250 mM	-
麥芽三糖	-	250 mM
PEG#20000	5%
基礎溶液	0.5× PBS

試驗10中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存1週後的細胞生存率(n＝4)。此處，解凍後的細胞，是以5.0×10⁴ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第12圖。又，試驗10中，作為參考例，亦針對市售的細胞冷凍保存液也就是STEM-CELLBANKER(註冊商標) GMP grade(含有DMSO，日本全藥工業股份有限公司製造，參考例4)進行試驗。

如第12圖所示，包含有10%丙二醇、250mM蔗糖及5%的聚乙二醇之細胞冷凍保存液，在保存正常人類皮膚纖維母細胞時，與市售的冷凍保存液相比，顯示了相同或較高的生存率。又，在包含有以麥芽三糖來取代蔗糖之細胞冷凍保存液中，亦同樣地顯示了較高的生存率。

(6)試驗11 利用以下組成的細胞冷凍保存液進行試驗。

[表13]

成分	保存液37	保存液38	保存液39	保存液40
丙二醇	10%	-
乙二醇	-	10%
海藻糖	250 mM
PEG#20000	5%
L-抗壞血酸2-葡萄糖苷	-	5 mM	-	5 mM
基礎溶液	0.5× PBS

試驗11中，以正常人類皮膚纖維母細胞作為保存對象，測定在各種細胞冷凍保存液中保存1週後的細胞生存率(n＝3)。此處，解凍後的細胞，是以5.0×10⁴ cells/well(24孔盤)的細胞密度進行播種，然後使用alamarBlue(註冊商標) Cell Viability Reagent來對培養後的細胞測定活細胞數。將結果顯示於第13圖A和第13圖B。第13圖A和第13圖B中，將各細胞冷凍保存液對於細胞的保存效果，以當將不包含L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液(保存液37、39)的測定值(螢光強度)設為100%時的相對值來表示。

如第13圖A和第13圖B所示，相比於包含有10%丙二醇、250mM海藻糖及5%的聚乙二醇但不包含5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液，進一步包含有5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液，顯示了較高的生存率。又，在包含有以乙二醇來取代丙二醇之細胞冷凍保存液中，包含有5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液，顯示了比不包含5mM的L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之細胞冷凍保存液更高的生存率。

(7)消泡試驗 針對保存液25～27及29～40，除了不使細胞懸浮於各保存液以外，與實施例2同樣地操作來實施消泡試驗，但是任一保存液在氣泡產生操作後約10秒以內，離心管中的全部氣泡都消失了。 [產業上的可利用性]

根據本發明，能夠提供一種細胞冷凍保存液，其細胞的保存效果優異且起泡少。這樣的細胞冷凍保存液，能夠有用地使用來作為醫療用幹細胞和分化細胞(包含細胞製劑等)等的保存劑或基礎研究用藥劑。

無

第1圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第2圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第3圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第4圖是顯示各細胞冷凍保存液對於NIH3T3細胞(小鼠纖維母細胞)的保存效果的圖表。 第5圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞或人類骨髓來源的間質幹細胞的保存效果的圖表。 第6圖是顯示各細胞冷凍保存液經過消泡試驗後的泡沫的殘留狀態的代表性的照片。 第7圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第8圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第9圖是顯示各細胞冷凍保存液對於2種的人類骨髓來源的間質幹細胞或人類脂肪來源的幹細胞的保存效果的圖表。 第10圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第11圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞或骨髓來源的間質幹細胞的保存效果的圖表。 第12圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。 第13圖是顯示各細胞冷凍保存液對於正常人類皮膚纖維母細胞的保存效果的圖表。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (8)

1. 一種細胞冷凍保存液，其包含：1.0～25.0v/v%的細胞膜通透性多元醇類(a)；100～1000mM的糖類(b)；及，合計為0.5～10.0w/v%的選自由聚蔗糖及聚乙二醇所組成之群組中的至少1種(c)。
2. 如請求項1所述之細胞冷凍保存液，其中，基礎溶液為緩衝溶液或基礎培養基。
3. 如請求項1或2所述之細胞冷凍保存液，其中，細胞膜通透性多元醇類(a)為選自由乙二醇及丙二醇所組成之群組中的至少1種。
4. 如請求項3所述之細胞冷凍保存液，其中，作為細胞膜通透性多元醇類(a)，僅包含乙二醇。
5. 如請求項1～4中任一項所述之細胞冷凍保存液，其中，糖類(b)為寡糖。
6. 如請求項4所述之細胞冷凍保存液，其中，糖類(b)為選自由海藻糖、蔗糖、乳糖及麥芽三糖所組成之群組中的至少1種。
7. 如請求項1～6中任一項所述之細胞冷凍保存液，其中，進一步包含L-抗壞血酸2-葡萄糖苷。
8. 一種細胞的漸凍方法，該方法的特徵在於：使用請求項1～7中任一項所述之細胞冷凍保存液。

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