KR102023339B1

KR102023339B1 - 조직 보존액 및 조직 보존 방법

Info

Publication number: KR102023339B1
Application number: KR1020157004565A
Authority: KR
Inventors: 류헤이 하야시; 코지 니시다; 료스케 카토리
Original assignee: 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2019-09-20
Also published as: US20150351380A1; KR20150067130A; JP5974093B2; EP2878197A1; EP2878197B1; JPWO2014017267A1; HK1206934A1; EP2878197A4; WO2014017267A1

Abstract

본 발명은 조직, 장기 및 세포의 보존성이 우수하고, 재생의료, 이식의료 등의 분야에 있어서 유용한 조직 보존액을 제공한다. 본 발명의 조직 보존액은 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 한다. Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물은 친전자성 물질이 바람직하고, 엡셀렌 또는 tert-부틸히드로퀴논이 바람직하다. 기초가 되는 보존액으로는 행크스 평형 염류 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

Description

조직 보존액 및 조직 보존 방법{TISSUE-PRESERVING LIQUID AND TISSUE-PRESERVING METHOD}

본 발명은 생물을 구성하는 조직, 장기, 세포 등을 보존하기 위한 조직 보존액 및 조직 보존 방법에 관한 것이다.

각막, 심장, 표피 등의 분야에 있어서는, 기존의 치료법이 유효하지 않은 중증 질환이나 난치성 질환에 대하여, 환자 자신의 세포를 이용하여 제작한 배양 세포 시트 등을 이용한 재생 치료법이 개발되고 있으며, 이미 임상응용이 행해지고 있다. 예를 들면 각막분야에 있어서도, 환자 자신의 구강점막 상피나 윤부 상피에 존재하는 전구 세포를 이용하여 제작한 배양 상피 시트의 이식이 행해지고 있으며, 복수의 시설에 있어서 본 치료법이 난치성 각막질환에 매우 유효한 것이 실증되어 있다. 이러한 배양 세포 시트를 이용하는 재생 치료법을 보다 많은 환자에게 적용하기 위해서는, 제조 시설에 있어서 배양 상피세포 시트를 제조하여, 각병원에 수송하고, 일정기간 보존할 수 있는 것이 중요하다. 또한, 산업화를 상정한 경우에 있어서는, 세포 시트를 일정기간 보존하는 기술은 더욱 중요성이 증가한다.

또한, 면역억제제의 진보 등에 의하여 조직이식의 중요성도 커지고 있다. 조직이식에 있어서는, 조직 제공자(donor)로부터 적출된 조직이 바로 수용자(recipient)에게 이식되는 것이 이상적이지만, 반드시 바로 이식할 수 있는 것은 아니다. 그 때문에, 적출한 조직을 일정기간 보존하는 기술은 대단히 중요하다. 따라서, 앞으로의 재생의료나 조직이식의 보급에 있어서는, 세포 시트 등의 재생의료 제품이나 이식용 조직(세포, 장기를 포함)의 보존액의 개발이 필수이다.

종래의 조직 보존액으로는, 예를 들면 유로-콜린스 액(Euro-Collins Solution), UW 액(University of Wisconsin Solution, 특허문헌 1), ET-Kyoto 액(특허문헌 2) 등이 알려져 있다.

특허문헌 1: 일본 특허공개 제평1-246201호 공보 특허문헌 2: 일본 특허공개 제평6-40801호 공보

본 발명은 생물을 구성하는 조직, 장기, 세포 등의 보존성이 우수하고, 재생의료, 이식의료 등의 분야에 있어서 유용한 조직 보존액을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 상기의 과제를 해결하기 위하여 이하의 각 발명을 포함한다.

[1] Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 조직 보존액.

[2] Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물이 친전자성 물질인 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 조직 보존액.

[3] Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물이 엡셀렌 및/또는 tert-부틸히드로퀴논인 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 조직 보존액.

[4] Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 함유하는 행크스 평형 염류 용액인 상기 [1]에 기재된 조직 보존액.

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 조직 보존액을 보존 대상과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 조직 보존 방법.

[6] 행크스 평형 염류 용액을 보존 대상과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 조직 보존 방법.

본 발명에 의하여, 생물을 구성하는 조직, 장기, 세포 등의 보존성이 우수하고, 재생의료, 이식의료 등의 분야에 있어서 유용한 조직 보존액을 제공할 수 있다.

도 1은 세포 시트의 보존에 사용하는 기초 보존 용액의 스크리닝 결과를 나타내는 도면이며, (A)는 루시퍼라아제 형질전환 랫트(luciferase transgenic rat) 유래 구강점막세포 시트를 기초 보존 용액에 침지하여 7일간 보존한 후의 ATP 잔존량을 나타내고, (B)는 7일간 보존 후의 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 KCM 배지를 사용하여 7일간 재배양한 후의 ATP 잔존량을 나타낸다.
도 2는 세포 시트의 보존에 사용하는 기초 보존 용액에 대한 첨가물의 스크리닝 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 유래 구강세포 시트의 보존 후 7일째에 있어서의 생세포율을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 보존 후 7일째에 있어서의 인간 유래 구강세포 시트를 HE 염색하여, 형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 보존액에 엡셀렌 첨가 PBS를 사용하여 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 보존하고, 보존 후 7일째 및 재배양 7일째의 ATP 잔존량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 보존액에 엡셀렌 첨가 Optisol GS(상품명)를 사용하여 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 보존하고, 보존 후 7일째 및 재배양 7일째의 ATP 잔존량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 보존 후 14일째에 있어서의 돼지 각막의 파라핀 절편을 HE 염색하여, 형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 보존 후 14일째에 있어서의 돼지 각막의 동결 절편을 ZO-1 면역염색하여, 형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 인간 유래 구강세포 시트를 엡셀렌 첨가 HBSS에 7일간 보존하고, 재배양을 개시한 후의 NQO-1 유전자의 발현량을 경시적으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 인간 유래 구강세포 시트를 엡셀렌 첨가 HBSS에 7일간 보존하고, 재배양을 개시한 후의 HO-1 유전자의 발현량을 경시적으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 보존액으로 tert-부틸히드로퀴논 첨가 HBSS를 이용하여 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 보존하고, 보존 후 7일째의 ATP 잔존량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

[조직 보존액]

본 발명은 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 함유하는 조직 보존액을 제공한다.

본 발명의 조직 보존 용액의 보존 대상에는, 생물을 구성하는 모든 조직, 장기, 세포 등이 포함되고, 이른바 협의의 조직에 한정되는 것은 아니다. 보존 대상의 세포에는, 조직이나 장기를 구성하는 세포가 포함되며, 분산된 상태의 세포도 포함된다. 조직으로는, 예를 들면, 상피조직, 결합조직, 근육조직, 신경조직 등을 들 수 있다. 장기로는, 예를 들면, 뇌, 척수, 위, 췌장, 췌도(pancreatic islets), 신장, 간장, 갑상선, 골수, 피부, 근육, 폐, 소화관(예를 들면, 대장, 소장 등), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 말초혈, 고환, 난소, 태반, 자궁, 뼈, 골격근 등을 들 수 있다. 세포로는, 예를 들면, 간세포, 비세포(splenocytes), 신경세포, 췌장β세포(pancreatic beta cell), 골수세포, 표피세포, 상피세포, 내피세포, 평활근세포, 섬유아세포, 근세포, 지방세포, 면역세포(예를 들면, 대식세포(macrophage), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural killer cell), 호중구, 단구(monocyte) 등), 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포 등을 들 수 있다. 또한, 불임 치료 등에 사용하는 정자, 난자, 수정란 등도 본 발명의 보존액의 보존 대상으로서 적합하다. 또한, 이들 세포의 전구세포, 줄기세포(간엽계줄기세포, 신경전구세포, 조혈줄기세포 등), 암세포, ES 세포, iPS 세포 등도 보존 대상으로서 적합하다. 더욱이, 배양 기술을 이용하여 조제한 재생의료용 제품도 보존 대상으로서 적합하다. 재생의료용 제품으로는, 예를 들면, 배양 피부, 배양 연골, 배양 각막상피, 각종 세포 시트 (예를 들면, 배양 표피세포 시트, 구강점막세포 시트, 각막윤부상피세포 시트, 각막내피세포 시트, 심근 시트, 근아세포 시트, 배양 연골세포 시트, 췌도세포 시트, 간세포 시트, 섬유아세포 시트, 치근막세포 시트 등), 재생의료용의 각종 배양세포 등을 들 수 있다.

보존 대상은 어떤 생물 유래여도 좋다. 바람직하게는 동물 유래이며, 더욱 바람직하게는 척추동물 유래이며, 더더욱 바람직하게는 포유동물 유래이다. 포유동물로는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류나 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 염소, 말, 양, 밍크 등의 가축, 개, 고양이 등의 애완동물, 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 마모셋(marmoset), 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 들 수 있다. 이 중에서도 인간 유래인 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 조직 보존액은 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것이라면 좋다. Nrf2는 포유류에 존재하는 염기성 류신 지퍼(basic-leucine zipper) 모티프를 갖는 전사인자의 하나로, NF-E2 관련 인자 2, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nuclear factor erythroid 2-like 2(Nfe2l2), Nuclear factor erhythroid 2-related transcription factor 2 등으로도 지칭된다(Proc Natl Acad Sci U S A. 91 9926-30 (1994); Biochem Biophys Res Commun. 209 40-6 (1995); 생화학 78 79-92 (2006)).

Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물은 Nrf2 활성화제와 동일한 의미이며, 전사인자 Nrf2를 활성화하는 작용을 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, Nrf2 활성화제로서 이하의 식품성분 또는 의약관련 성분이 알려져 있다.

식품성분: 설포라판(sulforaphane)(J Nutr. 131 (Suppl 11) 3027S-33S (2001)), tert-부틸히드로퀴논(tert-butylhydroquinone, TBHQ)(Toxicol. Appl. Pharmacol. 141 59-67 (1996)), 부틸화 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA)(Mol Carcinog. 45 841-50 (2006), Biochem Soc Trans. 28 (2000), Toxicol. Appl. Pharmacol. 126, 150-55 (1994)), 6-에톡시-1,2-디히드로-2,2,4-트리메틸퀴놀린(에톡시퀸(ethoxyquin))(Biochem Soc Trans. 28 (2000)), 6-메틸설피닐헥실 이소티오시아네이트(6-methylsulfinylhexyl isothiocyanate, 6-HITC)(J.Biol.Chem. 277 3456-63 (2002)), 카페스톨(cafestol)(Food Chem Toxicol. 40 1155-63 (2002)), 카웨올(kahweol)(Food Chem Toxicol. 40 1155-63 (2002)), 커큐민(curcumin)(Biochem J. 371 887-95 (2003), Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 E645-55 (2007)), 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin)(Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 E645-55 (2007)), 비스데메톡시커큐민(bisdemethoxycurcumin)(Am J Physiol Endocrinol Metab. in press (2007)), 피페린(piperine)(J Nutr Biochem. 18 615-22 (2007)), 페네틸 이소티오시아네이트(phenethyl isothiocyanate)(Pharm Res. 20 1351-6 (2003)), 카노솔(carnosol)(J Biol Chem. 279 8919-29 (2004)), 제룸본(zerumbone)(FEBS Lett. 572 245-50 (2004)), 레스베라트롤(resveratrol)(Biochem Biophys Res Commun. 331 993-1000 (2005)), 라이코펜(lycopene)(Mol CancerTher. 4 177-86 (2005)), 황화디알릴(diallyl sulfide)(Free Radic Biol Med. 37 1578-90 (2004), Arch Biochem Biophys. 432 252-60 (2004)), 삼황화디알릴(diallyl trisulfide)(Free Radic Biol Med. 37 1578-90 (2004)), 산토후몰(xanthohumol)(Chem Res Toxicol. 18 1296-305 (2005)), 3-O-카페오일-1-메틸퀸산(methylquinic acid)(Free Radic Biol Med. 40 1349-61 (2006)), 클로로겐산(chlorogenic acid)(J Biol Chem. 280 27888-95 (2005)), α-리포산(α-lipoic acid)(Proc Natl Acad Sci U S A. 101 3381-6 (2004)), 아세틸카르니틴(acetylcarnitine)(J Neurosci Res. 79 509-21 (2005)), 아비신(avicins)(J Clin Invest. 113 65-73 (2004)), 피세틴(fisetin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006)), 루테올린(luteolin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006)), 에리오딕티올(eriodictyol)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006)), 갈란긴(galangin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006)), 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)(Pharm Res. 22 1805-20 (2005)), 쿼세틴(quercetin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006), Free Radic Biol Med.42 1690-703 (2007)), 쿼세틴 3-O-β-L-아라비노피라노시드(quercetin 3-O-β-L-arabinopyranoside)(Food Chem Toxicol. 44 1299-307 (2006)), 쿼세틴 3-O-β-D-글루코피라노시드(quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside)(Food Chem Toxicol. 44 12 99-307 (2006)), 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코오즈(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)(World J Gastroenterol. 12 214-21 (2006)), 액티오사이드(acteoside)(Pharmazie. 61 356-8 (2006)), 이소후물론(isohumulone)(PCT/JP2005/019415), 이소코후물론(isocohumulone)(PCT/JP2005/019415), 4-아세틸-3-메틸-디히드로-퓨란-2-온, 4-(1-히드록시-에틸)-3-메틸-디히드로-퓨란-2-온, 5-히드록시-3,4,5-트리메틸-5-H-퓨란-2-온, 초산 1-(4-메틸-5-옥소-테트라히드로-퓨란-3-일)-에틸 에스테르, (5-에틸-테트라히드로-퓨란-2-일)-초산, 2-페닐-피란-4-온, 디히드로-4-페닐-2(3H)-퓨라논, 2-(2-포르밀피롤-1-일)-4-메틸길초산(일본특허출원 제2007-043783호), 데히드로코스투스 락톤(dehydrocostus lactone)(Eur J Pharmacol. 565 37-44 (2007)), 트리플로레톨-A(triphlorethol-A)(FEBS Lett. 581 2000-8 (2007)) 등.

의약관련 성분: 올티프라즈(oltipraz)(4-메틸-5-[2-피라진일]-1,2-디티올-3-티온)(Proc Natl Acad Sci USA 98 3410-5 (2001)), 아세트아미노펜(Hepatology 39 1267-76 (2004)), 아스피린(Carcinogenesis 27, 803-10(2006)), 플루나리진(flunarizine)(Cell Death Differ. 13 1763-75(2006)), α-루미놀 나트륨(α-luminol sodium)(Galavit)(J Virol. 80(9):4557-69 (2006)), 아포모르핀(apomorphine)(J Neurosci Res. 84 860-6.(2006)), 부실라민(bucillamine)(Biochem Pharmacol. 72 455-62 (2006)), 엡셀렌(ebselen)(Chem Res Toxicol. 19 1196-204 (2004)), 델타메트린(deltamethrin)(Toxicol Lett. 171 87-98 (2007), 15-데옥시-Δ(12,14)-프로스타글란딘 J2(15-deoxy-Δ(12,14)-prostaglandin J2)(15d-PGJ2)(J Biol Chem. 275 11291-9 (2000)), 4-히드록시-2-노네날(4-hydroxy-2-nonenal)(Circ Res. 94 609-16 (2004)), 2-인돌-3-일-메틸렌퀴누클리딘-3-올(2-indol-3-yl-methylenequinuclidin-3-ol)(Cancer Res. 63 5636-45 (2003)), 4-히드록시에스트라디올(4-hydroxyestradiol)(Biochim Biophys Acta. 1629 92-101 (2003)), 3',4',5',3,4,5-헥사메톡시-칼콘(3',4',5',3,4,5-hexamethoxy-chalcone)(Br J Pharmacol. 142 1191-9 (2004)), 2-시아노-3,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디엔-28-산(2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid)(Cancer Res. 65 4789-98 (2005)), 1-[2-시아노-3-,12-디옥소올레아나-1,9(11)-디에노-28-일]이미다졸(1-[2-cyano-3-,12-dioxooleana-1,9(11)-dieno-28-yl]imidazole)(Cancer Res. 65 4789-98 (2005)), α-메틸렌-γ-부티로락톤(α-methylene-γ-butyrolactone)(Eur J Pharmacol. 56537-44 (2007)), 니트로리놀산(nitrolinoleic acid)(Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 H770-6 (2007)), 3-히드록시안트라닐산(3-hydroxyanthranilic acid)(Atherosclerosis. 187 274-84 (2006)), 비스(2-히드록시벤질리덴)아세톤(bis(2-hydroxybenzylidene)acetone)(Cancer Lett. 245 341-9 (2007)), 2',4',6'-트리스(메톡시메톡시)칼콘(2',4',6'-tris(methoxymethoxy)chalcone)(Biochem Pharmacol. 74 870-80 (2007)) 등.

본 발명의 조직 보존액은 상기와 같은 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물의 1종 이상을 함유할 수 있다. Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물 중에서도, 친전자성 물질이 바람직하다. 친전자성 물질은 분자 중에 극성의 편재에 의해 전자밀도가 낮은 부위를 갖는 분자이다. 친전자성 물질이 비(非)스트레스 상태의 세포에 있어서 Nrf2의 억제에 작용하는 Keap1을 자극함으로써, Nrf2가 Keap1로부터 개방되어 활성화한다. 상기 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물 중, 친전자성 물질로는, 예를 들면, tert-부틸히드로퀴논(이하 「tBHQ」로 표기), 엡셀렌, 설포라판, 커큐민 등을 들 수 있다. 이중에서도 바람직하게는 tBHQ 및 엡셀렌이다.

본 발명의 조직 보존액은 기초가 되는 보존 용액(기초 보존 용액)에 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 1종 또는 2종 이상 첨가하고, 용해함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 멸균시킨 기초 보존 용액에 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 무균적으로 첨가하여 제조해도 좋고, Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 첨가한 후에 멸균 처리를 수행해도 좋다. 멸균에는 오토클레이브 멸균, 여과 멸균 등의 공지의 멸균법을 이용할 수 있다. 제조된 조직 보존액은 사용시까지 약 2∼8℃의 저온에서 보관하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조직 보존액에 있어서 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물의 함량은 보존하는 조직에 대하여 독성을 나타내지 않는 함량이라면 특별히 한정되지 않는다. 사용하는 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물에 따라 적절히 알맞은 함량을 설정할 수 있다. 예를 들면, 엡셀렌을 단독으로 사용하는 경우, 0.1μM ∼ 100μM이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5μM ∼ 50μM이며, 더더욱 바람직하게는 1μM ∼ 10μM이다. 또한, tBHQ를 단독으로 사용하는 경우, 0.1μM ∼ 100μM이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5μM ∼ 50μM, 더더욱 바람직하게는 1μM ∼ 10μM이다.

기초 보존 용액은 특별히 한정되지 않고, 일반적인 완충액, 생리적 완충액, 평형 염류 용액, 세포배양용의 기초 보존 용액, 조직 보존액 등의 공지의 용액으로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 생리식염액, PBS, 행크스 평형 염류 용액(Hank's Balanced Salt Solution, 이하 「HBSS」로 표기), DMEM, EMEM, MEM-α, F-12, DMEM/F-12, RPMI-1640, 유로-콜린스 액(Euro-Collins Solution), UW, ET-Kyoto, Optisol GS(상품명) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 PBS, HBSS, UW, ET-Kyoto, Optisol GS(상품명)이며, 더욱 바람직하게는 HBSS 및 UW이다. 본 발명의 조직 보존액은 보존 중의 조직이 팽창 또는 수축하는 것을 막기 위하여, 침투압(osmotic pressure)이 약 270 ∼ 약 450O sm/l의 범위에 있는 것이 바람직하다. 또한, 세포의 산성분해를 방지하기 위하여, pH가 약 7∼8의 범위에 있는 것이 바람직하다.

[조직 보존 방법]

본 발명은 상기 본 발명의 조직 보존액을 사용하는 조직 보존 방법을 제공한다. 본 발명의 조직 보존 방법은 본 발명의 조직 보존액을 보존 대상의 조직, 장기, 세포 등과 접촉시키는 것일 수 있다.

본 발명의 조직 보존 방법의 제1의 실시형태는, 보존 대상의 조직, 장기, 세포 등을 본 발명의 조직 보존액에 침지함으로써, 보존액과 보존 대상을 접촉시켜 조직, 장기, 세포 등을 보존하는 방법이다. 보존 대상에 대한 보존액의 양은 특별히 한정되지 않지만, 보존 대상이 완전히 침지하는 양 이상의 양이라면 좋다.

용기는 특별히 한정되지 않고, 밀봉 용기 및 해방 용기(解放容器)의 어느 것도 사용가능하다. 목적에 따라 적절히 선택하면 좋다. 바람직하게는, 호기 조건(산소, 이산화탄소, 질소 등의 기체가 자유롭게 통기 가능한 조건)을 유지할 수 있는 용기이다.

보존 온도는 특별히 한정되지 않지만, -196℃∼20℃의 범위가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 -20℃∼15℃, 더더욱 바람직하게는 0℃∼10℃이다. 한편, 본 발명의 조직 보존액 중에 보존 대상을 침지하여 동결 보존하는 경우는, 소망에 따라 조직 보존액에 공지의 동결 보호제(예를 들면, DMSO, 글리세린 등)를 첨가해도 좋다.

보존 기간은 목적에 따라 적절히 설정할 수 있다. 통상 수 분∼3개월 정도의 보존 기간을 설정할 수 있다. 바람직하게는 30분∼1개월 정도이며, 더욱 바람직하게는 30분∼20일간 정도이다.

본 발명의 조직 보존 방법의 제2의 실시형태는, 보존 대상의 조직 표면에 본 발명의 조직 보존액을 산포(散布) 등을 함으로써 보존액과 조직을 접촉시켜 조직을 보존하는 방법이다. 제2의 실시형태는, 본 발명의 조직 보존액을 절개수술이나 내시경수술에 있어서의 조직 세척액 또는 관류액으로서 사용하는 경우의 형태이다. 제2의 실시형태는, 생체의 조직을 그대로의 상태로 단시간 보존하는 경우에 적합하다. 제2의 실시형태의 보존 기간은 통상 1분∼10시간 정도, 바람직하게는 5분∼5시간 정도, 더욱 바람직하게는 5분∼2시간 정도이다. 보존 기간 중은 조직의 표면에 본 발명의 조직 보존액을 산포, 관류 등을 함으로써, 조직의 표면과 본 발명의 조직 보존액과의 접촉 상태를 유지하면 좋다.

본 발명자들은 Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 첨가하지 않은 HBSS에 조직(세포 시트)을 보존하였을 때, 기존의 조직 보존액을 이용한 경우보다 보존 후의 ATP 잔존량(세포생존율) 및 재배양 후의 ATP 잔존량(세포생존율)이 높은 것을 새롭게 발견했다. 즉, HBSS는 기존의 조직 보존액보다 조직 보존성이 우수하다는 것을 새롭게 발견했다(실시예 1 참조). 따라서, 본 발명은 HBSS를 조직과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 조직 보존 방법을 제공한다. HBSS를 이용하는 조직 보존 방법은 상기와 동일한 형태로 실시할 수 있다.

[본 발명의 유용성]

본 발명의 조직 보존액을 사용하면, 기존의 조직 보존액을 사용한 경우보다 보존 후의 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 조직 보존액에 돼지 각막조직을 2주간 보존해도 조직 형태가 유지되는 것을 확인했다. 이와 같이, 본 발명의 보존액은 기존의 조직 보존액보다 조직 보존성이 매우 우수하여, 조직 보존액으로서 매우 유용하다. 따라서, 이식의료 분야에 본 발명의 조직 보존액을 사용하면, 조직 제공자(donor)로부터 적출된 조직을 일정기간 보존할 수 있으므로, 원격지의 수용자(recipient)에게 이식하는 것이 가능하게 된다. 또한, 재생의료 분야에 본 발명의 조직 보존액을 사용하면, 제조 시설에서 제조한 배양 세포 시트 등의 재생의료제품을 일정기간 보존할 수 있으므로, 재생치료법을 보다 많은 환자에게 적용하는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 조직 보존액은 세포의 생존율을 높게 유지하는 것이 가능하기 때문에, 세포의 생존 상태가 매우 중요한 불임치료법의 성적을 향상시킬 수 있다. 또한, ES 세포나 iPS 세포의 보존액으로서도 유용하다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 루시퍼라아제 형질전환 랫트(luciferase transgenic rat) 유래 구강점막세포 시트를 사용한 기초 보존 용액의 스크리닝]

(1) 세포 시트의 제작

루시퍼라아제 형질전환 랫트(Hakamata Y, Murakami T, Kobayashi E. Transplantation 2006; 81(8): 1179-1184) 구강조직(지치 의과대학교 선단치료개발부문(Division of Development of Advanced Treatment, Jichi Medical University) 고바야시 에이지(Kobayashi Eiji) 선생님으로부터 제공)을 1% 항생제 및 항진균제(Antibiotics and antimycotics)(AbAm, Gibco)를 첨가한 DMEM(Gibco) 중에서 2회 세척했다. 이어서, 세척한 조직을 1% AbAm을 첨가한 DMEM으로 용해한 디스파아제 I(Dispase I)(1,000 PU/ml) 용액에 4℃에서 4시간 침지하였다. 디스파아제 처리 후, 0.02% EDTA 용액(nacalai tesque)으로 조직을 옮기고, 실온에서 2분간 침지한 후, PBS로 2회 세척했다. 이어서, 핀셋을 이용하여 구강조직으로부터 기저막과 함께 구강점막상피를 박리했다. 박리한 상피를 0.25% 트립신-EDTA 용액(Gibco)에 침지하고, 37℃에서 20분간 처리한 후, 10% KCM 배지(Hayashi R, Yamato M, Takayanagi H, Oie Y, Kubota A, Hori Y, Okano T, Nishida K. Tissue Engineering Part C Methods 2010; 16(4): 553-560)로 현탁했다. 이 후, 마이토마이신 C(mitomycin C) 처리를 한 NIH/3T3을 파종해 둔 6 웰 플레이트에 4×10⁵cells/well의 농도로 파종하고, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양했다. 콘플루언트에 도달할 때까지 배양한 구강점막상피세포를 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 37℃에서 5분간 처리하고, 10% KCM 배지로 재현탁했다. 이어서, 세포현탁액을 96 웰 플레이트 화이트/클리어, 조직 배양 처리 플레이트, 뚜껑이 장착된 평평한 바닥(96 well plate white/clear, Tissue culture treated plate, Flat bottom with Lid)(BD Falcon^TM)에 1 well당 1/150 양(量)의 농도로 파종하고, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 14일간 배양하여, 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 제작했다. 실험에는 계대수 5 이하의 구강점막상피세포 시트를 사용했다.

(2) 세포 시트의 ATP 측정방법

세포 시트의 ATP 양은 세포 시트의 생존율(viability)과 서로 관련되므로, 보존 전, 보존 후 및 재배양 후의 세포 시트의 ATP 양을 측정하여, 세포 시트의 생존율의 지표로 하였다. 세포 시트의 ATP 측정방법은 이하와 같다. 즉, 96 웰 플레이트 화이트/클리어, 조직 배양 처리 플레이트에 제작한 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 HBSS로 2회 세척한 후, HBSS를 190 ㎕를 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치했다. 이어서, 발광 마이크로플레이트 리더 Centro LB960(Berthold Technologies GmbH & Co. KG)에 정치 후의 96 웰 플레이트를 준비하고, 기기설정에 의해 루시페린(Luciferin)의 첨가(최종 농도; 0.19 mg/ml) 및 ATP 양의 측정을 수행했다. 측정은 4℃에서 2초간의 측정을 12분간 수행하고, 발광량의 최대치를 ATP 양의 측정값으로 했다. 측정 종료 후, HBSS로 3회 세척한 후, 각 보존액을 사용하여 세포 시트를 4℃에서 7일간 보존했다. 보존 기간 종료 후, HBSS로 2회 세척하고, 동일하게 하여 ATP 양의 측정을 수행했다. 측정 후, HBSS로 2회 세척하고, 10% KCM 200 ㎕를 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 환경하에서 7일간 배양을 했다. 7일간 배양한 후, HBSS로 2회 세척하고, 다시 동일한 방법으로 ATP 양을 측정했다.

(3) 보존 시험 및 재배양 시험

기초 보존 용액으로서, PBS, HBSS, DMEM/F12, UW, ET-Kyoto 및 Optisol GS(상품명)의 6 종류를 사용했다. 보존 전의 ATP 양을 측정한 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 HBSS로 3회 세척하고, 각 기초 보존 용액 300 ㎕를 첨가하고, 4℃에서 7일간 보존했다. 보존 기간 종료 후, HBSS로 2회 세척하고, ATP 양을 측정했다. 측정 후, HBSS로 2회 세척하고, 10% KCM 200 ㎕를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 재배양을 수행했다. 7일간 배양한 후, ATP 양을 측정했다.

(4) 결과

결과를 도 1 (A) 및 (B)에 나타내었다. (A)는 보존 후 7일째의 ATP 잔존량을 나타내며, (B)는 재배양 7일째의 ATP 잔존량을 나타낸다. 도 1(A)로부터 알 수 있는 바와 같이, 보존 후 7일째의 ATP 잔존량은 HBSS가 약 5%로 가장 높고, 이하 UW, ET-Kyoto, Optisol GS(상품명)의 순으로 높았다. 또한, 도 1(B)로부터 알 수 있는 바와 같이, 재배양에 의해 시트를 재형성한 것은 HBSS 및 UW로 보존한 세포 시트이며, HBSS로 보존한 세포 시트가 재배양 후의 ATP 잔존량이 높고(약 50%), UW 보다 보존성이 우수한 것으로 나타났다.

[실시예 2: 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 사용한 기초 보존 용액에 대한 첨가물의 스크리닝]

(1) 실험 방법

기초 보존 용액으로 HBSS를 사용하고, 첨가물로서 덱스트란 40(dextran 40)(0.2 g/l, 2 g/l, 20 g/l), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate)(0.01 %, 0.1 %, 1 %), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine)(0.1 mM, 1 mM, 10 mM), 알로퓨리놀(allopurinol)(0.1 mM, 1 mM, 10 mM), 글루타치온(glutathione)(0.3 mM, 3 mM, 30 mM), 아데노신(adenosine)(0.05 mM, 0.5 mM, 5 mM), 히알루론산(hyaluronic acid)(0.01 %, 0.1 %, 0.5 %), 디부티릴 cAMP(dibutyryl cAMP)(0.2 mM, 2 mM, 20 mM), 트레할로오스(trehalose)(12 mM, 120 mM, 1200 mM) 및 엡셀렌(ebselen)(1 μM, 10 μM, 100 μM)의 10 종류를 사용했다. 첨가물의 농도는 각각 괄호 안에 나타낸 것과 같이 하고, 각각 n=3으로 실험을 수행했다. 실시예 1과 동일하게 하여, 보존 개시 전과 보존 후 7일째의 ATP 양을 측정했다.

(2) 결과

결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 엡셀렌을 첨가한 경우에 보존 후 7일째의 ATP 잔존량의 현저한 증가가 확인되었다.

[실시예 3: 인간 유래 구강세포 시트를 사용한 엡셀렌 첨가 보존액의 효과의 검증]

(1) 세포 시트의 제작

동결 보존된 인간 구강 각질형성세포(Human Oral Keratinocytes)(HOK, Sciencell^TM Research Laboratories)를 37℃에서 용해하고, CnT-24에 현탁했다. 이어서, T75 플라스크에 파종하고, 37℃, 5% CO₂조건하에서 배양했다. 콘플루언트에 도달한 HOK를 0.25% 트립신-EDTA로 처리하고, 박리한 후, Cnt-24를 첨가하여 현탁액으로 했다. 이어서, 1200 rpm으로 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거한 후, CnT-24로 재현탁했다. 세포현탁액은 5×10⁵cell씩 T75 플라스크에 파종하고, 37℃, 5% CO₂조건하에서 배양했다. 다시 콘플루언트에 도달한 HOK를 상기와 동일한 방법으로 박리하고, 10% KCM으로 세포현탁액으로 했다. 이어서, 마이토마이신 C 처리를 한 NIH/3T3을 파종한 35mm UpCell(등록상표, CellSeed)에 HOK 세포현탁액을 3×10⁵cell씩 파종하고, 37℃, 5% CO₂조건하에서 14일간 배양하여, 인간 구강점막세포 시트를 제작했다.

(2) 보존 후 7일째에 있어서의 생세포율의 측정

보존액으로서, PBS, Optisol GS(상품명), HBSS 및 엡셀렌(10μM) 첨가 HBSS를 사용했다. 실시예 1과 동일하게, 세포 시트를 보존액에 침지하고, 4℃에서 7일간 보존했다. 보존 전과 보존 후 7일째에 생세포율을 측정했다. 생세포율의 측정은 7-아미노-악티노마이신 D(7-amino-actinomycin D, 7-AAD) 염색에 의한 유세포분석법(flow cytometry)으로 수행했다. 즉, 박리한 세포 시트의 1/2을 0.25% 트립신-EDTA로 처리하여 세포현탁액으로 한 후, 5% FBS를 첨가한 PBS로 중화하고, 1200 rpm으로 5분간 원심분리했다. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 5% FBS를 첨가한 PBS 1 ml로 세포현탁액으로 하여, 세포수 측정을 수행했다. 이어서 7-AAD를 20 ㎕ 첨가하고, 실온, 암소에서 20분간 정치한 후, 유세포분석에 의한 해석을 수행했다. 7-AAD 음성의 세포집단을 생세포(生細胞), 7-AAD 양성의 세포집단을 사세포(死細胞)로 하여 생세포율을 산출했다.

(3) 보존 후 7일째에 있어서의 세포 시트의 형태(HE 염색)

세포 시트의 1/4을 10% 포르말린 용액에 하룻밤 침지한 후, 파라핀 포매했다. 포매한 세포 시트를 3 ㎛의 두께로 절박(切薄)하여, 파라핀 절편을 제작했다. 이어서, 탈(脫)파라핀을 수행하기 위하여 자일렌에 2회, 100% 에탄올, 99% 에탄올, 95% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올, 증류수의 순으로 절편을 침지하였다. 이어서, TBS에 5분간 침지한 후, 증류수에 통과시키고, 헤마톡실린으로 10분간 염색했다. 헤마톡실린 염색 후, 유수(流水)로 10분간 세척하고, 1% 염산 에탄올 중에서 10초간 탈색했다. 탈색 후, 즉시 유수로 1분간 세척하고, 증류수에 15분간 침지하였다. 이어서, 에오신으로 2분간 염색하고, 유수로 5분간 세척했다. 절편을 투철(透徹), 봉입(封入)하기 위하여, 100% 에탄올에 5회, 자일렌에 3회 침지한 후, 봉입제(MGK-S, 마츠나미 초자공업주식회사(Matsunami Glass Ind., Ltd.))를 이용하여 절편을 봉입했다. 관찰은 BIOREVO BZ-9000 현미경(KEYENCE)으로 대물렌즈 20배를 사용하여 수행했다.

(4) 생세포율의 결과

도 3에 유세포분석의 차트를 나타내었다. 또한, 표 1에 보존 전 및 보존 후의 각 보존액에 있어서의 세포수, 생세포율 및 세포 시트당 생세포수(live cell number)를 나타내었다. 도 3 및 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 엡셀렌 첨가 HBSS를 사용한 경우의 생세포율은 91.1 %이며, 엡셀렌을 첨가하지 않은 HBSS와 비교하여 24 % 높고, 엡셀렌 첨가에 의하여 생세포수는 약 4배 많이 유지되는 것으로 나타났다.

(5) HE 염색의 결과

결과를 도 4에 나타내었다. 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 엡셀렌 첨가 HBSS로 보존한 세포 시트는 두께나 형태가 양호하게 유지되어 있다. 엡셀렌을 첨가하지 않은 HBSS로 보존한 세포 시트는 엡셀렌 첨가 HBSS에는 뒤지지만 두께나 형태는 유지되고 있었다. 한편, PBS로 보존한 세포 시트는 형태가 크게 무너져 내려 있으며, Optisol GS(상품명)로 보존한 세포 시트는 중층상피가 탈락하고, 거의 단층이 되어 있다.

[실시예 4: PBS, Optisol GS(상품명)에 대한 엡셀렌의 첨가]

(1) 실험 방법

PBS에 엡셀렌을 첨가한 보존액 또는 Optisol GS(상품명)에 엡셀렌을 첨가한 보존액을 사용하여 실시예 1과 동일하게 하여, 보존 개시 전, 보존 후 7일째 및 재배양 7일째의 ATP 양을 측정했다. 엡셀렌의 농도는 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 3단계로 했다.

(2) 결과

PBS의 결과를 도 5에, Optisol GS(상품명)의 결과를 도 6에 각각 나타내었다. 도 5로부터, 보존액으로 엡셀렌 첨가 PBS를 사용한 경우에는, 10 μM 이상의 엡셀렌 첨가에 의해 재배양에 있어서 증식이 확인되었다. 도 6으로부터, 보존액으로 엡셀렌 첨가 Optisol GS(상품명)를 사용한 경우에는, 1 μM 이상의 엡셀렌 첨가에 의해 재배양에 있어서 증식이 확인되었다. 이들 결과로부터, 단독으로는 세포 시트를 보존하는 것이 어려운 PBS 및 Optisol GS(상품명)에서도, 엡셀렌을 첨가하는 것에 의해 보존액으로서 사용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

[실시예 5: 돼지 유래 각막조직을 사용한 엡셀렌 첨가 보존액의 효과의 검증]

(1) 돼지 각막의 채취

돼지 안구의 각막륜부 주변에 메스로 칼집을 낸 후, 강막(强膜)을 2∼3 mm 남기고 가위로 제거했다. 이어서, 핀셋을 이용하여 수정체를 제거하고, 다시 실태 현미경 하에서 홍채를 제거하고, 강각막편(强角膜片)으로 했다.

(2) 보존 전 및 14일간 보존 후에 있어서의 조직 형태의 대비

보존액으로서, PBS, 엡셀렌 첨가 PBS, Optisol GS(상품명), 엡셀렌 첨가 Optisol GS(상품명), HBSS, 및 엡셀렌 첨가 HBSS의 6 종류를 사용했다. 엡셀렌 농도는 모두 10 μM로 했다. 9 ml의 보존액에 채취한 돼지 각막을 침지하고, 4℃에서 14일간 보존했다. 14일째에 각막을 꺼내어, 가위를 이용하여 1/2로 절단했다. 한쪽은 10% 포르말린 용액에 하룻밤 침지한 후, 파라핀 포매하고, 다른 한쪽은 동결절편 제작용 포매제(O.C.T.Compound, 사쿠라 파인텍 재팬 주식회사(Sakura Finetek Japan Co., Ltd.))를 이용하여 동결 블록으로 했다.

돼지 강각막편의 HE 염색 방법은 아래와 같다. 파라핀 포매한 각막조직을 3 ㎛의 두께로 절박(切薄)하여, 파라핀 절편을 제작했다. 이어서, 탈(脫)파라핀을 수행하기 위하여 자일렌에 2회, 100% 에탄올, 99% 에탄올, 95% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올, 증류수의 순으로 절편을 침지하였다. 이어서, TBS에 5분간 침지한 후, 증류수에 통과시키고, 헤마톡실린으로 10분간 염색했다. 헤마톡실린 염색 후, 유수(流水)로 10분간 세척하고, 1% 염산 에탄올 중에서 10초간 탈색시켰다. 탈색 후, 즉시 유수로 1분간 세척하고, 증류수에 15분간 침지하였다. 이어서, 에오신으로 2분간 염색하고, 유수로 5분간 세척했다. 절편을 투철, 봉입하기 위하여, 100% 에탄올에 5회, 자일렌에 3회 침지한 후, 봉입제(MGK-S, 마쓰나미 초자공업주식회사(Matsunami Glass Ind., Ltd.))를 이용하여 절편을 봉입했다. 관찰은 BIOREVO BZ-9000 현미경(KEYENCE)으로 대물렌즈 20배를 사용하여 수행했다.

ZO-1 면역염색 방법은 아래와 같다. 동결 포매한 각막조직을 10 ㎛의 두께로 절박하여, 동결절편을 제작했다. 충분히 건조시킨 후, 0.1M TBS로 5분간 세척하고, O.C.T. Compound를 제거했다. 이어서, 5% 당나귀 혈청(donkey serum)(Jackson Immuno Research) 및 0.3% 트리톤 X-100을 첨가한 0.1M TBS(5% NST)에 실온에서 1시간 침지하고, 블록킹(blocking)을 행하였다. 5% NST를 제거한 후, 1% 당나귀 혈청 및 0.3% 트리톤 X-100을 첨가한 0.1M TBS(1% NST)에 ZO-1, 마우스 단일클론항체(Mouse Monoclonal Antibody)(invitrogen)를 최종 농도 5 ㎍/ml이 되도록 첨가한 일차 항체용액에 4℃에서 하룻밤 침지하였다. 이어서, 0.1M TBS로 10분간, 3회 세척한 후, 1% NST에 AlexaFluor(등록상표) 488 Donkey Anti-mouse IgG(invitrogen)를 최종 농도 20 ㎍/ml이 되도록 첨가한 이차 항체용액에 실온에서 1시간 침지하였다. 이차 항체용액을 제거한 후, 1% NST에 비스벤즈이미드 H33342 3염산염(bisBenzimide H33342 trihydrochloride)를 최종 농도 10 ㎍/ml이 되도록 첨가한 용액에 실온에서 1시간 침지하여, 핵염색하였다. 이 후, 0.1M TBS로 10분간, 2회 세척한 후, 봉입제(Mount Permafluor, Thermo scientific)를 이용하여 봉입했다. 관찰은 하이엔드 도립형광현미경(Axio observer. D1, Carl Zeiss)을 사용했다.

(3) 결과

HE 염색의 결과를 도 7에 나타내고, ZO-1 면역염색의 결과를 도 8에 나타내었다. 도 7에서는, PBS로 보존한 돼지 각막은 상피가 탈락하기 시작하고 있는 부분이 많이 보였지만, 엡셀렌 첨가 PBS로 보존한 경우는 탈락 부분은 보이지 않았다. 도 8로부터, 14일간 보존 후에 있어서, 엡셀렌 첨가 HBSS에서는 각막상피의 단단한 접합(tight junction)의 형성이 보지(保持)되어 있다(도면 중, 점선으로 둘러싼 부분).

[실시예 6: 인간 유래 구강세포 시트의 재배양 기간에 있어서의 Nrf2 관련 유전자의 발현]

인간 유래 구강세포 시트를 HBSS에 엡셀렌 첨가한 보존액을 사용하여 4℃에서 7일간 보존하고, 이 후 10% KCM을 사용하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 재배양을 개시했다. 엡셀렌의 농도는 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 3단계로 하고, 컨트롤로서 엡셀렌 무첨가의 HBSS를 사용했다. Nrf2 관련 유전자로서, NQO-1 및 HO-1을 선택했다. NQO-1은 NAD(P)H(퀴논 산화환원효소 1(quinone oxidoreductase 1))의 약칭이며, 퀴논류를 이전자환원하여 히드로퀴논으로 변환하고, 다른 약물대사효소에 의해 포합·배출되기 쉬운 형태로 하는 산화환원반응을 촉매하는 효소이다. NQO-1은 그 발현이 Nrf2의 활성화에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. HO-1은 헴 옥시게나아제(heme oxygenase)의 약칭이며, 헴(heme)을 철 이온, 일산화탄소, 빌리베르딘(biliverdin)으로 분해한다. 또한, 빌리베르딘은 환원효소에 의해 빌리루빈(bilirubin)이 되지만, 이들 빌리베르딘 및 빌리루빈이 유리 라디칼 스캐빈저(free radical scavenger)가 되어, 생체를 산화 스트레스로부터 방어한다. HO-1도 NQO-1 와 동일하게, Nrf2의 활성화에 의해 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다.

루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 12 웰 플레이트에 제작하고, 보존 전, 보존 7일 후의 재배양 0시간 후, 6시간 후, 및 24시간 후에 mRNA를 추출하고, RNeasy plus micro kit(QIAGEN)를 사용하여 정제했다. 이어서, SuperScript First-strand synthesis super mix for qRT-PCR(invitrogen)을 이용하여, 정제한 mRNA로부터 상보 DNA(complementary DNA)를 합성하고, 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여, gapdh(Rn01775763_g1, Applied biosystems), Hmox1(Rn01536933_m1, Applied biosystems), Nqo1(Rn00566528_m1, Applied biosystems)의 threshold cycle(CT) 값을 측정했다. 이어서, gapdh를 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 하여, NQO-1 및 HO-1의 상대적인 발현량(relative expression)을 각각 산출했다.

NQO-1의 결과를 도 9에 나타내고, HO-1의 결과를 도 10에 나타내었다. 엡셀렌을 10 μM 이상 첨가한 HBSS로 보존한 세포 시트는, 재배양 후 6시간에서 NQO-1 및 HO-1 모두 발현 상승이 확인되었다. 이 결과로부터, 엡셀렌의 첨가에 의해 Nrf2가 활성화한 결과, 세포보존 효과가 발현되고 있는 것이 시사되었다.

[실시예 7: 루시퍼라아제 형질전환 랫트 유래 구강점막세포 시트를 사용한 tBHQ 첨가 HBSS의 효과]

HBSS에 tBHQ를 첨가한 보존액을 사용하여 실시예 1과 동일하게 하여, 보존 후 7일째의 ATP 양을 측정했다. tBHQ의 농도는 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 3단계로 했다. 아무것도 첨가하지 않은 HBSS를 음성 콘트롤로 하고, 엡셀렌 첨가 HBSS(10 μM)를 양성 콘트롤로 했다.

결과를 도 11에 나타내었다. 도 11로부터 알 수 있는 바와 같이, HBSS에 tBHQ를 첨가함으로써, 보존 후 7일째의 ATP 잔존량의 증가가 확인되었다. 이 결과로부터, tBHQ도 엡셀렌과 동일하게 보존액에 첨가함으로써 세포의 생존율을 향상시키는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명은 상술한 각 실시형태 및 실시예에 한정되는 것이 아니며, 청구항에 나타낸 범위에서 다양한 변경이 가능하고, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 학술문헌 및 특허문헌의 모두가, 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.

Claims

Nrf2 활성화 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 조직 보존액으로서, 엡셀렌 및/또는 tert-부틸히드로퀴논을 함유하는 행크스 평형 염류 용액인 조직 보존액.
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제1항에 있어서, 엡셀렌을 함유하는 행크스 평형 염류 용액인 조직 보존액.
제1항 또는 제8항에 따른 조직 보존액을 보존 대상과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 조직 보존 방법.