JP5974093B2 - 組織保存液および組織保存方法 - Google Patents
組織保存液および組織保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5974093B2 JP5974093B2 JP2014526838A JP2014526838A JP5974093B2 JP 5974093 B2 JP5974093 B2 JP 5974093B2 JP 2014526838 A JP2014526838 A JP 2014526838A JP 2014526838 A JP2014526838 A JP 2014526838A JP 5974093 B2 JP5974093 B2 JP 5974093B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tissue
- solution
- cells
- hbss
- ebselen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 title claims description 65
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 47
- 102100031701 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Human genes 0.000 claims description 30
- DYEFUKCXAQOFHX-UHFFFAOYSA-N Ebselen Chemical compound [se]1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 DYEFUKCXAQOFHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 229950010033 ebselen Drugs 0.000 claims description 29
- 101000588302 Homo sapiens Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Proteins 0.000 claims description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 15
- BGNXCDMCOKJUMV-UHFFFAOYSA-N Tert-Butylhydroquinone Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(O)=CC=C1O BGNXCDMCOKJUMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004250 tert-Butylhydroquinone Substances 0.000 claims description 6
- 235000019281 tert-butylhydroquinone Nutrition 0.000 claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 99
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 91
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 43
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 12
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011824 transgenic rat model Methods 0.000 description 11
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001109714 Rhizobium meliloti (strain 1021) NAD(P)H dehydrogenase (quinone) 1 Proteins 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 108010018924 Heme Oxygenase-1 Proteins 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 102100028006 Heme oxygenase 1 Human genes 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 6
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 5
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 4
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- SUVMJBTUFCVSAD-UHFFFAOYSA-N sulforaphane Chemical compound CS(=O)CCCCN=C=S SUVMJBTUFCVSAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- XQZVZULJKVALRI-UHFFFAOYSA-N 1-isothiocyanato-6-(methylsulfinyl)hexane Chemical compound CS(=O)CCCCCCN=C=S XQZVZULJKVALRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- VHRUMKCAEVRUBK-GODQJPCRSA-N 15-deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin J2 Chemical compound CCCCC\C=C\C=C1/[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)C=CC1=O VHRUMKCAEVRUBK-GODQJPCRSA-N 0.000 description 2
- RZJSMTAJLZUPCT-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(3,5-dihydroxyphenoxy)-3,5-dihydroxyphenoxy]benzene-1,3,5-triol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(OC=2C(=CC(OC=3C(=CC(O)=CC=3O)O)=CC=2O)O)=C1 RZJSMTAJLZUPCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFECLJRYNAOWOI-UHFFFAOYSA-N 2-phenylpyran-4-one Chemical compound O=C1C=COC(C=2C=CC=CC=2)=C1 UFECLJRYNAOWOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WJXSWCUQABXPFS-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyanthranilic acid Chemical compound NC1=C(O)C=CC=C1C(O)=O WJXSWCUQABXPFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUVMJBTUFCVSAD-JTQLQIEISA-N 4-Methylsulfinylbutyl isothiocyanate Natural products C[S@](=O)CCCCN=C=S SUVMJBTUFCVSAD-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynonenal Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UBJVUCKUDDKUJF-UHFFFAOYSA-N Diallyl sulfide Chemical compound C=CCSCC=C UBJVUCKUDDKUJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150116862 KEAP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010071382 NF-E2-Related Factor 2 Proteins 0.000 description 2
- -1 OCT Compound Chemical class 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- GSLDEZOOOSBFGP-UHFFFAOYSA-N alpha-methylene gamma-butyrolactone Chemical compound C=C1CCOC1=O GSLDEZOOOSBFGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 2
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 2
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- UBAXRAHSPKWNCX-UHFFFAOYSA-N diallyl trisulfide Chemical compound C=CCSSSCC=C UBAXRAHSPKWNCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 2
- DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCO DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DECIPOUIJURFOJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyquin Chemical compound N1C(C)(C)C=C(C)C2=CC(OCC)=CC=C21 DECIPOUIJURFOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- XHEFDIBZLJXQHF-UHFFFAOYSA-N fisetin Chemical compound C=1C(O)=CC=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 XHEFDIBZLJXQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 2
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 2
- VCCRNZQBSJXYJD-UHFFFAOYSA-N galangin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=CC=C1 VCCRNZQBSJXYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- CKNAQFVBEHDJQV-UHFFFAOYSA-N oltipraz Chemical compound S1SC(=S)C(C)=C1C1=CN=CC=N1 CKNAQFVBEHDJQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 235000015487 sulforaphane Nutrition 0.000 description 2
- 229960005559 sulforaphane Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N (-)-Epigallocatechin-3-o-gallate Chemical compound O([C@@H]1CC2=C(O)C=C(C=C2O[C@@H]1C=1C=C(O)C(O)=C(O)C=1)O)C(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 1
- 229930014124 (-)-epigallocatechin gallate Natural products 0.000 description 1
- NRRBIAVXVIGMKC-AWOKGZDASA-N (1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-4,5-dihydroxy-1-methoxycyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound C1[C@](OC)(C(O)=O)C[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 NRRBIAVXVIGMKC-AWOKGZDASA-N 0.000 description 1
- UEPVWRDHSPMIAZ-IZTHOABVSA-N (1e,4z,6e)-5-hydroxy-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)hepta-1,4,6-trien-3-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(\O)=C\C(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)=C1 UEPVWRDHSPMIAZ-IZTHOABVSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- VUAFHZCUKUDDBC-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-[(2-methyl-2-sulfanylpropanoyl)amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(S)C(=O)N[C@H](CS)C(O)=O VUAFHZCUKUDDBC-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- XIUNPAFIOWRAIO-HZJYTTRNSA-N (9z,12z)-2-nitrooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCC(C(O)=O)[N+]([O-])=O XIUNPAFIOWRAIO-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- ZOKAXJSLKDRFAW-MDZDMXLPSA-N (E)-3-phenyl-1-[2,4,6-tris(methoxymethoxy)phenyl]prop-2-en-1-one Chemical compound COCOC1=CC(OCOC)=CC(OCOC)=C1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 ZOKAXJSLKDRFAW-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N (R)-lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC[C@@H]1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- QJYNZEYHSMRWBK-XCEMISLISA-N 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-beta-D-glucose Natural products O=C(OC[C@H]1[C@@H](OC(=O)c2cc(O)c(O)c(O)c2)[C@H](OC(=O)c2cc(O)c(O)c(O)c2)[C@@H](OC(=O)c2cc(O)c(O)c(O)c2)[C@@H](OC(=O)c2cc(O)c(O)c(O)c2)O1)c1cc(O)c(O)c(O)c1 QJYNZEYHSMRWBK-XCEMISLISA-N 0.000 description 1
- 229920002793 1,2,3,4,6-Pentagalloyl glucose Polymers 0.000 description 1
- QJYNZEYHSMRWBK-NIKIMHBISA-N 1,2,3,4,6-pentakis-O-galloyl-beta-D-glucose Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)=C1 QJYNZEYHSMRWBK-NIKIMHBISA-N 0.000 description 1
- YNVAHBUBGBLIEY-UHFFFAOYSA-N 1,5-bis(2-hydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one Chemical compound OC1=CC=CC=C1C=CC(=O)C=CC1=CC=CC=C1O YNVAHBUBGBLIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTYWJBMBGFMTQG-UHFFFAOYSA-N 1-(4-methyl-5-oxooxolan-3-yl)ethyl acetate Chemical compound CC(=O)OC(C)C1COC(=O)C1C UTYWJBMBGFMTQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRRDCQRLWOKTBN-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-3-yl)-5-methylidene-1-azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol Chemical compound C1=CC=C2C(C3N4CCC(C(C4)=C)C3O)=CNC2=C1 BRRDCQRLWOKTBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFNRDWSKKNGFGN-UHFFFAOYSA-N 2-(2-formylpyrrol-1-yl)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)N1C=CC=C1C=O IFNRDWSKKNGFGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFTDMXLIJXJGAS-UHFFFAOYSA-N 2-(5-ethyloxolan-2-yl)acetic acid Chemical compound CCC1CCC(CC(O)=O)O1 IFTDMXLIJXJGAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKXFYHZSOIALRM-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-5-(3-methylbut-2-enyl)-4-(4-methylpent-3-enoyl)-2-(2-methylpropanoyl)cyclopent-2-en-1-one Chemical compound CC(C)C(=O)C1=C(O)C(O)(C(=O)CC=C(C)C)C(CC=C(C)C)C1=O KKXFYHZSOIALRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWVRJTMFETXNAD-FWCWNIRPSA-N 3-O-Caffeoylquinic acid Natural products O[C@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-FWCWNIRPSA-N 0.000 description 1
- WZGGLCJULKAURB-UHFFFAOYSA-N 4-(1-hydroxyethyl)-3-methyloxolan-2-one Chemical compound CC(O)C1COC(=O)C1C WZGGLCJULKAURB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKBQWVMXPGSNTK-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-3-methyloxolan-2-one Chemical compound CC1C(C(C)=O)COC1=O QKBQWVMXPGSNTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOZFCKXEVSGWGS-ZHIYBZGJSA-N 4-hydroxy-17beta-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O QOZFCKXEVSGWGS-ZHIYBZGJSA-N 0.000 description 1
- YFNSPPHTAARSPD-UHFFFAOYSA-N 4-phenyloxolan-2-one Chemical compound C1OC(=O)CC1C1=CC=CC=C1 YFNSPPHTAARSPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- PZIRUHCJZBGLDY-UHFFFAOYSA-N Caffeoylquinic acid Natural products CC(CCC(=O)C(C)C1C(=O)CC2C3CC(O)C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(=O)O PZIRUHCJZBGLDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N Carnosic acid Natural products CC([C@@H]1CC2)(C)CCC[C@]1(C(O)=O)C1=C2C=C(C(C)C)C(O)=C1O QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N 0.000 description 1
- XUSYGBPHQBWGAD-PJSUUKDQSA-N Carnosol Chemical compound CC([C@@H]1C2)(C)CCC[C@@]11C(=O)O[C@@H]2C2=C1C(O)=C(O)C(C(C)C)=C2 XUSYGBPHQBWGAD-PJSUUKDQSA-N 0.000 description 1
- MMFRMKXYTWBMOM-UHFFFAOYSA-N Carnosol Natural products CCc1cc2C3CC4C(C)(C)CCCC4(C(=O)O3)c2c(O)c1O MMFRMKXYTWBMOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- HJTVQHVGMGKONQ-LUZURFALSA-N Curcumin II Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)=C1 HJTVQHVGMGKONQ-LUZURFALSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005892 Deltamethrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004258 Ethoxyquin Substances 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N GCG Natural products C=1C(O)=C(O)C(O)=CC=1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2CC1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 WMBWREPUVVBILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 241001272178 Glires Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 101150044653 HMOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016761 Haem oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108050006318 Haem oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 108010061414 Hepatocyte Nuclear Factor 1-beta Proteins 0.000 description 1
- 102100022123 Hepatocyte nuclear factor 1-beta Human genes 0.000 description 1
- OVSQVDMCBVZWGM-IDRAQACASA-N Hirsutrin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)C1=C(c2cc(O)c(O)cc2)Oc2c(c(O)cc(O)c2)C1=O OVSQVDMCBVZWGM-IDRAQACASA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- FVQOMEDMFUMIMO-UHFFFAOYSA-N Hyperosid Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 FVQOMEDMFUMIMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193815 Isohumulone Natural products 0.000 description 1
- YKGCBLWILMDSAV-GOSISDBHSA-N Isoxanthohumol Natural products O(C)c1c2C(=O)C[C@H](c3ccc(O)cc3)Oc2c(C/C=C(\C)/C)c(O)c1 YKGCBLWILMDSAV-GOSISDBHSA-N 0.000 description 1
- JEKMKNDURXDJAD-UHFFFAOYSA-N Kahweol Natural products C1CC2(CC3(CO)O)CC3CCC2C2(C)C1C(C=CO1)=C1C=C2 JEKMKNDURXDJAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- NRRBIAVXVIGMKC-UHFFFAOYSA-N MCGA3 Natural products C1C(OC)(C(O)=O)CC(O)C(O)C1OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C(O)=C1 NRRBIAVXVIGMKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- MZSGWZGPESCJAN-MOBFUUNNSA-N Melitric acid A Natural products O([C@@H](C(=O)O)Cc1cc(O)c(O)cc1)C(=O)/C=C/c1cc(O)c(O/C(/C(=O)O)=C/c2cc(O)c(O)cc2)cc1 MZSGWZGPESCJAN-MOBFUUNNSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 102000007561 NF-E2-Related Factor 2 Human genes 0.000 description 1
- CWVRJTMFETXNAD-KLZCAUPSSA-N Neochlorogenin-saeure Natural products O[C@H]1C[C@@](O)(C[C@@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O CWVRJTMFETXNAD-KLZCAUPSSA-N 0.000 description 1
- 101710114687 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Proteins 0.000 description 1
- RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N O-acetyl-L-carnitine Chemical compound CC(=O)O[C@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149118 Quinone oxidoreductase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108700042768 University of Wisconsin-lactobionate solution Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- VDFOMVRWDSKWSL-UHFFFAOYSA-N Zerumbone Natural products CC1=C2CC(C)(C)C=C2C(=O)C(=CCC1)C VDFOMVRWDSKWSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001009 acetylcarnitine Drugs 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229930185474 acteoside Natural products 0.000 description 1
- FBSKJMQYURKNSU-ZLSOWSIRSA-N acteoside Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC(=O)\C=C\C=2C=C(O)C(O)=CC=2)[C@@H](CO)O[C@@H](OCCC=2C=C(O)C(O)=CC=2)[C@@H]1O FBSKJMQYURKNSU-ZLSOWSIRSA-N 0.000 description 1
- FBSKJMQYURKNSU-UKQWSTALSA-N acteoside I Natural products C[C@@H]1O[C@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](OCCc3ccc(O)c(O)c3)O[C@H](CO)[C@H]2OC(=O)C=Cc4ccc(O)c(O)c4)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FBSKJMQYURKNSU-UKQWSTALSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N alpha-Lipoic acid Natural products OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- VMWNQDUVQKEIOC-CYBMUJFWSA-N apomorphine Chemical compound C([C@H]1N(C)CC2)C3=CC=C(O)C(O)=C3C3=C1C2=CC=C3 VMWNQDUVQKEIOC-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- 229960004046 apomorphine Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- JYTVKRNTTALBBZ-UHFFFAOYSA-N bis demethoxycurcumin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C=CC(=O)CC(=O)C=CC1=CC=CC(O)=C1 JYTVKRNTTALBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PREBVFJICNPEKM-YDWXAUTNSA-N bisdemethoxycurcumin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 PREBVFJICNPEKM-YDWXAUTNSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229960004272 bucillamine Drugs 0.000 description 1
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 description 1
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000004654 carnosol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940074393 chlorogenic acid Drugs 0.000 description 1
- CWVRJTMFETXNAD-JUHZACGLSA-N chlorogenic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-JUHZACGLSA-N 0.000 description 1
- FFQSDFBBSXGVKF-KHSQJDLVSA-N chlorogenic acid Natural products O[C@@H]1C[C@](O)(C[C@@H](CC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O FFQSDFBBSXGVKF-KHSQJDLVSA-N 0.000 description 1
- 235000001368 chlorogenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- BMRSEYFENKXDIS-KLZCAUPSSA-N cis-3-O-p-coumaroylquinic acid Natural products O[C@H]1C[C@@](O)(C[C@@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)cc2)[C@@H]1O)C(=O)O BMRSEYFENKXDIS-KLZCAUPSSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 229960002483 decamethrin Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N deltamethrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](C=C(Br)Br)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N 0.000 description 1
- NMRUIRRIQNAQEB-UHFFFAOYSA-N demethoxycurcumin Natural products OC(=CC(C=CC1=CC(=C(C=C1)O)OC)=O)C=CC1=CC=C(C=C1)O NMRUIRRIQNAQEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUSADYLVRMROPL-UHFFFAOYSA-N demethylxanthohumol Natural products CC(C)=CCC1=C(O)C=C(O)C(C(=O)C=CC=2C=CC(O)=CC=2)=C1O FUSADYLVRMROPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 1
- YXAKCQIIROBKOP-UHFFFAOYSA-N di-p-hydroxycinnamoylmethane Natural products C=1C=C(O)C=CC=1C=CC(=O)C=C(O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 YXAKCQIIROBKOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- SBHXYTNGIZCORC-ZDUSSCGKSA-N eriodictyol Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)O)=CC=C(O)C(O)=C1 SBHXYTNGIZCORC-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- TUJPOVKMHCLXEL-UHFFFAOYSA-N eriodictyol Natural products C1C(=O)C2=CC(O)=CC(O)=C2OC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 TUJPOVKMHCLXEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011797 eriodictyol Nutrition 0.000 description 1
- SBHXYTNGIZCORC-UHFFFAOYSA-N eriodyctiol Natural products O1C2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 SBHXYTNGIZCORC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 235000019285 ethoxyquin Nutrition 0.000 description 1
- 229940093500 ethoxyquin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011990 fisetin Nutrition 0.000 description 1
- SMANXXCATUTDDT-QPJJXVBHSA-N flunarizine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(C=1C=CC(F)=CC=1)N1CCN(C\C=C\C=2C=CC=CC=2)CC1 SMANXXCATUTDDT-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- 229960000326 flunarizine Drugs 0.000 description 1
- CIPSYTVGZURWPT-UHFFFAOYSA-N galangin Natural products OC1=C(Oc2cc(O)c(O)cc2C1=O)c3ccccc3 CIPSYTVGZURWPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- ALRFYJWUVHBXLV-UHFFFAOYSA-N guaijaverin Natural products OC1COC(COC2=C(Oc3cc(O)cc(O)c3C2=O)c4ccc(O)c(O)c4)C(O)C1O ALRFYJWUVHBXLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- QARXXMMQVDCYGZ-UHFFFAOYSA-N isohumulone Chemical compound CC(C)CC(=O)C1=C(O)C(O)(C(=O)CC=C(C)C)C(CC=C(C)C)C1=O QARXXMMQVDCYGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- GXMWXESSGGEWEM-UHFFFAOYSA-N isoquercitrin Natural products OCC(O)C1OC(OC2C(Oc3cc(O)cc(O)c3C2=O)c4ccc(O)c(O)c4)C(O)C1O GXMWXESSGGEWEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSBHOJSEFZPTET-UHFFFAOYSA-N isorhamnetin 3-O-galactoside Natural products OCC1OC(OC2=C(Oc3c(O)ccc(O)c3C2=O)c4ccc(O)c(O)c4)C(O)C(O)C1O MSBHOJSEFZPTET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEKMKNDURXDJAD-HWUKTEKMSA-N kahweol Chemical compound C([C@@H]1C[C@]2(C[C@@]1(CO)O)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1C(C=CO1)=C1C=C2 JEKMKNDURXDJAD-HWUKTEKMSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N luteolin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N luteolin Natural products OC1=CC(O)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009498 luteolin Nutrition 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150075804 nqo1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 229950008687 oltipraz Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- UEPVWRDHSPMIAZ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxycinnamoyl feruloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(O)=CC(=O)C=CC=2C=CC(O)=CC=2)=C1 UEPVWRDHSPMIAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000002379 periodontal ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 description 1
- IZJDOKYDEWTZSO-UHFFFAOYSA-N phenethyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NCCC1=CC=CC=C1 IZJDOKYDEWTZSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- SUYJZKRQHBQNCA-UHFFFAOYSA-N pinobanksin Natural products O1C2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C(O)C1C1=CC=CC=C1 SUYJZKRQHBQNCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019100 piperine Nutrition 0.000 description 1
- MXXWOMGUGJBKIW-YPCIICBESA-N piperine Chemical compound C=1C=C2OCOC2=CC=1/C=C/C=C/C(=O)N1CCCCC1 MXXWOMGUGJBKIW-YPCIICBESA-N 0.000 description 1
- 229940075559 piperine Drugs 0.000 description 1
- WVWHRXVVAYXKDE-UHFFFAOYSA-N piperine Natural products O=C(C=CC=Cc1ccc2OCOc2c1)C3CCCCN3 WVWHRXVVAYXKDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- OVSQVDMCBVZWGM-QSOFNFLRSA-N quercetin 3-O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OVSQVDMCBVZWGM-QSOFNFLRSA-N 0.000 description 1
- KRXANNXAPJODKJ-UHFFFAOYSA-N quercetin 3-O-beta-D-glucopyranoside Natural products OCC1OC(COC2=C(Oc3cc(O)cc(O)c3C2=O)c4ccc(O)c(O)c4)C(O)C(O)C1O KRXANNXAPJODKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BBFYUPYFXSSMNV-UHFFFAOYSA-N quercetin-7-o-galactoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(O)=C(C=3C=C(O)C(O)=CC=3)OC2=C1 BBFYUPYFXSSMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 description 1
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- RVJVDCVIJCBUTH-UHFFFAOYSA-M sodium;5-amino-2h-phthalazin-3-ide-1,4-dione Chemical compound [Na+].O=C1N[N-]C(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 RVJVDCVIJCBUTH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000005127 stratified epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- OXFVHFABBAINFL-UHFFFAOYSA-N triphloroethol B Natural products OC1=CC(O)=CC(O)=C1OC1=CC(O)=CC(O)=C1OC1=CC(O)=CC(O)=C1 OXFVHFABBAINFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- QFRYQWYZSQDFOS-UHFFFAOYSA-N verbascoside Natural products CC1OC(COC2C(O)C(COC3OC(C(O)C(O)C3O)C(=O)O)OC(Oc4cc(O)cc5OC(=CC(=O)c45)c6ccc(O)c(O)c6)C2O)C(O)C(O)C1O QFRYQWYZSQDFOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- UVBDKJHYMQEAQV-UHFFFAOYSA-N xanthohumol Natural products OC1=C(CC=C(C)C)C(OC)=CC(OC)=C1C(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 UVBDKJHYMQEAQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008209 xanthohumol Nutrition 0.000 description 1
- ORXQGKIUCDPEAJ-YRNVUSSQSA-N xanthohumol Chemical compound COC1=CC(O)=C(CC=C(C)C)C(O)=C1C(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 ORXQGKIUCDPEAJ-YRNVUSSQSA-N 0.000 description 1
- GIHNTRQPEMKFKO-SKTNYSRSSA-N zerumbone Chemical compound C\C1=C/CC(C)(C)\C=C\C(=O)\C(C)=C\CC1 GIHNTRQPEMKFKO-SKTNYSRSSA-N 0.000 description 1
- GIHNTRQPEMKFKO-UHFFFAOYSA-N zurembone Natural products CC1=CCC(C)(C)C=CC(=O)C(C)=CCC1 GIHNTRQPEMKFKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、生物を構成する組織、臓器、細胞等を保存するための組織保存液および組織保存方法に関するものである。
角膜、心臓、表皮などの分野においては、既存の治療法が有効でない重症疾患や難治性疾患に対して、患者自身の細胞を用いて作製した培養細胞シート等を用いた再生治療法が開発されており、既に臨床応用が行われている。例えば角膜分野においても、患者自身の口腔粘膜上皮や輪部上皮に存在する前駆細胞を用いて作製した培養上皮シートの移植が行われており、複数の施設において本治療法が難治性角膜疾患に極めて有効であることが実証されている。このような培養細胞シートを用いる再生治療法をより多くの患者に適用するためには、製造施設において培養上皮細胞シートを製造し、各病院へ輸送し、一定期間保存できることが重要である。また、産業化を想定した場合においては、細胞シートを一定期間保存する技術はさらに重要性が増す。
また、免疫抑制剤の進歩等により組織移植の重要性も増している。組織移植においては、組織提供者（ドナー）から摘出された組織が直ちに受容者（レシピエント）に移植されるのが理想的ではあるが、必ずしも直ちに移植できるとは限らない。そのため、摘出した組織を一定期間保存する技術は非常に重要である。したがって、今後の再生医療や組織移植の普及に当たっては、細胞シート等の再生医療製品や移植用組織（細胞、臓器を含む）の保存液の開発が必須である。
従来の組織保存液としては、例えばユーロ−コリンズ液（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液）、ＵＷ液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液、特許文献１）、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液（特許文献２）などが知られている。
本発明は、生物を構成する組織、臓器、細胞等の保存性に優れ、再生医療、移植医療等の分野において有用な組織保存液を提供することを課題とする。
本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液。
［２］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、親電子性物質であることを特徴とする前記［１］に記載の組織保存液。
［３］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の組織保存液。
［４］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するハンクス平衡塩類溶液である前記［１］に記載の組織保存液。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
［６］ハンクス平衡塩類溶液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
［１］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液。
［２］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、親電子性物質であることを特徴とする前記［１］に記載の組織保存液。
［３］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の組織保存液。
［４］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するハンクス平衡塩類溶液である前記［１］に記載の組織保存液。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
［６］ハンクス平衡塩類溶液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
本発明により、生物を構成する組織、臓器、細胞等の保存性に優れ、再生医療、移植医療等の分野において有用な組織保存液を提供することができる。
〔組織保存液〕
本発明は、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有する組織保存液を提供する。
本発明の組織保存溶液の保存対象には、生物を構成する全ての組織、臓器、細胞等が含まれ、いわゆる狭義の組織に限定されるものではない。保存対象の細胞には、組織や臓器を構成する細胞が含まれ、分散された状態の細胞も含まれる。組織としては、例えば、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などが挙げられる。臓器としては、例えば、脳、脊髄、胃、膵臓、膵島、腎臓、肝臓、甲状腺、骨髄、皮膚、筋肉、肺、消化管（例えば、大腸、小腸など）、血管、心臓、胸腺、脾臓、末梢血、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、骨格筋などが挙げ得られる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、膵β細胞、骨髄細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 （例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球など）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞などが挙げられる。また、不妊治療などに用いる精子、卵子、受精卵なども本発明の保存液の保存対象として好適である。また、これら細胞の前駆細胞、幹細胞（間葉系幹細胞、神経前駆細胞、造血幹細胞など）、がん細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞なども保存対象として好適である。さらに、培養技術を利用して調製した再生医療用製品も保存対象として好適である。再生医療用製品としては、例えば、培養皮膚、培養軟骨、培養角膜上皮、各種細胞シート（例えば、培養表皮細胞シート、口腔粘膜細胞シート、角膜輪部上皮細胞シート、角膜内皮細胞シート、心筋シート、筋芽細胞シート、培養軟骨細胞シート、膵島細胞シート、肝細胞シート、繊維芽細胞シート、歯根膜細胞シートなど）、再生医療用の各種培養細胞などが挙げられる。
本発明は、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有する組織保存液を提供する。
本発明の組織保存溶液の保存対象には、生物を構成する全ての組織、臓器、細胞等が含まれ、いわゆる狭義の組織に限定されるものではない。保存対象の細胞には、組織や臓器を構成する細胞が含まれ、分散された状態の細胞も含まれる。組織としては、例えば、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などが挙げられる。臓器としては、例えば、脳、脊髄、胃、膵臓、膵島、腎臓、肝臓、甲状腺、骨髄、皮膚、筋肉、肺、消化管（例えば、大腸、小腸など）、血管、心臓、胸腺、脾臓、末梢血、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、骨格筋などが挙げ得られる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、膵β細胞、骨髄細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 （例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球など）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞などが挙げられる。また、不妊治療などに用いる精子、卵子、受精卵なども本発明の保存液の保存対象として好適である。また、これら細胞の前駆細胞、幹細胞（間葉系幹細胞、神経前駆細胞、造血幹細胞など）、がん細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞なども保存対象として好適である。さらに、培養技術を利用して調製した再生医療用製品も保存対象として好適である。再生医療用製品としては、例えば、培養皮膚、培養軟骨、培養角膜上皮、各種細胞シート（例えば、培養表皮細胞シート、口腔粘膜細胞シート、角膜輪部上皮細胞シート、角膜内皮細胞シート、心筋シート、筋芽細胞シート、培養軟骨細胞シート、膵島細胞シート、肝細胞シート、繊維芽細胞シート、歯根膜細胞シートなど）、再生医療用の各種培養細胞などが挙げられる。
保存対象は、どのような生物由来であってもよい。好ましくは動物由来であり、より好ましくは脊椎動物由来であり、さらに好ましくは哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット動物、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。中でもヒト由来であることが特に好ましい。
本発明の組織保存液は、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するものであればよい。Ｎｒｆ２は、哺乳類に存在する塩基性ロイシンジッパー（ｂａｓｉｃ−ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）モチーフを有する転写因子の１つで、ＮＦ−Ｅ２関連因子２、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２、 Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｌｉｋｅ ２ （Ｎｆｅ２ｌ２）、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｈｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２などとも称される（Proc Natl Acad Sci U S A. 91 9926-30 (1994); Biochem Biophys Res Commun. 209 40-6 (1995); 生化学 78 79-92 (2006)）。
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物は、Ｎｒｆ２活性化剤と同義であり、転写因子Ｎｒｆ２を活性化する作用を有するものであれば特に制限されない。例えば、Ｎｒｆ２活性化剤として以下の食品成分または医薬関連成分が知られている。
食品成分：スルフォラファン(J Nutr. 131 (Suppl 11) 3027S-33S (2001))、tert-ブチルヒドロキノン(TBHQ)(Toxicol. Appl. Pharmacol. 141 59-67 (1996))、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)(Mol Carcinog. 45 841-50 (2006)、Biochem Soc Trans. 28 (2000)、Toxicol. Appl. Pharmacol. 126, 150-55 (1994))、6-エトキシ-1,2-ジヒドロ-2,2,4-トリメチルキノリン(エトキシキン)(Biochem Soc Trans. 28 (2000))、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート(6-HITC) (J.Biol.Chem. 277 3456-63 (2002))、カフェストール (Food Chem Toxicol. 40 1155-63 (2002))、カウェオール（kahweol）(Food Chem Toxicol.40 1155-63 (2002))、クルクミン(Biochem J. 371 887-95 (2003)、Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 E645-55 (2007))、デメトキシクルクミン(Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 E645-55 (2007))、ビスデメトキシクルクミン(Am J Physiol Endocrinol Metab. in press (2007))、ピペリン(J Nutr Biochem. 18 615-22 (2007))、フェネチルイソチオシアネート(Pharm Res. 20 1351-6 (2003))、カルノソール(carnosol)(J Biol Chem. 279 8919-29 (2004))、ゼルンボン(zerumbone)(FEBS Lett. 572 245-50 (2004))、レスベラトロール(Biochem Biophys Res Commun. 331 993-1000 (2005))、リコピン(Mol CancerTher. 4 177-86 (2005))、硫化ジアリル(Free Radic Biol Med. 37 1578-90 (2004)、Arch Biochem Biophys. 432 252-60 (2004))、三硫化ジアリル(Free Radic Biol Med. 37 1578-90 (2004))、キサントフモル(Chem Res Toxicol. 18 1296-305 (2005))、3-O-カフェオイル-1-メチルキナ酸（methylquinic acid）（Free Radic Biol Med. 40 1349-61 (2006)）、クロロゲン酸(J Biol Chem. 280 27888-95 (2005))、α-リポ酸(Proc Natl Acad Sci U S A. 101 3381-6 (2004))、アセチルカルニチン(J Neurosci Res. 79 509-21 (2005))、アヴィシンス(avicins)(J Clin Invest. 113 65-73 (2004))、フィセチン(fisetin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、ルテオリン（luteolin）(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、エリオジクチオール(eriodictyol)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、ガランギン(galangin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、エピガロカテキン-3-ガレート(Pharm Res. 22 1805-20 (2005))、ケルセチン(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006)、Free Radic Biol Med.42 1690-703 (2007))、ケルセチン3-O-β-L-アラビノピラノシド(Food Chem Toxicol. 44 1299-307 (2006))、ケルセチン3-O-β-D-グルコピラノシド(Food Chem Toxicol. 44 12 99-307 (2006))、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-β-D-グルコース(World J Gastroenterol. 12 214-21 (2006))、アクテオシド(Pharmazie. 61 356-8 (2006))、イソフムロン(PCT/JP2005/019415)、イソコフムロン（PCT/JP2005/019415）、4-アセチル-3-メチル-ジヒドロ-フラン-2-オン、4-（1-ヒドロキシ-エチル）-3-メチル-ジヒドロ-フラン-2-オン、5-ヒドロキシ-3, 4, 5-トリメチル-5-H-フラン-2-オン、酢酸1-（4-メチル-5-オキソ-テトラヒドロ-フラン-3-イル）-エチルエステル、（5-エチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル）-酢酸、2-フェニル-ピラン-4-オン、ジヒドロ-4-フェニル-2（3H）-フラノン、2-（2-ホルミルピロール-1-イル）-4-メチル吉草酸（特願2007-043783）、デヒドロコスタスラクトン(Eur J Pharmacol. 565 37-44 (2007))、トリフロレトールA（triphlorethol-A）(FEBS Lett. 581 2000-8 (2007))など。
医薬関連成分：oltipraz(4-メチル-5-[2-ピラジニル]-1,2-ジチオール-3-チオン)(Proc Natl Acad Sci USA 98 3410-5 (2001))、アセタミノフェン(Hepatology 39 1267-76 (2004))、アスピリン（Carcinogenesis 27, 803-10(2006)）、フルナリジン(Cell Death Differ. 13 1763-75(2006))、α-ルミノール一ナトリウム(Galavit)(J Virol. 80(9):4557-69 (2006))、アポモルフィン(J Neurosci Res. 84 860-6.(2006))、ブシラミン(Biochem Pharmacol. 72 455-62 (2006))、エブセレン(Chem Res Toxicol. 19 1196-204 (2004))、デルタメトリン(Toxicol Lett. 171 87-98 (2007)、15-デオキシ-Δ(12,14)-プロスタグランジンJ2(15d-PGJ2)(J Biol Chem. 275 11291-9 (2000))、4-ヒドロキシ-2-ノネナール(Circ Res. 94 609-16 (2004))、2-インドール-3-イル-メチレンキヌクリジン-3-オール(Cancer Res. 63 5636-45 (2003))、4-ヒドロキシエストラジオール(Biochim Biophys Acta. 1629 92-101 (2003))、3',4',5',3,4,5-ヘキサメトキシ-カルコン(Br J Pharmacol. 142 1191-9 (2004))、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)-ジエン-28-酸(Cancer Res. 65 4789-98 (2005))、1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)-ジエノ-28-イル]イミダゾール(Cancer Res. 65 4789-98 (2005))、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(Eur J Pharmacol. 56537-44 (2007))、ニトロ-リノール酸(Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 H770-6 (2007))、3-ヒドロキシアントラニル酸(Atherosclerosis. 187 274-84 (2006))、ビス(2-ヒドロキシベンジリデン)アセトン(Cancer Lett. 245 341-9 (2007))、2',4',6'-トリス(メトキシメトキシ)カルコン(Biochem Pharmacol. 74 870-80 (2007))など。
本発明の組織保存液は、上記のようなＮｒｆ２活性化作用を有する化合物の１種以上を含有するものであればよい。Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物の中でも、親電子性物質が好ましい。親電子性物質は、分子中に極性の偏りによる電子密度の低い部位をもつ分子である。親電子性物質が、非ストレス状態の細胞においてＮｒｆ２の抑制に働くＫｅａｐ１を刺激することにより、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１から開放されて活性化する。上記Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物のうち、親電子性物質としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（以下「ｔＢＨＱ」と記す）、エブセレン、スルフォラファン、クルクミンなどが挙げられる。なかでも好ましくはｔＢＨＱおよびエブセレンである。
本発明の組織保存液は、基礎となる保存溶液（基礎保存溶液）にＮｒｆ２活性化作用を有する化合物を１種または２種以上添加し、溶解することにより製造することができる。例えば、滅菌済みの基礎保存溶液にＮｒｆ２活性化作用を有する化合物を無菌的に添加して製造してもよく、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を添加した後に滅菌処理を行ってもよい。滅菌にはオートクレーブ滅菌、ろ過滅菌等の公知の滅菌法を用いることができる。製造された組織保存液は、使用時まで約２〜８℃の低温で保管することが好ましい。
本発明の組織保存液におけるＮｒｆ２活性化作用を有する化合物の含量は、保存する組織に対して毒性を示さない含量であれば特に限定されない。用いるＮｒｆ２活性化作用を有する化合物に応じて、適宜至適含量を設定すればよい。例えば、エブセレンを単独で用いる場合、０．１μＭ〜１００μＭが好ましく、より好ましくは０．５μＭ〜５０μＭであり、さらに好ましくは１μＭ〜１０μＭである。また、ｔＢＨＱを単独で用いる場合、０．１μＭ〜１００μＭが好ましく、より好ましくは０．５μＭ〜５０μＭ、さらに好ましくは１μＭ〜１０μＭである。
基礎保存溶液は特に限定されず、一般的な緩衝液、生理的緩衝液、平衡塩類溶液、細胞培養用の基礎保存溶液、組織保存液等の公知の溶液から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、生理食塩液、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液（以下「ＨＢＳＳ」と記す）、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＭＥＭ−α、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０、ユーロ−コリンズ液、ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）などが挙げられる。好ましくは、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）であり、より好ましくは、ＨＢＳＳおよびＵＷである。本発明の組織保存液は、保存中の組織の膨張または収縮するのを防ぐために、浸透圧が約２７０〜約４５０Ｏｓｍ／ｌの範囲にあることが好ましい。また、細胞の酸性分解を防止するために、ｐＨが約７〜８の範囲にあることが好ましい。
〔組織保存方法〕
本発明は、上記本発明の組織保存液を用いる組織保存方法を提供する。本発明の組織保存方法は、本発明の組織保存液を保存対象の組織、臓器、細胞等と接触させるものであればよい。
本発明の組織保存方法の第１の実施形態は、保存対象の組織、臓器、細胞等を本発明の組織保存液に浸漬することにより、保存液と保存対象とを接触させて組織、臓器、細胞等を保存する方法である。保存対象に対する保存液の量は特に限定されないが、保存対象が完全に浸漬する量以上の量であればよい。
容器は特に限定されず、密封容器および解放容器のいずれも使用可能である。目的に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、好気条件（酸素、二酸化炭素、窒素などの気体が自由に通気可能な条件）を維持できる容器である。
保存温度は特に限定されないが、−１９６℃〜２０℃の範囲が好ましく、より好ましくは−２０℃〜１５℃、さらに好ましくは０℃〜１０℃である。なお、本発明の組織保存液中に保存対象を浸漬して凍結保存する場合は、所望により組織保存液に公知の凍結保護剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセリン等）を添加してもよい。
保存期間は目的に応じて適宜設定することができる。通常数分〜３か月程度の保存期間を設定することができる。好ましくは３０分〜１か月程度であり、より好ましくは３０分〜２０日間程度である。
本発明は、上記本発明の組織保存液を用いる組織保存方法を提供する。本発明の組織保存方法は、本発明の組織保存液を保存対象の組織、臓器、細胞等と接触させるものであればよい。
本発明の組織保存方法の第１の実施形態は、保存対象の組織、臓器、細胞等を本発明の組織保存液に浸漬することにより、保存液と保存対象とを接触させて組織、臓器、細胞等を保存する方法である。保存対象に対する保存液の量は特に限定されないが、保存対象が完全に浸漬する量以上の量であればよい。
容器は特に限定されず、密封容器および解放容器のいずれも使用可能である。目的に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、好気条件（酸素、二酸化炭素、窒素などの気体が自由に通気可能な条件）を維持できる容器である。
保存温度は特に限定されないが、−１９６℃〜２０℃の範囲が好ましく、より好ましくは−２０℃〜１５℃、さらに好ましくは０℃〜１０℃である。なお、本発明の組織保存液中に保存対象を浸漬して凍結保存する場合は、所望により組織保存液に公知の凍結保護剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセリン等）を添加してもよい。
保存期間は目的に応じて適宜設定することができる。通常数分〜３か月程度の保存期間を設定することができる。好ましくは３０分〜１か月程度であり、より好ましくは３０分〜２０日間程度である。
本発明の組織保存方法の第２の実施形態は、保存対象の組織の表面に本発明の組織保存液を散布等することにより保存液と組織とを接触させて組織を保存する方法である。第２の実施形態は、本発明の組織保存液を切開手術や内視鏡手術における組織洗浄液または潅流液として使用する場合の形態である。第２の実施形態は、生体の組織をそのままの状態で短時間保存する場合に適している。第２の実施形態の保存期間は、通常１分〜１０時間程度、好ましくは５分〜５時間程度、より好ましくは５分〜２時間程度である。保存期間中は、組織の表面に本発明の組織保存液を散布、潅流等することにより、組織の表面と本発明の組織保存液との接触状態を維持すればよい。
本発明者らは、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を添加していないＨＢＳＳに組織（細胞シート）を保存したところ、既存の組織保存液を用いた場合より保存後のＡＴＰ残存量（細胞生存率）および再培養後のＡＴＰ残存量（細胞生存率）が高いことを新たに見出した。つまり、ＨＢＳＳは既存の組織保存液より組織保存性に優れていることを新たに見出した（実施例１参照）。それゆえ、本発明は、ＨＢＳＳを組織と接触させることを特徴とする組織保存方法を提供する。ＨＢＳＳを用いる組織保存方法は、上記と同様の形態で実施することができる。
〔本発明の有用性〕
本発明の組織保存液を用いれば、既存の組織保存液を用いた場合より保存後の細胞生存率が高いことが示された。また、本発明の組織保存液にブタ角膜組織を２週間保存しても組織形態が維持されることを確認した。このように、本発明の保存液は、既存の組織保存液より組織保存性が極めて優れており、組織保存液として非常に有用である。それゆえ、移植医療分野に本発明の組織保存液を用いれば、組織提供者（ドナー）から摘出された組織を一定期間保存できるので、遠隔地の受容者（レシピエント）に移植することが可能となる。また、再生医療分野に本発明の組織保存液を用いれば、製造施設で製造した培養細胞シート等の再生医療製品を一定期間保存することができるので、再生治療法をより多くの患者に適用することが可能となる。また、本発明の組織保存液は、細胞の生存率を高く維持することが可能であるため、細胞の生存状態が極めて重要である不妊治療法の成績を向上させることができる。さらに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の保存液としても有用である。
本発明の組織保存液を用いれば、既存の組織保存液を用いた場合より保存後の細胞生存率が高いことが示された。また、本発明の組織保存液にブタ角膜組織を２週間保存しても組織形態が維持されることを確認した。このように、本発明の保存液は、既存の組織保存液より組織保存性が極めて優れており、組織保存液として非常に有用である。それゆえ、移植医療分野に本発明の組織保存液を用いれば、組織提供者（ドナー）から摘出された組織を一定期間保存できるので、遠隔地の受容者（レシピエント）に移植することが可能となる。また、再生医療分野に本発明の組織保存液を用いれば、製造施設で製造した培養細胞シート等の再生医療製品を一定期間保存することができるので、再生治療法をより多くの患者に適用することが可能となる。また、本発明の組織保存液は、細胞の生存率を高く維持することが可能であるため、細胞の生存状態が極めて重要である不妊治療法の成績を向上させることができる。さらに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の保存液としても有用である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：ルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを用いた基礎保存溶液のスクリーニング〕
（１）細胞シートの作製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ（Ｈａｋａｍａｔａ Ｙ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００６； ８１（８）： １１７９−１１８４）口腔組織（自治医科大学先端治療開発部門 小林英司先生より提供）を１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（ＡｂＡｍ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で２回洗浄した。続いて、洗浄した組織を１％ＡｂＡｍを添加したＤＭＥＭで溶解したＤｉｓｐａｓｅ Ｉ （１，０００ ＰＵ/ｍｌ）溶液に４℃で４時間浸漬した。Ｄｉｓｐａｓｅ処理後、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）へ組織を移し、室温で２分間浸漬した後、ＰＢＳで２回洗浄した。続いて、ピンセットを用いて口腔組織から基底膜とともに口腔粘膜上皮を剥離した。剥離した上皮を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）に浸漬し、３７℃で２０分間処理した後、１０％ＫＣＭ培地（Ｈａｙａｓｈｉ Ｒ，Ｙａｍａｔｏ Ｍ，Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ，Ｏｉｅ Ｙ，Ｋｕｂｏｔａ Ａ，Ｈｏｒｉ Ｙ，Ｏｋａｎｏ Ｔ，Ｎｉｓｈｉｄａ Ｋ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０；１６（４）：５５３−５６０）で懸濁した。その後、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ処理をしたＮＩＨ／３Ｔ３を播種しておいた６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４×１０５ｃｅｌｌｓ / ｗｅｌｌの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。コンフレントに達するまで培養した口腔粘膜上皮細胞を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液で３７℃で５分間処理し、１０％ＫＣＭ培地で再懸濁した。続いて、細胞懸濁液を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｗｈｉｔｅ / ｃｌｅａｒ , Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｌａｔｅ, Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ （ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ） に１ｗｅｌｌ当たり１ / １５０量の濃度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１４日間培養し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートを作製した。実験には、継代数 ５以下の口腔粘膜上皮細胞シートを用いた。
（１）細胞シートの作製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ（Ｈａｋａｍａｔａ Ｙ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００６； ８１（８）： １１７９−１１８４）口腔組織（自治医科大学先端治療開発部門 小林英司先生より提供）を１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（ＡｂＡｍ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で２回洗浄した。続いて、洗浄した組織を１％ＡｂＡｍを添加したＤＭＥＭで溶解したＤｉｓｐａｓｅ Ｉ （１，０００ ＰＵ/ｍｌ）溶液に４℃で４時間浸漬した。Ｄｉｓｐａｓｅ処理後、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）へ組織を移し、室温で２分間浸漬した後、ＰＢＳで２回洗浄した。続いて、ピンセットを用いて口腔組織から基底膜とともに口腔粘膜上皮を剥離した。剥離した上皮を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）に浸漬し、３７℃で２０分間処理した後、１０％ＫＣＭ培地（Ｈａｙａｓｈｉ Ｒ，Ｙａｍａｔｏ Ｍ，Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ，Ｏｉｅ Ｙ，Ｋｕｂｏｔａ Ａ，Ｈｏｒｉ Ｙ，Ｏｋａｎｏ Ｔ，Ｎｉｓｈｉｄａ Ｋ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０；１６（４）：５５３−５６０）で懸濁した。その後、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ処理をしたＮＩＨ／３Ｔ３を播種しておいた６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４×１０５ｃｅｌｌｓ / ｗｅｌｌの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。コンフレントに達するまで培養した口腔粘膜上皮細胞を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液で３７℃で５分間処理し、１０％ＫＣＭ培地で再懸濁した。続いて、細胞懸濁液を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｗｈｉｔｅ / ｃｌｅａｒ , Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｌａｔｅ, Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ （ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ） に１ｗｅｌｌ当たり１ / １５０量の濃度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１４日間培養し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートを作製した。実験には、継代数 ５以下の口腔粘膜上皮細胞シートを用いた。
（２）細胞シートのＡＴＰ測定方法
細胞シートのＡＴＰ量は細胞シートのＶｉａｂｉｌｉｔｙと相関することから、保存前、保存後、および再培養後の細胞シートのＡＴＰ量を測定し、細胞シートのＶｉａｂｉｌｉｔｙの指標とした。細胞シートのＡＴＰ測定方法は以下のとおりである。すなわち、９６ウェルプレート ｗｈｉｔｅ / ｃｌｅａｒ , Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｌａｔｅに作製したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートをＨＢＳＳで２回洗浄した後、ＨＢＳＳを１９０μｌを添加し、４℃で１時間静置した。続いて、発光マイクロプレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Berthold Technologies GmbH & Co.KG）に静置後の９６ウェルプレートを準備し、機器設定によりＬｕｃｉｆｅｒｉｎの添加（終濃度；０．１９ｍｇ／ｍｌ）、およびＡＴＰ量の測定を行った。測定は４℃で２秒間の測定を１２分間行い、発光量の最大値をＡＴＰ量の測定値とした。測定終了後、ＨＢＳＳで３回洗浄した後、各保存液を用いて細胞シートを４℃で７日間保存した。保存期間終了後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、同様にしてＡＴＰ量の測定を行った。測定後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％ＫＣＭ２００μｌを添加して３７℃、５％ＣＯ２の環境下で７日間培養をした。７日間培養した後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、再び同様の方法でＡＴＰ量を測定した。
細胞シートのＡＴＰ量は細胞シートのＶｉａｂｉｌｉｔｙと相関することから、保存前、保存後、および再培養後の細胞シートのＡＴＰ量を測定し、細胞シートのＶｉａｂｉｌｉｔｙの指標とした。細胞シートのＡＴＰ測定方法は以下のとおりである。すなわち、９６ウェルプレート ｗｈｉｔｅ / ｃｌｅａｒ , Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｌａｔｅに作製したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートをＨＢＳＳで２回洗浄した後、ＨＢＳＳを１９０μｌを添加し、４℃で１時間静置した。続いて、発光マイクロプレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Berthold Technologies GmbH & Co.KG）に静置後の９６ウェルプレートを準備し、機器設定によりＬｕｃｉｆｅｒｉｎの添加（終濃度；０．１９ｍｇ／ｍｌ）、およびＡＴＰ量の測定を行った。測定は４℃で２秒間の測定を１２分間行い、発光量の最大値をＡＴＰ量の測定値とした。測定終了後、ＨＢＳＳで３回洗浄した後、各保存液を用いて細胞シートを４℃で７日間保存した。保存期間終了後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、同様にしてＡＴＰ量の測定を行った。測定後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％ＫＣＭ２００μｌを添加して３７℃、５％ＣＯ２の環境下で７日間培養をした。７日間培養した後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、再び同様の方法でＡＴＰ量を測定した。
（３）保存試験および再培養試験
基礎保存溶液として、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＵＷ、ＥＴ−ＫｙｏｔｏおよびＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の６種類を用いた。保存前のＡＴＰ量を測定したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートをＨＢＳＳで３回洗浄し、各基礎保存溶液３００μｌを添加し、４℃で７日間保存した。保存期間終了後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、ＡＴＰ量を測定した。測定後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％ＫＣＭ２００μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で再培養を行った。７日間培養した後、ＡＴＰ量を測定した。
基礎保存溶液として、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＵＷ、ＥＴ−ＫｙｏｔｏおよびＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の６種類を用いた。保存前のＡＴＰ量を測定したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートをＨＢＳＳで３回洗浄し、各基礎保存溶液３００μｌを添加し、４℃で７日間保存した。保存期間終了後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、ＡＴＰ量を測定した。測定後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％ＫＣＭ２００μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で再培養を行った。７日間培養した後、ＡＴＰ量を測定した。
（４）結果
結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は保存後７日目のＡＴＰ残存量を示し、（Ｂ）は再培養７日目のＡＴＰ残存量を示す。図１（Ａ）から明らかなように、保存後７日目のＡＴＰ残存量は、ＨＢＳＳが約５％で最も高く、以下ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の順で高かった。また、図１（Ｂ）から明らかなように、再培養によりシートを再形成したのはＨＢＳＳおよびＵＷで保存した細胞シートであり、ＨＢＳＳで保存した細胞シートのほうが再培養後のＡＴＰ残存量が高く（約５０％）、ＵＷより保存性に優れていることが示された。
結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は保存後７日目のＡＴＰ残存量を示し、（Ｂ）は再培養７日目のＡＴＰ残存量を示す。図１（Ａ）から明らかなように、保存後７日目のＡＴＰ残存量は、ＨＢＳＳが約５％で最も高く、以下ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の順で高かった。また、図１（Ｂ）から明らかなように、再培養によりシートを再形成したのはＨＢＳＳおよびＵＷで保存した細胞シートであり、ＨＢＳＳで保存した細胞シートのほうが再培養後のＡＴＰ残存量が高く（約５０％）、ＵＷより保存性に優れていることが示された。
〔実施例２：ルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを用いた基礎保存溶液への添加物のスクリーニング〕
（１）実験方法
基礎保存溶液にＨＢＳＳを用い、添加物として、デキストラン４０（０．２ｇ／ｌ、２ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ）、コンドロイチン硫酸（０．０１％、０．１％。１％）、Ｎ−アセチルシステイン（０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）、アロプリノール（０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）、グルタチオン（０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭ）、アデノシン（０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ、５ｍＭ）、ヒアルロン酸（０．０１％、０．１％、０．５％）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ）、トレハロース（１２ｍＭ、１２０ｍＭ、１２００ｍＭ）およびエブセレン（１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）の１０種類を用いた。添加物の濃度はそれぞれ括弧内に示した通りとし、それぞれｎ＝３で実験を行った。実施例１と同様にして、保存開始前と保存後７日目のＡＴＰ量を測定した。
（１）実験方法
基礎保存溶液にＨＢＳＳを用い、添加物として、デキストラン４０（０．２ｇ／ｌ、２ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ）、コンドロイチン硫酸（０．０１％、０．１％。１％）、Ｎ−アセチルシステイン（０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）、アロプリノール（０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）、グルタチオン（０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭ）、アデノシン（０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ、５ｍＭ）、ヒアルロン酸（０．０１％、０．１％、０．５％）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ）、トレハロース（１２ｍＭ、１２０ｍＭ、１２００ｍＭ）およびエブセレン（１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）の１０種類を用いた。添加物の濃度はそれぞれ括弧内に示した通りとし、それぞれｎ＝３で実験を行った。実施例１と同様にして、保存開始前と保存後７日目のＡＴＰ量を測定した。
（２）結果
結果を図２に示した。図２から明らかなように、エブセレンを添加した場合に保存後７日目のＡＴＰ残存量の著しい増加が認められた。
結果を図２に示した。図２から明らかなように、エブセレンを添加した場合に保存後７日目のＡＴＰ残存量の著しい増加が認められた。
〔実施例３：ヒト由来口腔細胞シートを用いたエブセレン添加保存液の効果の検証〕
（１）細胞シートの作製
凍結保存されたＨｕｍａｎ Ｏｒａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ（ＨＯＫ、ＳｃｉｅｎｃｅｌｌＴＭ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を３７℃で溶解し、ＣｎＴ−２４に懸濁した。続いて、Ｔ７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフレントに達したＨＯＫを０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理し、剥離した後、Ｃｎｔ−２４を添加し懸濁液とした。続いて、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後、ＣｎＴ−２４で再懸濁した。細胞懸濁液は、５×１０５ｃｅｌｌずつＴ７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。再びコンフレントに達したＨＯＫを上記と同様の方法で剥離し、１０％ＫＣＭで細胞懸濁液とした。続いて、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ処理をしたＮＩＨ／３Ｔ３を播種した３５ｍｍＵｐＣｅｌｌ（登録商標、ＣｅｌｌＳｅｅｄ）にＨＯＫ細胞懸濁液を３×１０５ｃｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１４日間培養し、ヒト口腔粘膜細胞シートを作製した。
（１）細胞シートの作製
凍結保存されたＨｕｍａｎ Ｏｒａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ（ＨＯＫ、ＳｃｉｅｎｃｅｌｌＴＭ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を３７℃で溶解し、ＣｎＴ−２４に懸濁した。続いて、Ｔ７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフレントに達したＨＯＫを０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理し、剥離した後、Ｃｎｔ−２４を添加し懸濁液とした。続いて、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後、ＣｎＴ−２４で再懸濁した。細胞懸濁液は、５×１０５ｃｅｌｌずつＴ７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。再びコンフレントに達したＨＯＫを上記と同様の方法で剥離し、１０％ＫＣＭで細胞懸濁液とした。続いて、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ処理をしたＮＩＨ／３Ｔ３を播種した３５ｍｍＵｐＣｅｌｌ（登録商標、ＣｅｌｌＳｅｅｄ）にＨＯＫ細胞懸濁液を３×１０５ｃｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１４日間培養し、ヒト口腔粘膜細胞シートを作製した。
（２）保存後７日目における生細胞率の測定
保存液として、ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、ＨＢＳＳおよびエブセレン（１０μＭ）添加ＨＢＳＳを用いた。実施例１と同様に、細胞シートを保存液に浸漬し、４℃で７日間保存した。保存前と保存後７日目に生細胞率を測定した。生細胞率の測定は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色によるフローサイトメトリー法で行った。すなわち、剥離した細胞シートの１／２を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理し、細胞懸濁液とした後、５％ＦＢＳを添加したＰＢＳで中和し、１２００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後、上清を除去し５％ＦＢＳを添加したＰＢＳ１ｍｌで細胞懸濁液とし、細胞数測定を行った。続いて７−ＡＡＤを２０μｌ添加し、室温、暗所で２０分間静置した後、フローサイトメトリーによる解析を行った。７−ＡＡＤ陰性の細胞集団を生細胞、７−ＡＡＤ陽性の細胞集団を死細胞とし、生細胞率を算出した。
保存液として、ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、ＨＢＳＳおよびエブセレン（１０μＭ）添加ＨＢＳＳを用いた。実施例１と同様に、細胞シートを保存液に浸漬し、４℃で７日間保存した。保存前と保存後７日目に生細胞率を測定した。生細胞率の測定は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色によるフローサイトメトリー法で行った。すなわち、剥離した細胞シートの１／２を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理し、細胞懸濁液とした後、５％ＦＢＳを添加したＰＢＳで中和し、１２００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後、上清を除去し５％ＦＢＳを添加したＰＢＳ１ｍｌで細胞懸濁液とし、細胞数測定を行った。続いて７−ＡＡＤを２０μｌ添加し、室温、暗所で２０分間静置した後、フローサイトメトリーによる解析を行った。７−ＡＡＤ陰性の細胞集団を生細胞、７−ＡＡＤ陽性の細胞集団を死細胞とし、生細胞率を算出した。
（３）保存後７日目における細胞シートの形態（ＨＥ染色）
細胞シートの１／４を１０％ホルマリン溶液に一晩浸漬した後、パラフィン包埋した。包埋した細胞シートを３μｍの厚さに切薄し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィンを行うためにキシレンに２回、１００％エタノール、９９％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノール、蒸留水の順に切片を浸漬した。続いて、ＴＢＳに５分間浸漬した後、蒸留水に通し、ヘマトキシリンで１０分間染色した。ヘマトキシリン染色後、流水で１０分間洗浄し、１％塩酸エタノール中で１０秒間脱色した。脱色後、ただちに流水で１分間洗浄し、蒸留水に１５分間浸漬した。続いて、エオジンで２分間染色し、流水で５分間洗浄した。切片を透徹、封入するために、１００％エタノールに５回、キシレンに３回浸漬した後、封入剤（ＭＧＫ−Ｓ、松浪硝子工業株式会社）を用いて切片を封入した。観察は、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で対物レンズ２０倍を使用して行った。
細胞シートの１／４を１０％ホルマリン溶液に一晩浸漬した後、パラフィン包埋した。包埋した細胞シートを３μｍの厚さに切薄し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィンを行うためにキシレンに２回、１００％エタノール、９９％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノール、蒸留水の順に切片を浸漬した。続いて、ＴＢＳに５分間浸漬した後、蒸留水に通し、ヘマトキシリンで１０分間染色した。ヘマトキシリン染色後、流水で１０分間洗浄し、１％塩酸エタノール中で１０秒間脱色した。脱色後、ただちに流水で１分間洗浄し、蒸留水に１５分間浸漬した。続いて、エオジンで２分間染色し、流水で５分間洗浄した。切片を透徹、封入するために、１００％エタノールに５回、キシレンに３回浸漬した後、封入剤（ＭＧＫ−Ｓ、松浪硝子工業株式会社）を用いて切片を封入した。観察は、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で対物レンズ２０倍を使用して行った。
（４）生細胞率の結果
図３にフローサイトメトリーのチャートを示した。また、表１に保存前および保存後の各保存液における細胞数、生細胞率および細胞シート当たりの生細胞数を示した。図３および表１から明らかなように、エブセレン添加ＨＢＳＳを用いた場合の生細胞率は９１．１％であり、エブセレンを添加していないＨＢＳＳと比較して２４％高く、エブセレン添加によって生細胞数は約４倍多く維持されることが示された。
図３にフローサイトメトリーのチャートを示した。また、表１に保存前および保存後の各保存液における細胞数、生細胞率および細胞シート当たりの生細胞数を示した。図３および表１から明らかなように、エブセレン添加ＨＢＳＳを用いた場合の生細胞率は９１．１％であり、エブセレンを添加していないＨＢＳＳと比較して２４％高く、エブセレン添加によって生細胞数は約４倍多く維持されることが示された。
（５）ＨＥ染色の結果
結果を図４に示した。図４から明らかなように、エブセレン添加ＨＢＳＳで保存した細胞シートは厚さや形態が良好に維持されていた。エブセレンを添加していないＨＢＳＳで保存した細胞シートは、エブセレン添加ＨＢＳＳには劣るものの厚さや形態は維持されていた。一方、ＰＢＳで保存した細胞シートは形態が大きく崩れており、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）保存した細胞シートは重層上皮が脱落し、ほぼ単層になっていた。
結果を図４に示した。図４から明らかなように、エブセレン添加ＨＢＳＳで保存した細胞シートは厚さや形態が良好に維持されていた。エブセレンを添加していないＨＢＳＳで保存した細胞シートは、エブセレン添加ＨＢＳＳには劣るものの厚さや形態は維持されていた。一方、ＰＢＳで保存した細胞シートは形態が大きく崩れており、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）保存した細胞シートは重層上皮が脱落し、ほぼ単層になっていた。
〔実施例４：ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）へのエブセレンの添加〕
（１）実験方法
ＰＢＳにエブセレンを添加した保存液、またはＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）にエブセレンを添加した保存液を用いて実施例１と同様にして、保存開始前、保存後７日目および再培養７日目のＡＴＰ量を測定した。エブセレンの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とした。
（１）実験方法
ＰＢＳにエブセレンを添加した保存液、またはＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）にエブセレンを添加した保存液を用いて実施例１と同様にして、保存開始前、保存後７日目および再培養７日目のＡＴＰ量を測定した。エブセレンの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とした。
（２）結果
ＰＢＳの結果を図５に、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の結果を図６にそれぞれ示した。図５から、保存液にエブセレン添加ＰＢＳを用いた場合には、１０μＭ以上のエブセレン添加により再培養において増殖が認められた。図６から、保存液にエブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）を用いた場合には、１μＭ以上のエブセレン添加により再培養において増殖が認められた。これらの結果から、単独では細胞シートを保存することが難しいＰＢＳおよびＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）でも、エブセレンを添加することにより保存液として使用できることが明らかとなった。
ＰＢＳの結果を図５に、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の結果を図６にそれぞれ示した。図５から、保存液にエブセレン添加ＰＢＳを用いた場合には、１０μＭ以上のエブセレン添加により再培養において増殖が認められた。図６から、保存液にエブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）を用いた場合には、１μＭ以上のエブセレン添加により再培養において増殖が認められた。これらの結果から、単独では細胞シートを保存することが難しいＰＢＳおよびＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）でも、エブセレンを添加することにより保存液として使用できることが明らかとなった。
〔実施例５：ブタ由来角膜組織を用いたエブセレン添加保存液の効果の検証〕
（１）ブタ角膜の採取
ブタ眼球の角膜輪部周辺にメスで切れ目を入れた後、強膜を２〜３ｍｍ残し鋏で取り除いた。続いて、ピンセットを用いて水晶体を取り除き、さらに実態顕微鏡下で虹彩を取り除き、強角膜片とした。
（１）ブタ角膜の採取
ブタ眼球の角膜輪部周辺にメスで切れ目を入れた後、強膜を２〜３ｍｍ残し鋏で取り除いた。続いて、ピンセットを用いて水晶体を取り除き、さらに実態顕微鏡下で虹彩を取り除き、強角膜片とした。
（２）保存前および１４日間保存後における組織形態の対比
保存液として、ＰＢＳ、エブセレン添加ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、エブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、ＨＢＳＳ、およびエブセレン添加ＨＢＳＳの６種類を用いた。エブセレン濃度はいずれも１０μＭとした。９ｍｌの保存液に採取したブタ角膜を浸漬し、４℃で１４日間保存した。１４日目に角膜を取り出し、鋏を用いて１／２に切断した。一方は、１０％ホルマリン溶液に一晩浸漬した後、パラフィン包埋し、もう一方は、凍結切片作製用包埋剤（Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて凍結ブロックとした。
保存液として、ＰＢＳ、エブセレン添加ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、エブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、ＨＢＳＳ、およびエブセレン添加ＨＢＳＳの６種類を用いた。エブセレン濃度はいずれも１０μＭとした。９ｍｌの保存液に採取したブタ角膜を浸漬し、４℃で１４日間保存した。１４日目に角膜を取り出し、鋏を用いて１／２に切断した。一方は、１０％ホルマリン溶液に一晩浸漬した後、パラフィン包埋し、もう一方は、凍結切片作製用包埋剤（Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて凍結ブロックとした。
ブタ強角膜片のＨＥ染色方法は以下の通りである。パラフィン包埋した角膜組織を３μｍの厚さに切薄し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィンを行うためにキシレンに２回、１００％エタノール、９９％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノール、蒸留水の順に切片を浸漬した。続いて、ＴＢＳに５分間浸漬した後、蒸留水に通し、ヘマトキシリンで１０分間染色した。ヘマトキシリン染色後、流水で１０分間洗浄し、１％塩酸エタノール中で１０秒間脱色させた。脱色後、ただちに流水で１分間洗浄し、蒸留水に１５分間浸漬した。続いて、エオジンで２分間染色し、流水で５分間洗浄した。切片を透徹、封入するために、１００％エタノールに５回、キシレンに３回浸漬した後、封入剤（ＭＧＫ−Ｓ、松浪硝子工業株式会社）を用いて切片を封入した。観察は、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で対物レンズ２０倍を使用して行った。
ＺＯ−１免疫染色方法は以下の通りである。凍結包埋した角膜組織を１０μｍの厚さに切薄し、凍結切片を作製した。十分に乾燥させた後、０．１Ｍ ＴＢＳに５分間洗浄し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄを除去した。続いて、５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した０．１Ｍ ＴＢＳ（５％ＮＳＴ）に室温で１時間浸漬し、ブロッキングを行った。５％ＮＳＴを除去した後、１％ロバ血清、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した０．１Ｍ ＴＢＳ（１％ＮＳＴ）にＺＯ−１、Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加した一次抗体溶液に４℃で一晩浸漬した。続いて、０．１Ｍ ＴＢＳで１０分間、３回洗浄した後、１％ＮＳＴにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加した二次抗体溶液に室温で１時間浸漬した。二次抗体溶液を除去した後、１％ＮＳＴにｂｉｓＢｅｎｚｉｍｉｄｅ Ｈ３３３４２ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した溶液に室温で１時間浸漬し、核染色した。次に、０．１Ｍ ＴＢＳで１０分間、２回洗浄した後、封入剤（Ｍｏｕｎｔ Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて封入した。観察は、ハイエンド倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用した。
（３）結果
ＨＥ染色の結果を図７に示し、ＺＯ−１免疫染色の結果を図８に示した。図７では、ＰＢＳで保存したブタ角膜は、上皮が脱落しかけている部分が多くみられたが、エブセレン添加ＰＢＳで保存した場合は、脱落部分はみられなかった。図８から、１４日間保存後において、エブセレン添加ＨＢＳＳでは角膜上皮のタイトジャンクションの形成が保持されていた（図中、点線で囲った部分）。
ＨＥ染色の結果を図７に示し、ＺＯ−１免疫染色の結果を図８に示した。図７では、ＰＢＳで保存したブタ角膜は、上皮が脱落しかけている部分が多くみられたが、エブセレン添加ＰＢＳで保存した場合は、脱落部分はみられなかった。図８から、１４日間保存後において、エブセレン添加ＨＢＳＳでは角膜上皮のタイトジャンクションの形成が保持されていた（図中、点線で囲った部分）。
〔実施例６：ヒト由来口腔細胞シートの再培養期間におけるＮｒｆ２関連遺伝子の発現〕
ヒト由来口腔細胞シートをＨＢＳＳにエブセレン添加した保存液を用いて４℃で７日間保存し、その後１０％ＫＣＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で再培養を開始した。エブセレンの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とし、コントロールとしてエブセレン無添加のＨＢＳＳを用いた。Ｎｒｆ２関連遺伝子として、ＮＱＯ−１およびＨＯ−１を選択した。ＮＱＯ−１は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（キノンオキシドレダクターゼ１）の略称であり、キノン類を二電子還元しヒドロキノンに変換し、他の薬物代謝酵素により抱合・排出されやすい形にする酸化還元反応を触媒する酵素である。ＮＱＯ−１は、その発現がＮｒｆ２の活性化により調節されていることが知られている。ＨＯ−１は、ヘムオキシゲナーゼの略称であり、ヘムを鉄イオン、一酸化炭素、ビリベルジンに分解する。さらに、ビリベルジンは還元酵素によりビリルビンとなるが、これらビリベルジン、およびビリルビンがフリーラジカルスカベンジャーとなり、生体を酸化ストレスから防御する。ＨＯ−１もＮＱＯ−１同様に、Ｎｒｆ２の活性化により発現が調節されていることが知られている。
ヒト由来口腔細胞シートをＨＢＳＳにエブセレン添加した保存液を用いて４℃で７日間保存し、その後１０％ＫＣＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で再培養を開始した。エブセレンの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とし、コントロールとしてエブセレン無添加のＨＢＳＳを用いた。Ｎｒｆ２関連遺伝子として、ＮＱＯ−１およびＨＯ−１を選択した。ＮＱＯ−１は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（キノンオキシドレダクターゼ１）の略称であり、キノン類を二電子還元しヒドロキノンに変換し、他の薬物代謝酵素により抱合・排出されやすい形にする酸化還元反応を触媒する酵素である。ＮＱＯ−１は、その発現がＮｒｆ２の活性化により調節されていることが知られている。ＨＯ−１は、ヘムオキシゲナーゼの略称であり、ヘムを鉄イオン、一酸化炭素、ビリベルジンに分解する。さらに、ビリベルジンは還元酵素によりビリルビンとなるが、これらビリベルジン、およびビリルビンがフリーラジカルスカベンジャーとなり、生体を酸化ストレスから防御する。ＨＯ−１もＮＱＯ−１同様に、Ｎｒｆ２の活性化により発現が調節されていることが知られている。
Ｌｕｃ ｔｇ ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートを１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに作製し、保存前、保存７日後の再培養０時間後、６時間後、および２４時間後にｍＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｕｐｅｒ ｍｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡを合成し、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｇａｐｄｈ（Ｒｎ０１７７５７６３＿ｇ１，Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｍｏｘ１（Ｒｎ０１５３６９３３＿ｍ１，Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｎｑｏ１（Ｒｎ００５６６５２８＿ｍ１，Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（ＣＴ）値を測定した。次に、ｇａｐｄｈをハウスキーピング遺伝子として、ＮＱＯ−１およびＨＯ−１の相対的な発現量をそれぞれ算出した。
ＮＱＯ−１の結果を図９に示し、ＨＯ−１の結果を図１０に示した。エブセレンを１０μＭ以上添加したＨＢＳＳで保存した細胞シートは、再培養後６時間でＮＱＯ−１およびＨＯ−１ともに発現上昇が認められた。この結果から、エブセレンの添加によりＮｒｆ２が活性化した結果、細胞保存効果が発現していることが示唆された。
〔実施例７：ルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを用いたｔＢＨＱの添加ＨＢＳＳの効果〕
ＨＢＳＳにｔＢＨＱを添加した保存液を用いて実施例１と同様にして、保存後７日目のＡＴＰ量を測定した。ｔＢＨＱの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とした。何も添加していないＨＢＳＳを陰性対照およびエブセレン添加ＨＢＳＳ（１０μＭ）を陽性対照とした。
ＨＢＳＳにｔＢＨＱを添加した保存液を用いて実施例１と同様にして、保存後７日目のＡＴＰ量を測定した。ｔＢＨＱの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とした。何も添加していないＨＢＳＳを陰性対照およびエブセレン添加ＨＢＳＳ（１０μＭ）を陽性対照とした。
結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、ＨＢＳＳにｔＢＨＱを添加することにより、保存後７日目のＡＴＰ残存量の増加が認められた。この結果から、ｔＢＨＱもエブセレンと同様に保存液に添加することで細胞の生存率を向上させることが示された。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (3)
- Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液であって、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンを含有するハンクス平衡塩類溶液である組織保存液。
- エブセレンを含有するハンクス平衡塩類溶液である請求項１に記載の組織保存液。
- 請求項１又は２に記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012164902 | 2012-07-25 | ||
| JP2012164902 | 2012-07-25 | ||
| PCT/JP2013/068283 WO2014017267A1 (ja) | 2012-07-25 | 2013-07-03 | 組織保存液および組織保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2014017267A1 JPWO2014017267A1 (ja) | 2016-07-07 |
| JP5974093B2 true JP5974093B2 (ja) | 2016-08-23 |
Family
ID=49997083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014526838A Active JP5974093B2 (ja) | 2012-07-25 | 2013-07-03 | 組織保存液および組織保存方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20150351380A1 (ja) |
| EP (1) | EP2878197B1 (ja) |
| JP (1) | JP5974093B2 (ja) |
| KR (1) | KR102023339B1 (ja) |
| HK (1) | HK1206934A1 (ja) |
| WO (1) | WO2014017267A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015077523A1 (en) * | 2013-11-22 | 2015-05-28 | Le Centre Nationale De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Assay-ready frozen cell and method for minimizing variability in the performance thereof |
| US10083369B2 (en) | 2016-07-01 | 2018-09-25 | Ricoh Company, Ltd. | Active view planning by deep learning |
| JP7037395B2 (ja) * | 2018-03-15 | 2022-03-16 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
| CN113151160B (zh) * | 2021-05-07 | 2022-05-13 | 天津力牧生物科技有限公司 | 提高牛体外受精效率的方法和所用的冻存液和解冻液 |
| CN114181901B (zh) * | 2021-12-08 | 2024-02-02 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879283A (en) | 1985-10-03 | 1989-11-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Solution for the preservation of organs |
| US5336616A (en) * | 1990-09-12 | 1994-08-09 | Lifecell Corporation | Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation |
| JPH0733601A (ja) * | 1992-04-01 | 1995-02-03 | Ho Chen Chun | 組織保存用組成物 |
| JP3253131B2 (ja) | 1992-07-24 | 2002-02-04 | 洋巳 和田 | 移植臓器用溶液 |
| FR2718441B1 (fr) * | 1994-04-07 | 1996-06-28 | Bioxytech | Nouveaux composés de structure benzisoséléna-zoline et -zine, leur procédé de préparation et leurs applications thérapeutiques. |
| JP5230042B2 (ja) * | 1999-06-02 | 2013-07-10 | 株式会社ビーエムジー | 動物の細胞または臓器の保存剤およびその保存方法。 |
| US7611830B2 (en) * | 2000-04-10 | 2009-11-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veteran's Affairs | Device to lavage a blood vessel |
| JP4908718B2 (ja) * | 2000-07-05 | 2012-04-04 | 株式会社大塚製薬工場 | 細胞・組織保存液 |
| JP2003267801A (ja) * | 2002-03-12 | 2003-09-25 | Pharmafoods Kenkyusho:Kk | 保存剤用組成物及び該組成物を含有する動物の細胞または臓器の保存剤 |
| US20050163759A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-07-28 | Geliebter David M. | Compositions and methods for ex vivo preservation of blood vessels for vascular grafts using inhibitors of type I and/or type II phosphodiesterases |
| JP4715373B2 (ja) | 2005-08-01 | 2011-07-06 | 富士電機システムズ株式会社 | インバータ装置 |
| JP2009051786A (ja) * | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Nomura Unison Co Ltd | 臓器の保存方法および細胞の分離方法 |
| GB0819530D0 (en) * | 2008-10-24 | 2008-12-03 | Univ Sheffield | Methods and compositions |
| JP5796290B2 (ja) * | 2010-12-03 | 2015-10-21 | 公益財団法人先端医療振興財団 | 膵島組織保存溶液及びそれを用いる方法 |
-
2013
- 2013-07-03 KR KR1020157004565A patent/KR102023339B1/ko active IP Right Grant
- 2013-07-03 US US14/416,148 patent/US20150351380A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-03 EP EP13823128.7A patent/EP2878197B1/en not_active Not-in-force
- 2013-07-03 JP JP2014526838A patent/JP5974093B2/ja active Active
- 2013-07-03 WO PCT/JP2013/068283 patent/WO2014017267A1/ja active Application Filing
-
2015
- 2015-08-04 HK HK15107498.5A patent/HK1206934A1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20150067130A (ko) | 2015-06-17 |
| HK1206934A1 (en) | 2016-01-22 |
| EP2878197A1 (en) | 2015-06-03 |
| WO2014017267A1 (ja) | 2014-01-30 |
| EP2878197A4 (en) | 2016-04-27 |
| JPWO2014017267A1 (ja) | 2016-07-07 |
| KR102023339B1 (ko) | 2019-09-20 |
| EP2878197B1 (en) | 2018-12-26 |
| US20150351380A1 (en) | 2015-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Malladi et al. | Effect of reduced oxygen tension on chondrogenesis and osteogenesis in adipose-derived mesenchymal cells | |
| Wang et al. | Promotion of cardiac differentiation of brown adipose derived stem cells by chitosan hydrogel for repair after myocardial infarction | |
| Yamamoto et al. | Low oxygen tension enhances proliferation and maintains stemness of adipose tissue–derived stromal cells | |
| JP5974093B2 (ja) | 組織保存液および組織保存方法 | |
| RU2756561C2 (ru) | Среда для формирования колоний и её применение | |
| Wang et al. | Enhanced hepatogenic differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells on liver ECM hydrogel | |
| Lim et al. | Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering | |
| CN102933703A (zh) | 使用胎盘干细胞的血管生成 | |
| Collins et al. | Isolation and grafting of single muscle fibres | |
| PT103843A (pt) | Método de isolamento de células precursoras a partir do cordão umbilical humano | |
| Erker et al. | Therapeutic liver reconstitution with murine cells isolated long after death | |
| Carvalho et al. | Characterization of decellularized heart matrices as biomaterials for regular and whole organ tissue engineering and initial in-vitro recellularization with ips cells | |
| Xiang et al. | Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells | |
| JP6626245B2 (ja) | 再構成皮膚の作製用の組成物および方法 | |
| US20200163326A1 (en) | Cryopreservation | |
| Di Scipio et al. | A simple protocol to isolate, characterize, and expand dental pulp stem cells | |
| Noori et al. | Decellularized lung extracellular matrix scaffold promotes human embryonic stem cell differentiation towards alveolar progenitors | |
| Krüger et al. | High level of polarized engraftment of porcine intrahepatic cholangiocyte organoids in decellularized liver scaffolds | |
| AU2020263769B2 (en) | Trehalose-containing liquid for mammalian cell preservation | |
| Hu et al. | Induced autologous stem cell transplantation for treatment of rabbit type 1 diabetes | |
| Kim et al. | Efficient cryopreservation of human mesenchymal stem cells using silkworm hemolymph‐derived proteins | |
| KR20180075808A (ko) | 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법 | |
| US20210395689A1 (en) | Method for producing insulin-producing cells | |
| WO2012133575A1 (ja) | 間葉系幹細胞の細胞死抑制方法 | |
| Swaminathan et al. | Developing a partially perfused liver model using caprine liver explant conditioned to the chicken extra-embryonic perfusion system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160621 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160715 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5974093 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |