CN114181901B - 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增免疫细胞；利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导免疫细胞；利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；本发明还公开了一种体外诱导扩增的免疫细胞及其冻存方法；本发明对免疫细胞的单个核细胞进行诱导扩增培养，得到大量功能激活的免疫细胞，不仅具有诱导效率高、扩增速度快，具有成本低的优点，同时制备的冻存液能够保存免疫细胞并提高复苏免疫细胞增值率，并取得了极好的预期效果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞的体外诱导扩增技术领域，尤其涉及一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。
背景技术
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，从血液中分离出来的单个核细胞是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。
生物免疫细胞治疗是通过体外培养、增殖、激活，回输体内诱导自体抗病毒免疫应答，从而使得人体抗病毒免疫被激活后源源不断地产生抗病毒的物质杀灭病毒。免疫细胞对肿瘤细胞、细菌等的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞或细菌，但不会伤及“无辜”的正常细胞，是一种十分有效的治疗方式。
冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将冻融过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在降温前加入一种或两种低温保护剂，在溶解后又将其去除。细胞冷冻技术无论对临床还是基础研究均具有重要意义，细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。
目前，细胞的冻存除了采用DMSO对干细胞进行冻存，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存，目前DMSO作为细胞冷冻保存剂，单独使用保存免疫细胞存活率低，复苏后细胞数量及活力都无法满足临床应用的标准，目前市场上已有NK细胞治疗产品，其不仅扩增倍数低，且冻存复苏效果差，导致杀瘤效果不佳。
白藜芦醇，是一种非黄酮类多酚有机化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素，在专利CN 111727961 A公开了一种牙髓干细胞冻存液及其冻存方法，通过在其冻存液中添加白藜芦醇，所述白藜芦醇在所述干细胞冻存液体中的浓度为0.1-10μM，用其冻存过的牙髓干细胞复苏后，其增殖能力得到显著地提升，可以极大地提升牙髓干细胞分离培养的效率。发明人发现将其加入至免疫细胞冻存中，效果较差，细胞活性与表达率远低于预期。
免疫细胞与上述牙髓干细胞等干细胞的功能与应用各不相同，将白藜芦醇直接添加至免疫细胞冻存中效果较差，发明人通过寻找能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率的成分并与白藜芦醇复配，达到能够保存免疫细胞并提高复苏免疫细胞活性与表达率，取得了极好的预期效果。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。
本发明提出的一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2600-1200U/ml、IL-101200-1800U/ml、γ-干扰素400-600U/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2600-1200IU/ml、IL-101200-1800IU/ml、沙培林0.001-0.006KE/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2600-1200IU/ml、IL-11200-1800IU/ml、白藜芦醇20-80ng/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
优选地，所述免疫细胞为自然杀伤细胞或树突状细胞。
优选地，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTM CTSTM无血清培养基或SuperCultureTM L500人淋巴细胞无血清培养基。
一种体外诱导扩增的免疫细胞，采用所述免疫细胞的体外诱导扩增的方法制备。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 10-20mg/ml；人血白蛋白5-15mg/ml；1,3-丙二醇1.2-3mg/ml；海藻糖0.1-0.5ml/ml；白藜芦醇0.2-0.6mg/ml；胡椒碱0.01-0.06ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将所述的免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-8×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存20-30h，然后转入液氮中冻存。
免疫细胞的复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中1-2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，得到复苏免疫细胞。
本发明的技术效果如下所示：
(1)本发明对免疫细胞的单个核细胞进行诱导扩增培养，得到大量功能激活的免疫细胞，不仅具有诱导效率高、扩增速度快，同时具有成本低的优点；
(2)本发明提出的免疫细胞专用冻存液，可有效提高免疫细胞保存时间，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗中大量免疫细胞的需求；
(3)在免疫细胞专用冻存液中，海藻糖广泛存在于低等动物、藻类、细菌、真菌、酵母中，是应激代谢的重要产物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、高渗透压、有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能；
胡椒碱是一种吡咯烷类酰胺生物碱，发明人通过研究发现，胡椒碱可提高白藜芦醇的活性，可使白藜芦醇的暴露程度增加一倍，本发明在DMSO中，海藻糖保护下采用胡椒碱与白藜芦醇复配，冻存细胞复苏后，其细胞活性与表达率得到显著的提升，这是单独使用白藜芦醇所不具备的。
附图说明
图1为实施例5的免疫细胞体外扩增线形图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2600U/ml、IL-101200U/ml、γ-干扰素400U/ml、层粘连蛋白5μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2600IU/ml、IL-101200IU/ml、沙培林0.001KE/ml、层粘连蛋白5μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2600IU/ml、IL-11200IU/ml、白藜芦醇20ng/ml、层粘连蛋白5μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 10mg/ml；人血白蛋白5mg/ml；1,3-丙二醇1.2mg/ml；海藻糖0.1ml/ml；白藜芦醇0.2mg/ml；胡椒碱0.01ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存20h，然后转入液氮中冻存。
实施例2
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21200U/ml、IL-101800U/ml、γ-干扰素600U/ml、层粘连蛋白10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21200IU/ml、IL-101800IU/ml、沙培林0.006KE/ml、层粘连蛋白10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21200IU/ml、IL-11800IU/ml、白藜芦醇80ng/ml、层粘连蛋白10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 20mg/ml；人血白蛋白15mg/ml；1,3-丙二醇3mg/ml；海藻糖0.5ml/ml；白藜芦醇0.6mg/ml；胡椒碱0.06ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为8×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存30h，然后转入液氮中冻存。
实施例3
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2700U/ml、IL-101300U/ml、γ-干扰素450U/ml、层粘连蛋白6μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2700IU/ml、IL-101300IU/ml、沙培林0.0012KE/ml、层粘连蛋白6μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2700IU/ml、IL-11400IU/ml、白藜芦醇30ng/ml、层粘连蛋白6μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 12mg/ml；人血白蛋白7mg/ml；1,3-丙二醇1.5mg/ml；海藻糖0.2ml/ml；白藜芦醇0.3mg/ml；胡椒碱0.03ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为4×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存25h，然后转入液氮中冻存。
实施例4
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21150U/ml、IL-101700U/ml、γ-干扰素550U/ml、层粘连蛋白9μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21100IU/ml、IL-101700IU/ml、沙培林0.005KE/ml、层粘连蛋白9μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21150IU/ml、IL-11600IU/ml、白藜芦醇75ng/ml、层粘连蛋白9μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
其中所述免疫细胞为树突状细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 18mg/ml；人血白蛋白13mg/ml；1,3-丙二醇2.5mg/ml；海藻糖0.4ml/ml；白藜芦醇0.5mg/ml；胡椒碱0.05ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为6×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存28h，然后转入液氮中冻存。
实施例5
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21000U/ml、IL-101500U/ml、γ-干扰素500U/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-101500IU/ml、沙培林0.004KE/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-11500IU/ml、白藜芦醇60ng/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞为自然杀伤细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 15mg/ml；人血白蛋白12mg/ml；1,3-丙二醇2mg/ml；海藻糖0.3ml/ml；白藜芦醇0.3mg/ml；胡椒碱0.04ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为5×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存26h，然后转入液氮中冻存。
对比例1
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21000U/ml、IL-101500U/ml、γ-干扰素500U/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-101500IU/ml、沙培林0.004KE/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-11500IU/ml、白藜芦醇60ng/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞为自然杀伤细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 15mg/ml；人血白蛋白12mg/ml；1,3-丙二醇2mg/ml；海藻糖0.3ml/ml；胡椒碱0.04ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为5×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存26h，然后转入液氮中冻存。
对比例2
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21000U/ml、IL-101500U/ml、γ-干扰素500U/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-101500IU/ml、沙培林0.004KE/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-11500IU/ml、白藜芦醇60ng/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞为自然杀伤细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 15mg/ml；人血白蛋白12mg/ml；1,3-丙二醇2mg/ml；海藻糖0.3ml/ml；白藜芦醇0.3mg/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为5×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存26h，然后转入液氮中冻存。
性能测试
1、免疫细胞体外扩增测试
将实施例5的免疫细胞进行体外扩增测试，分别在第0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天进行细胞计数，绘制免疫细胞体外扩增线形图，测试结果如图1所示，图1为由图可1可知，实施例5制备的免疫细胞在突变体的共同作用下，免疫细胞的数量显著增加，其在前9天为激活并缓慢扩增阶段，12天后开始进入对数生长期，在14天时细胞数量达到1.4×1010，扩增效果优异。
对诱导扩增得到的产品检测乙肝表面抗原、丙肝抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，检测未发现病原体感染，本发明过程安全的，培养过程中没有造成污染。
2、将实施例5和对比例1-2的冻存方法中所得细胞悬浮液进行台盼蓝染色计算活性，采用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1mL；分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存26h，转移至液氮中冻存。
将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，按各组复苏方法执行，将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，其中细胞活性计算结果如下表1所示，细胞表面标记物表达率检测结果如下表2所示。
表1细胞活性
表2细胞表面标记物表达率
由以上表1、表2可知，在海藻糖的保护下，胡椒碱可提高白藜芦醇的活性，可使白藜芦醇的暴露程度增加一倍，采用胡椒碱与白藜芦醇复配，两者同时加入，冻存细胞复苏后，其细胞活性与表达率得到显著的提升，这时单独使用白藜芦醇所不具备的。
综上，通过实施例5与对比例1-2进行比较可以得出，采用本发明的冻存液可使得细胞复苏后具有更好的细胞活性，细胞生物学特性几乎不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2 600-1200U/ml、IL-10 1200-1800U/ml、γ-干扰素400-600U/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2 600-1200IU/ml、IL-10 1200-1800IU/ml、沙培林0.001-0.006KE/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2 600-1200IU/ml、IL-1 1200-1800IU/ml、白藜芦醇20-80ng/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基，免疫细胞为自然杀伤细胞或树突状细胞，无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTM CTS TM 无血清培养基或SuperCultureTM L500人淋巴细胞无血清培养基。
2.如权利要求1所述的一种免疫细胞的体外诱导扩增的的方法，其特征在于，免疫细胞冻存的方法还包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 10-20mg/ml；人血白蛋白5-15mg/ml；1,3-丙二醇1.2-3mg/ml；海藻糖0.1-0.5ml/ml；白藜芦醇0.2-0.6mg/ml；胡椒碱0.01-0.06ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将权利要求1制备的免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-8×107 个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存20-30h，然后转入液氮中冻存。
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