CN101084001A - 使用先体外后体内激活的细胞的组合物和疗法以用于骨髓抑制病人 - Google Patents

Abstract

本公开包括激活人血细胞、并向癌症病人、重度骨髓抑制病人施用人血细胞的方案，所述重度骨髓抑制病人包括由于接受癌症治疗例如化疗或放疗导致的重度骨髓抑制病人。所述方案可包括在激活剂存在下培养血细胞，所述激活剂例如细胞因子和离子载体。

Description

使用先体外后体内激活的细胞的组合物和疗法以用于骨髓抑制病人

与相关申请的交叉参考

本专利申请涉及杨的、于2004年9月10日提交的、名称为“使用先体外后体内(ex vivo)激活的细胞的组合物和疗法以用于骨髓抑制病人“的共同拥有的、共同悬而未决的美国专利申请号10/939,302，和杨的、于2004年9月10日在美国提交的、名称为“使用先体外后体内激活的细胞的组合物和疗法以用于骨髓抑制病人“的共同拥有的、共同悬而未决的美国专利申请系列号10/939,302。

发明背景

发明领域

此发明是关于严重骨髓抑制病人的治疗，包括再生障碍性贫血、贫血和严重血小板减少症。具体讲，此发明是关于先体外后体内激活的免疫细胞作为用于严重骨髓抑制病人的疗法。还有，此发明是关于激活细胞的方法以及对应的细胞培养方法。

技术背景

再生障碍性贫血是骨髓抑制病人中以无效造血为特征的疾病。病人在所有血细胞类型的产生上都有不同程度的异常。虽然在大多数病例中，病因是未知的，但是放射线、基于苯的化合物、病毒(例如肝炎病毒)，环境毒素，以及非处方和处方药被怀疑通过损伤骨髓而造成骨髓干细胞凋亡来导致骨髓抑制。无论病因如何，病人呈现相似的临床表现和病程。再生障碍性贫血主要影响年轻人和老年人，无论男人还是女人。全球每年每百万人中有两到六人患病，东方人的患病率高于欧洲和美国。再生障碍性贫血现有几种假设的病因：先天的，妊娠，病毒以及药物和化学品。

再生障碍性贫血最常引用的病因是暴露于药物或化学品，它们导致骨髓抑制，造成再生障碍性贫血。有些物质，例如氯霉素、苯、电离放射、和抗瘤剂，可导致发育不良，其在严重性上是剂量相关的，并因人而异。在这些病例中，诱因撤除后通常发生骨髓恢复。其它物质，例如杀虫剂、一些抗癫痫药物以及抗菌剂引起非剂量相关的反应，所以在施用期间不能用血液学监测的办法来预测。在施用药物期间，甚至在药物疗法停止后仍会发生发育不良。与患原发性再生障碍性贫血的病人相比较，暴露于药物或毒素的病人显示相似的临床和人口统计学特征，预后相似，对治疗的反应也多少一致。

在苯诱导的再生障碍性贫血病例中，在病人停止暴露于苯后，轻度至中度的疾病症状通常消失。但是，对患重度骨髓衰竭或需要不断的输血的病人，迄今通常没有有效和安全的治疗。至今为止，骨髓移植是唯一已知的治愈方法。

轻度发育不全病人通常不需要太多的治疗，对轻度发育不全病人尽量少治疗的原理在于移除诱因，从而让其自行恢复。在患严重贫血的年轻病人中，用HLA匹配的供体进行骨髓移植是治疗选择。骨髓移植在接近80％的病例中产生完全缓解。尽管如此，当供体和受体在两个或多个位点不匹配时，存活率降至10-20％。与骨髓移植相关的并发症包括移植物排斥，急性或慢性移植物抗宿主疾病，感染以及其它各种各样的器官特异性损伤。骨髓移植受体发生继发的固体肿瘤的长期风险也增加。

的确，骨髓包括很多参与血液产生(称为血细胞生成)和免疫功能的细胞。血细胞生成涉及来自各种谱系的多种不同细胞种类。多种细胞谱系的恢复对于血液系统的有效功能是有用的。对这些细胞的抑制或损伤可因此影响血液和/或免疫功能。骨髓抑制是骨髓细胞活性降低的病症，可导致红细胞、白细胞和/或血小板的减少。白细胞显著减少称为白细胞减少症，而中性粒细胞(其为一种类型的白细胞)减少称为中性粒细胞减少症(neutropenia)。骨髓抑制很可能是癌症病人化疗最常见的副作用，并可导致白细胞减少症(leucopenia)、中性粒细胞减少症和/或血小板减少症(thrombocytopenia)。或者各种医疗病症可以导致暂时的或慢性的骨髓抑制，其可被病生理病症所诱导或由病生理病症产生。

血小板减少症是血液中的血小板数量异常低，并可导致异常出血的病症。血小板减少性紫癜是血小板减少症中的一种。贫血和出血可与血小板减少症有关。严重和慢性的血小板减少症是癌症治疗的并发症，并难以治疗。

某些生长因子被常规用来分别治疗骨髓抑制以及并发症，如由标准剂量化疗引起的发热性中性粒细胞减少症、贫血以及出血。例如，因子，例如G-CSF、促红细胞生成素和白介素11已被使用(James O.Armitage.Emerging Applications of Recombinant Human GranulocyteMacrophage Colony-Stimulating Factor，Blood，92：449l-4508，1998；DavidJ.Kuter and C.Glenn Begley.Recombinant human thrombopoietin：basicbiology and evaluation of clinical studies.Blood，100：3457-3469，2002；Xunxiang Du and David A.Williams.Interleukin-11：Review of Molecular，Cell Biology，and Clinical Use.Blood 89：3897-3908，1997.)。然而，由于为了取得更好的治疗效果而进行更大剂量化疗方案的施用，越来越经常的出现更大程度的急性和慢性骨髓抑制。重度和慢性的骨髓抑制对生长因子的治疗通常有抗性，并主要通过输血和调整化疗剂量来处理。此外，与重度和慢性骨髓抑制相关的血小板减少症特别难治，因为IL-11(美国食品与药品管理局唯一批准用来治疗化疗诱导的血小板减少症的药物)对血小板产生的疗效有限。血小板生成素被鉴定为能够促进癌症病人中巨核细胞前体存活和成熟以及血小板释放的有希望的生长因子，但是早期临床试验指出血小板生成素在有些病人中有抗原性，而加重病情(David J.Kuter and C.Glenn Begley.Recombinant human thrombopoietin：basic biology and evaluation of clinical studies.Blood l00，3457-3469，2002；Junzhi Li，Chun Yang，Yuping Xia，Amy Bertino，John Glaspy，Michael Roberts，and David J.Kuter.Thrombocytopenia caused by thedevelopment of antibodies to thrombopoietin.Blood，98，3241-3248，2001.)。

这个药物在预防和治疗严重血小板减少症中的价值有待确定。

因此，尽管化疗和放疗在癌症治疗中广泛应用，同时作为骨髓和干细胞移植过程的一部分，这些疗法的有效性通常与副作用密切相关；最常见的副作用为骨髓抑制。由化疗和放疗诱导的轻度至中度骨髓抑制通常在停止治疗后或用生长因子治疗后自行缓解。但是，严重的骨髓抑制绝少自行缓解，并通常会引起感染、出血和甚至死亡。不幸的是，常规使用来加速血液产生恢复的四种FDA批准的生长因子(G-CSF，GM-CSF，白介素-11，和促红细胞生成素)通常对严重和/或慢性骨髓抑制以及多谱系血细胞生成作用的恢复无效。

发明概述

本发明描述了使用培养的(激活的)血细胞治疗骨髓抑制病人以及患血液缺陷，例如贫血、再生障碍性贫血、和/或血小板减少症病人的材料和方法。该措施包括治疗重度和/或慢性骨髓抑制，和多谱系血细胞生成作用的恢复。

本发明的一个实施方案是治疗具有与骨髓抑制相关的血液缺陷的的骨髓抑制病人的方法，包括向病人施用先体外后体内培养的血细胞，以增加血液成分的浓度。另一个实施方案是治疗具有与癌症治疗有关的血液缺陷的人类病人的方法，其涉及向病人施用治疗有效量的先体外后体内培养的血细胞，以增加血液成分的浓度。

在另一个实施方案中，提供了当注射入病人时有效治疗血液缺陷的血细胞量。血细胞的量可以在细胞因子和离子载体(ionophore)存在下培养。细胞因子和离子载体可以以有效浓度存在。细胞因子可以包含白介素2和巨噬细胞集落刺激因子。离子载体可以包括A23187。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗病人中血液缺陷的方法，所述治疗包括向病人施用先体外后体内培养的血细胞，可以向病人施用治疗有效量的血细胞。血细胞可以对病人而言是自体(autologous)的，也可以是同种异体(allogeneic)的，或来自免疫上可接受的所有者。血细胞可进一步于细胞因子和离子载体存在下培养。细胞因子和钙离子载体可以以有效量存在。

在另一个实施方案中，本发明提供了培养血细胞的方法，所述方法包含在细胞因子和离子载体存在下培养血细胞。血细胞可以在，例如有效量的细胞因子和离子载体存在下培养；可以培养在有哺乳动物血清或无哺乳动物血清的培养基中；可以培养一段时间，例如在2到200小时之间或更长时间；也可以在一定温度下培养，例如在30到42℃之间。细胞因子可以包括白介素2和/或粒细胞巨噬细胞集落激活因子。离子载体可以包括A23187。

附图说明

图1显示对本发明疗法有反应的三个病人的H&E染色骨髓活检的低倍显微镜照片。标记为A，C和E的显微镜照片为来自治疗前病人的骨髓。在这些照片中，早期空洞化和受损的骨髓提示严重的再生障碍性贫血。在表示为B，D和F的照片中，骨髓来自治疗后的同一病人。这些骨髓显示分布和细胞构成得到极大改善。

图2为患血小板缺乏的儿童病人在开始用激活的细胞治疗后，以每立方毫米血小板数表示的血小板计数作为天数函数的曲线。

图3为对于患血小板减少症的病人，在用先体外后体内激活的免疫细胞治疗后，血小板计数的曲线。

图4为对于患血小板减少症的病人，在用先体外后体内激活的免疫细胞治疗后，白细胞计数的曲线。

图5为响应先体外后体内激活的免疫细胞的存活曲线，所述免疫细胞在诱导骨髓抑制后施用。

图6为响应先体外后体内激活的同种异体和异种(xenogeneic)免疫细胞的存活曲线，所述免疫细胞在诱导骨髓抑制后施用。

图7为使用不同细胞培养条件的结果曲线，显示响应先体外后体内激活的同种异体和异种免疫细胞的存活，所述免疫细胞在诱导骨髓抑制后施用。

图8为响应先体外后体内激活的免疫细胞的存活曲线，显示贴壁和非贴壁细胞的作用，所述免疫细胞在诱导骨髓抑制后施用。

图9为显示响应先体外后体内激活的异种免疫细胞的恢复率的曲线。

实施方案的详细描述

本文描述了使用培养的(激活的)血细胞治疗骨髓抑制病人和血液缺陷病人的材料和方法，所述血液缺陷例如贫血，再生障碍性贫血，和/或血小板减少症。该方法包括治疗重度和/或慢性骨髓抑制，以及多谱系血细胞生成的恢复。进一步，发明人还公布了先体外后体内激活的免疫细胞在描述为相关的交叉引用的专利申请中的某些用途，见上文，以及Jiayu Chen，Weiwei Liu，Xiaohuai Wang，Huaiyu Chen，JinmingWu，Yi Yang，Lubo Wu，Demao Yang，Ex Vivo Immunotherapy forPatients with Benzene-Induced Aplastic Anemia.Journal of Hematotherapy&Stem Cell Research.12：505-514，2003；and in Demao Yang，Response，Stem Cells and Development.13：162-163，2004。术语“培养的”是指培养细胞的过程，例如在本领域惯常的。“培养”是指为细胞创造激活细胞的细胞机制以产生所需效果的条件。因此将细胞与某些因子一起孵育以激活细胞是培养过程，同样，先体外后体内扩增细胞以增加细胞数量也是培养过程。与此相反，保存或加工细胞，例如通过某一具体类型的冷冻或分离，仅仅是储存或分类细胞。

术语“有效治疗量”是指当施用给患血液缺陷的病人时足够量的本发明的激活的血细胞以导致血细胞计数统计学上的显著增加，所述血液缺陷即天然血液成分浓度显著低，例如红细胞、白细胞、血小板和骨髓产生的其它因子和骨髓产生的细胞。培养的血细胞可来自病人或来自免疫可接受的供体。

经由先体外后体内培养激活血细胞的一个方案包括从病人或免疫学上可接受的供体获得血液样品(例如10-100毫升)，从血液样品中分离血细胞，并培养分离的血细胞。“免疫学上可接受的供体”是具有用来包含血细胞的组织的人，该组织不具有医学上不可接受水平的受体反应(例如溶血性贫血，心力衰竭，肾衰竭)。血细胞可以通过例如离心的方法与血清分离。分离的血细胞在无菌条件下在培养基中与一种或多种细胞因子(以包括细胞激活因子)和离子载体一起培养。可选择的，可使用如本文所述的其它激活因子。分离的血细胞可以在如上规定的培养基中培养，例如，培养时间大于约一小时，以及在其它方案中约10到200小时，或约20到80小时，或约30到60小时，温度例如约30到42℃，在其它方案中约32到40℃，或约37到38℃，或其中包含的任何范围。本领域技术人员会认识到可考虑这些明确范围内的其他时间和温度范围，也应包括在此公开的范围之内。

某些实施方案针对培养血细胞，特别是外周血单核细胞(PBMC)。在最先由Boyum(见Boyum，A.(1964)Nature，204，793-794，and Boyum，A.(1967)Scan，J.Lab.Clin.Invest Suppl.)应用后，PBMC的分离自1960年代已使用各种技术被实施。使用PBMC的有些实施方案是有利的，因为不需要分离仅一种细胞类型，因此可以避免捕获基本上仅一种细胞类型的复杂操作。某些实施方案针对至少2-20种细胞类型的血液培养；本领域普通技术人员将认识到这一明确范围内的所有值都被考虑和描述。人们认识到分离单一细胞类型的操作可能具有以不需要的细胞类型存在的不需要的杂质，但这种纯化制品基本上包含仅一种细胞类型。此外，认识到在一些情形下，单一细胞类型可被视为具有多种亚型；然而，这种纯化的培养物捕获具有某种共同特征的细胞类型，使得该细胞类型可以被表征为单一细胞类型。在此所描述的有些方法涉及捕获多种血细胞类型，其数目可以根据特定仪器、操作者或细胞类型计数方法而有差异。然而，考虑到所述方法和血液中的各种细胞类型，本领域普通技术人员将意识到，这种方法的某些实施方案将不可避免地如所述捕获若干细胞类型，例如至少2-20。

某些实施方案涉及培养血细胞以产生各种血细胞类型。因此，不管用于启动血细胞培养的细胞类型数目和细胞的确切类型，培养过程可以是定向的，以产生血细胞，并产生多种血细胞类型。血细胞从存在于骨髓的某些多能性细胞形成，所述多能性细胞是血细胞的先祖，但不成为血细胞，直到它们分化以显示可鉴定为血细胞的功能特征。

在被培养后，可以洗涤激活的血细胞(例如，用无菌生理盐水溶液洗两次)。然后将治疗有效量的激活血细胞施用给病人。施用激活的血细胞的一种可接受的方法是静脉内。虽然激活的细胞可以以单一剂量施用，几份激活的血细胞也可以在一段时间内施用。例如，可以每周一次，共四周，向病人施用本发明的激活的血细胞的剂量。然而，可以以例如半周、10天、14天、21天、其他间隔时间、或其他有效时间的间隔向病人施用本发明的激活的血细胞的剂量。然而，间隔在治疗过程中也可变化。例如，一开始血细胞剂量可以以每天、一周两次，一周一次和/或两周一次的间隔施用。剂量可以为，例如每次处理约1×10⁵到5×10⁸细胞，取决于病人的年龄和状况。治疗所需的总时间(例如施用本发明的激活的血细胞)取决于可得到的激活血细胞数量和病人反应。病人反应可根据向正常血细胞计数的回复和/或骨髓组织学以及健康的整体改善来测量。很明显，在初始治疗阶段中或之后可以反复从病人取血样，从而可得到额外的激活的血细胞用于进一步治疗。此外，来自免疫学上可接受供体的激活血细胞可以在一开始施用，或在治疗的整个持续时间内施用。可选择的，用本发明的方案激活的来自病人的血细胞可以在一开始施用来自免疫学上可接受供体的血细胞后施用。

许多起源自骨髓抑制的疾病，例如血液缺陷，可以用本文描述的方法治疗。通常，血液缺陷涉及血液成分的浓度减少，所述血液成分源自骨髓或源自来自骨髓的产品，例如特定细胞类型。血液缺损包括，例如贫血、再生障碍性贫血和血小板减少症，例如血小板减少性紫癜。贫血可以广泛地理解为血液成分的缺陷，或在某些情形下，红细胞缺陷。再生障碍性贫血是外周血液成分的缺乏。血小板减少性紫癜，例如原发性血小板减少性紫癜，涉及血小板数目缺陷。

作为具体举例，随后的讨论以及实施例1较详细地叙述再生障碍性贫血，虽然治疗方法可被更广泛地应用。例如，在此也涉及血小板减少性紫癜，例如在实施例2中，同样也涉及癌症治疗引起的骨髓抑制，例如在实施例3中。下面描述和讨论了骨髓抑制后多谱系血细胞生成作用的恢复，例如在实施例4中。

重度再生障碍性贫血的最新定义是显著的各类血细胞减少症，具有下列两个指标：1)粒细胞少于500/毫升，2)血小板少于20,000/毫升，3)具有经纠正的网织红细胞计数少于1％的贫血，以及造血细胞耗减的显著骨髓发育不全。中度再生障碍性贫血通常涉及不严重的骨髓细胞减少和至少两个细胞系的细胞减少。最初可能没有症状，一开始的主诉可以为贫血引起的持续性乏力和虚弱，在有些情况下有出血。由于血小板减少症，出血通常发生在皮肤和粘膜被覆。除了严重中性粒细胞减少症之外，感染罕见。体检显示苍白，可能有皮下出血或瘀斑。再生障碍性贫血病人不显示淋巴结病或脾肿大。可以有或没有发烧。外周血检查显示各类血细胞减少症。不成熟的红细胞和白细胞的出现强烈提示不存在再生障碍性贫血。

由于红细胞生成压力增大，红细胞可以轻微增大，并且通常它们的细胞和细胞核正常。纠正的网织红细胞计数非常低或接近零，显示缺乏红细胞造血。出血时间可以延长，即使凝血参数正常。病人血清中铁含量可以增加但转铁蛋白本身正常，导致转铁蛋白饱和度上升。血浆铁的清除率由于红细胞生成减少而减少。骨髓干燥化，抽吸取样难。但可以骨髓活检显示严重细胞减少，或骨髓发育不良并用脂肪代替。由于在有些病例中一开始骨髓活检显示细胞过多，可能需要不止一次活检才能精确诊断。重度骨髓抑制可见所有造血前体细胞减少，包括来自骨髓的、红细胞系统的、多能性细胞系和巨核细胞。诊断通常建立在在血和骨髓样品中发现传统的三联征上：贫血，中性粒细胞减少和血小板减少。有时需要X线检查以排除骨病灶或肿瘤侵入。磁共振成像对清楚地确认发育不全的骨髓有用。由于诊断是用排除法，通常只有在各类血细胞减少症的所有其它诱因和其它实验室结果都被排除以后，才诊断再生障碍性贫血。

再生障碍性贫血的基本缺陷在于骨髓抑制，所以所有细胞系的产生都受到影响。再生障碍性贫血可能的病理机理是：1)造血干细胞的缺陷或丧失，2)骨髓微环境的异常，3)调节细胞的异常，和4)免疫细胞对血细胞生成的破坏。

尽管该病的病生理不是十分清楚(Young et al.，The pathophysiologyof acquired aplastic anemia，N.Engl.J.Med.1997；336(19)：l365-1372 andYoung et al.，The treatment of severe acquired aplastic anemia，Blood.1995；85(12)：3367-3377)，有证据支持再生障碍性贫血是免疫介导的疾病的理论。骨髓移植以及联合使用抗淋巴细胞球蛋白环孢菌素的免疫抑制疗法已被用于治疗(Rosenfeld et al.，Intensive immunosuppression withantithymocyte globulin and cyclosporine as treatment for severe aplasticanemia，Blood 1995；85(11)：3058-3065 and Halperin et al.，Severe acquiredaplastic anemia in children：11-year experience with bone marrowtransplantation and immunosuppressive therapy，Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.1989；11(3)：304-309)。然而，免疫抑制疗法经常有不希望发生的和严重的副作用。此外，造血生长因子例如粒细胞集落刺激因子(Kojimaet al.，Treatment of aplastic anemia in children with recombinant humangranulocyte-colony stimulating factor，Blood 1991；77(5)：937-941 andSonoda et al.，Multilineage response in aplastic anemia patients followinglong-term  administration of filgrastim(recombinant human granulocytecolony stimulating factor)，Stem Cells 1993；11：543-554)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Champlin et al.，Treatment of refractory aplastic anemiawith recombinant human granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor，Blood 1989；73(3)：694-699 and Guinan et al.，A phase I/II trial ofrecombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor for childrenwith aplastic anemia，Blood 1990；76(6)：1077-1082)，以及白介素-3(Ganser et al.，Effect of recombinant human interleukin-3 in patients withnormal hematopoiesis and in patients with bone marrow failure，B lood 1990；76(4)：666-676 and Nimer et al.，A phase I/II study of interleukin-3 inpatients with aplastic anemia and myelodysplasia，Exp.Hematol.1994；22：875-880)仅能够提供有限和短暂的效果。

许多病人对免疫抑制疗法有反应，在发育不良病人中各种免疫分子水平异常。例如，由巨噬细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、和内皮细胞产生的白介素-1，通过在骨髓抑制诱导后诱导骨髓基质细胞释放红细胞系统和多能性集落刺激因子，调节早期先祖细胞和刺激干细胞恢复，在免疫应答和血细胞生成调节中起重要作用。再生障碍性贫血中的免疫失衡表现为自然杀伤细胞活性的减少，激活的抑制性T细胞数量增多，白介素-2和γ-干扰素的不正常产生。

自然杀伤细胞是较大的具颗粒的淋巴细胞，通过直接接触裂解肿瘤细胞或病毒感染的靶细胞。自然杀伤细胞也产生γ-干扰素、白介素-2，并诱导集落刺激活性。在某些情况下这些细胞可以抑制骨髓的和红细胞系统的的集落形成。例如，当培养物中不存在外源生长因子时，自然杀伤细胞通常产生生长因子并支持血细胞生成。但是，合适的培养条件诱导自然杀伤细胞抑制血细胞生成。在血细胞生成恢复后，再生障碍性贫血病人的自然杀伤细胞活性也恢复正常。

γ-干扰素由激活的淋巴细胞产生，并抑制血细胞生成。虽然再生障碍性贫血病人显示γ-干扰素过量产生，γ-干扰素水平响应免疫抑制而降低。干扰素是造血细胞集落形成的强抑制剂-既通过对先祖细胞的直接作用，也通过经由附属的免疫系统细胞的间接作用而加以抑制。

肿瘤坏死因子α是再生障碍性贫血中过量分泌的另一因子。它的作用是抑制正常血液学先祖的集落生长。肿瘤坏死因子α值高与血小板、血红蛋白和白细胞计数降低相关。肿瘤坏死因子α和γ-干扰素可以相互协同作用，以抑制血细胞生成。

再生障碍性贫血病人产生过量的γ-干扰素和肿瘤坏死因子α，显示辅助性T细胞：抑制性T细胞比例倒置，骨髓中抑制性T细胞占大多数。这些细胞通过产生细胞因子介导血细胞生成的抑制。与外周血相比，骨髓中也具有较高比例的细胞毒性T细胞。成功的骨髓抑制疗法后激活的淋巴细胞减少，提示免疫机能障碍的临床相关性。

获得性再生障碍性贫血的一般机制，以及特别是苯诱导的再生障碍性贫血的机制，不是完全清楚。然而，这两种类型的再生障碍性贫血在病生理和临床表现上有很多的相同点。现有两种假设解释再生障碍性贫血的机制，即直接损伤和免疫介导的。这两种假设都为实验和临床研究数据所支持。细胞毒性化疗和放疗后对骨髓细胞的直接损伤被认为导致暂时性和可逆的骨髓衰竭。免疫介导的骨髓衰竭更难治愈。在苯诱导的再生障碍性贫血病例中，该病似乎与两种机制都有关。对骨髓细胞直接损伤的证据受到如下研究支持：该研究显示苯参与抑制骨髓细胞中多种生化过程。具体来说，苯被显示损伤骨髓基质巨噬细胞，从而导致白介素-1生产缺陷(Niculescu et al.，Inhibition of the conversion ofpre-interleukins-1[alpha]and 1[beta]to mature cytokines by p-benzoquinone，a metabolite of benzene，Chemico-Biological Interactions；1995；98：211-222and Kalf et al.，p-benzoquinone，a reactive metabolite of benzene，preventsthe processing of pre-interleukins-1[alpha]and-1[beta]to active cytokinesby inhibition of the processing enzymes，calpain，and interluekin-1[beta]converting enzyme，Environmental Health Perspectives；1996；104(suppl.6)：1251-1256)。白介素-1被认为对干细胞的生长和分化很重要(Bagby，G.C.，Production of multi lineage growth factors by hematopoietic stromalcells：an intercellular regulatory network involving mononuclear phagocytesand interleukin-1，Blood Cells 1987；13：147-159 and Fibbe et al.，Humanfibroblasts produce granulocyte-CSF，macrophage-CSF andgranulocyte-macrophage-CSF following stimulation by interleukin-1 andpoly(rl).poly(rC)，Blood 1988；72(3)：860-866)。尽管如此，还没有造血生长因子包括白介素-1治疗能带来长期反应的报道。

重度和慢性血小板减少症是癌症治疗的并发症，治疗起来非常困难。但是，如本文所示，例如在实施例3中，这种病症可以用细胞激活疗法成功治疗。在实施例3中，有12名肿瘤病人已经常规大剂量化疗和/或放疗无效。所有这些病人的血小板计数少于20,000/毫升。在这些病人中，6人白细胞计数也减少，尽管他们曾经接受过常规的大剂量G-CSF治疗但无效。为了治疗这些病人，来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)在体外与生长因子和钙动员剂(mobilizing agent)组合培养两天，激活的细胞静脉内输注一周三次。治疗1-4周后，10名患血小板减少症的病人对该疗法有反应，血小板计数增加到40,000/毫升，而所有白细胞计数低的病人都获得较高水平的白细胞。该疗法安全，病人适应性好，副作用少。培养的细胞产生广泛的细胞因子。与这些研究相关的数据显示本文披露的疗法对于减轻血小板减少症是有用的，即使当其为重度和慢性时。

并且，例如，骨髓抑制导致体内造血能力的损害。在此公开了基于细胞的免疫疗法以治疗这种骨髓抑制，其通过使用小鼠模型来证明，参见实施例4。在实施例4中，同系脾细胞和异种人类外周血单核细胞与细胞因子和钙动员剂组合先体外后体内培养两天，激活的免疫细胞被静脉内注射入接受大剂量化疗和放疗的小鼠，受治疗的小鼠显示存活率增高和造血恢复。该疗法高度有效，单次注射能模拟多谱系造血恢复和促进存活。在研究该机制时，发现先体外后体内培养的免疫细胞产生多种免疫因子，贴壁细胞比非贴壁细胞在增进存活上更有效。还发现在正常小鼠中该疗法与G-CSF相比较少动员已有干细胞。

培养基

用于先体外后体内激活的合适培养基给血细胞提供必需的营养。这些培养基通常包含，例如无机盐，氨基酸，维生素，和其它化合物，它们都呈可被血细胞直接利用的形式。通过举例但不是为了限制，一种合适的培养基是RPMI-1640。然而，其它培养基，如无血清培养基AIM-V会支持培养物中的血细胞，也是适合的。可以给培养基补充哺乳动物的血清，例如胎牛血清，其水平占培养基重量的约0.1-50％，约1-40％，或约5-15％。RPMI的一个合适配方命名为改进的RPMI 1640，并且可以根据美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)目录号30-2001获得，它有如下的组分：

无机盐    (克/升)

Ca(NO₃)₂·4H₂O          0.10000

MgSO₄(无水)             0.04884

KCl                     0.40000

NaHCO₃                  1.50000

NaCl                    6.00000

Na₂HPO₄(anhydrous)      0.80000

氨基酸                  (克/升)

                                     

L-精氨酸(游离碱)        0.20000

L-天冬酰胺·H₂O         0.05682

L-天冬氨酸              0.02000

L-胱氨酸·2HCl          0.06520

L-谷氨酸                0.02000

L-谷氨酰胺              0.30000

甘氨酸                  0.01000

L-组氨酸(游离碱)        0.01500

羟基-L-脯氨酸           0.02000

L-异亮氨酸              0.05000

L-亮氨酸                0.05000

L-赖氨酸·HCl           0.04000

L-甲硫氨酸              0.01500

L-苯丙氨酸              0.01500

L-脯氨酸                0.02000

L-丝氨酸                0.03000

L-苏氨酸                0.02000

L-色氨酸                0.00500

L-酪氨酸·2Na·2H₂O     0.02883

L-缬氨酸                0.02000

维生素                  (克/升)

                                     

D-生物素                0.00020

氯化胆碱                0.00300

叶酸                    0.00100

肌-肌醇(myo-Inositol)   0.03500

烟酰胺                  0.00100

对-氨基苯甲酸           0.00100

D-泛酸                  0.00025

(hemicalcium)

吡哆醇(Pyridoxine)·HCl 0.00100

核黄素                  0.00020

硫胺素·HCl             0.00100

维生素B-12              0.000005

其它                    (克/升)

                                    

D-葡萄糖                4.50000

谷胱甘肽(还原的)        0.00100

HEPES                   2.38300

酚红，钠盐              0.00500

丙酮酸钠                0.11000

1. 细胞因子在存在一或多种细胞因子时培养血细胞可以用其激活血细胞。细胞因子是小的蛋白质(通常大小在5-20kD的范围)，它们由细胞释放并对细胞细胞之间的相互作用、交流和其它细胞的行为起特定作用。细胞因子通常包括白介素、淋巴因子和信号分子，例如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素。尽管可以使用天然的细胞因子，也可应用重组产生的(例如通过已建立的核酸表达系统产生的)细胞因子。同样地，也可应用保持功能的修饰过的和突变过的形式的天然细胞因子。适合于本发明的一些方案的举例细胞因子包括：

A. 白细胞介素各种影响具体类型细胞功能、少量存在的自然存在的多肽。它们是由淋巴细胞、单核细胞和多种其它细胞产生的分泌型调控蛋白质，并且它们由细胞响应抗原和非抗原性刺激而释放。白细胞介素，现在鉴定了其中的16种，通过调节淋巴样细胞和其它细胞的生长、移动性和分化来调控炎症和免疫。白细胞介素可以以约10-50,000IU/毫升，约100-5,000IU/毫升，或约100-1,000IU/毫升的浓度存在。可选择地，白细胞介素可以有效浓度存在。白细胞介素的有效浓度是用本操作激活血细胞的任何浓度。

i. 白细胞介素-1(IL-1)IL-1是可溶性蛋白(17kD，152个氨基酸)，由参与T和B淋巴细胞的激活并可增强它们对抗原或促分裂原的应答的单核细胞、巨噬细胞或辅助细胞分泌。IL-1的生物作用包括能够代替使T细胞激活的对巨噬细胞的需求，以及影响广泛的其它细胞类型。至少两个IL-1基因是已知的，而且识别了IL-1的α和β型。在免疫系统应答的早期，IL-1由单核细胞和巨噬细胞分泌。它刺激T细胞增殖和蛋白质合成。IL-1的另一个作用是导致发热。

ii. 白细胞介素-2(IL-2)IL-2是由受刺激的T淋巴细胞释放的激素样物质。IL-2使其它T淋巴细胞不依赖于抗原而激活和分化。IL-2刺激免疫系统中某些抗病血细胞的生长，并由Th1CD4细胞分泌，来刺激CD8细胞毒性T淋巴细胞。IL-2还增加CD4细胞本身的增殖和成熟化。

iii. 白细胞介素-3(IL-3)IL-3是促分裂原激活的T细胞的产物，是针对骨髓干细胞和肥大细胞的集落刺激因子。IL-3被认为是造血细胞集落刺激因子之一。

iv. 白细胞介素-4(IL-4)IL-4是由激活的T淋巴细胞产生的可溶性细胞因子，其通过使B细胞增殖和分化来促进抗体的产生。IL-4诱导B细胞上的II类主要组织相容性复合物以及fc受体的表达。IL-4也对T淋巴细胞、肥大细胞系、和几种其它造血细胞系包括粒细胞、巨核细胞、红细胞前体及巨噬细胞起作用。

v. 白细胞介素-5(IL-5)IL-5是在血细胞生成中促进嗜酸性粒细胞分化和激活的因子。它也刺激激活的B细胞最终分化成分泌Ig的细胞。

vi. 白细胞介素-6(IL-6)IL-6刺激人B细胞的生长和分化，它也是针对杂交瘤和浆细胞瘤的生长因子。它由包括T细胞、单核细胞和成纤维细胞在内的多种不同细胞产生。IL-6是单链的25kD的细胞因子，它最初被描述为前B细胞的生长因子，但现在已知它对也刺激增殖的包括T细胞在内的一些其它细胞也有作用。

vii. 白细胞介素-7(IL-7)IL-7是促进B细胞前体生长的造血生长因子，并与IL-2一起共同促分裂(co-mitogenic)使成熟T细胞激活。IL-7由骨髓基质细胞产生。

viii. 白细胞介素-8(IL-8)IL-8是激活中性粒细胞并吸引中性粒细胞和T淋巴细胞的细胞因子。IL-8由受到炎性刺激的多种细胞包括单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞分泌。IL-8是β-血小板球蛋白超家族的成员并且在结构上与血小板因子4相关。

ix. 白细胞介素-9(IL-9)IL-9是由T细胞产生的(特别是在促分裂原刺激时产生的)细胞因子。IL-9刺激红细胞前体细胞(BFUE)的增殖并被认为是血细胞生成的调节物。IL-9可与红细胞生成素协同作用。IL-9的受体属于造血受体超家族。已经显示IL-9可增加人的肥大细胞和原巨核细胞型白血病细胞以及鼠的辅助T细胞克隆的生长。IL-9是衍生自T细胞的糖蛋白并且定位在人的第5条染色体上。

x. 白细胞介素-10(IL-10)IL-10是由Th2辅助T细胞、一些B细胞和LPS激活的单核细胞产生的因子。它是肥大细胞生长的辅调蛋白。

xi. 白细胞介素-11(IL-11)IL-11是最初由灵长类骨髓基质细胞系中分离的多效细胞因子，它能调控抗原特异性抗体应答、增强巨核细胞并调节骨髓脂肪生成。IL-11刺激T细胞依赖的B细胞成熟、巨核细胞生成(megakaryopoiesis)和骨髓分化的多个阶段。

xii. 白细胞介素-12(IL-12)IL-12是75kD的异源二聚体细胞因子，它由二硫键键合的40kD和35kD亚单位组成。原来可以通过它与不足最佳浓度的IL-2协同刺激细胞毒性效应细胞的能力来对其作鉴定。IL-12由对感染应答的巨噬细胞释放，并促进细胞介导的免疫的激活。具体地，IL-12刺激Th1CD4细胞的成熟、特异性的细胞毒性T淋巴细胞应答和NK细胞活性的增加。因此，IL-12是细胞介导的免疫的起始子。IL-12增强NK细胞的裂解(lytic)作用，诱导干扰素的产生，刺激激活的T细胞和NK细胞的增殖。它可由人B类淋巴母细胞(NC37)分泌。

xiii. 白细胞介素-13(IL-13)IL-13是T淋巴细胞衍生的细胞因子，可造成未成熟B细胞的增殖、免疫球蛋白同种型转换和免疫球蛋白产生。IL-13由激活的T细胞产生，它抑制单核细胞的IL-6产生，并抑制其它促炎细胞因子例如TNF、IL-1和IL-8的产生。IL-13刺激B细胞。IL-13的基因位于在人类染色体5q上也含有IL-4基因的基因簇中。

xiv. 白细胞介素-14(IL-14)IL-14是诱导B细胞增殖、抑制免疫球蛋白分泌、以及选择性地扩展某些B细胞亚群的细胞因子。

xv. 白细胞介素-15(IL-15)IL-15是刺激T淋巴细胞的增殖并与IL-2具有共同生物活性的细胞因子。IL-15也可诱导B淋巴细胞的增殖和分化。

xvi. 白细胞介素-16(IL-16)IL-16是由激活的T淋巴细胞产生的、刺激CD4⁺淋巴细胞和单核细胞的迁移的细胞因子。

B. 淋巴因子  淋巴因子是由白细胞产生的作用于其它细胞的物质。例子有白细胞介素、干扰素α、淋巴毒素(肿瘤坏死因子α)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。

i.干扰素(IFN)是由人类细胞分泌的一族糖蛋白，其通常具有通过抑制细胞中的病毒复制来抵抗病毒感染的功能。干扰素可能以与白细胞介素相同的浓度存在。

可选择地，干扰素可以有效浓度存在。干扰素的有效浓度应当包括血细胞被本操作激活的浓度。在病毒感染后，IFN干扰素α由白细胞分泌而干扰素γ由成纤维细胞分泌。

1. 干扰素γ是由T淋巴细胞应特异性的抗原或促分裂原刺激而产生的干扰素。

2. 干扰素α包括由白细胞应病毒感染或双链RNA刺激而产生的一些不同亚型。干扰素-α-2A和-2B是用重组DNA技术产生的蛋白质产物，并用作抗肿瘤剂。干扰素-α是I型干扰素之一，它由外周血白细胞或类淋巴母细胞通过接触活的或者灭活的病毒、双链RNA或细菌产物而产生。它是由所培养的病毒诱导的白细胞产生的主要产物。除了显著的抗病毒活性之外，它可以激活自然杀伤细胞。

3. 干扰素α-2a是由165个氨基酸残基组成的I型干扰素，它在位置23为赖氨酸。此蛋白质由重组DNA技术产生，并且类似于由白细胞分泌的干扰素。它主要用作抗病毒或抗肿瘤剂。

4. 干扰素α-2b是由165个氨基酸残基组成的I型干扰素，它在位置23为精氨酸。此蛋白质由重组DNA技术产生，并且类似于由白细胞分泌的干扰素。它主要用作抗病毒或抗肿瘤剂。

5. 干扰素β是由成纤维细胞应与干扰素α相同的刺激而产生的干扰素。干扰素β是由成纤维细胞应活的或者灭活的病毒或双链RNA刺激而产生的I型干扰素之一。它是具有抗病毒、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。

6. 干扰素-β2(白细胞介素-6)是刺激人B细胞的生长和分化的细胞因子，它也是针对杂交瘤和浆细胞瘤的生长因子。它是由包括T细胞、单核细胞和成纤维细胞在内的多种不同细胞产生的。

INF-β2是单链的25kD的细胞因子，原来它被描述为前B细胞的生长因子，现在知道它对于也刺激增殖的一些其它细胞包括T细胞有作用。INF-β2是急性时相反应蛋白的诱导物，也是作用于小鼠骨髓的集落刺激因子。

7. 干扰素γ是由T淋巴细胞应特异性的抗原或促分裂刺激而产生的。

ii. 肿瘤坏死因子(TNF)是在接触了细菌脂多糖的动物血液中存在的肿瘤抑制因子。TNF在体内和体外优先杀伤肿瘤细胞，造成小鼠中某些移植肿瘤的坏死并抑制肿瘤的转移(experimental metastases)。人类TNFα是157个氨基酸的蛋白质，并且有广泛的促炎性作用。TNF可以与白细胞介素以相同浓度存在。可选择地，TNF可以有效浓度存在。在人工条件下，其浓度可以是有效浓度，被定义为用本发明的血细胞制备方法时所产生的浓度。

C. 细胞刺激因子.在本发明的范围内，在存在一个或多个细胞刺激因子时激活血细胞可以有效减轻再生障碍性贫血。细胞刺激因子应该包括这些物质如粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和巨噬细胞集落刺激因子。细胞刺激因子可以约10-50,000IU/毫升，约10-10,000IU/毫升或约10-1000IU/毫升的浓度存在。可选择地，细胞刺激因子可以有效浓度存在。细胞激活因子的有效浓度是指用本发明操作激活血细胞的任何浓度。

1. 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：G-CSF是由多种细胞产生的糖蛋白质分子，其参与造血干细胞的生长和分化。另外，这些因子刺激干细胞的末端细胞功能活性。

2. 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)：GM-CSF是有内部二硫键的23kD的酸性糖蛋白。GM-CSF是应一些炎性介质刺激由在造血环境以及炎症的外周部位中存在的间充质细胞产生的。GM-CSF刺激骨髓产生中性粒细胞、巨噬细胞和混合的粒细胞-巨噬细胞集落，并刺激胎肝祖细胞(fetal liver progenitor cell)形成嗜酸性粒细胞集落。

3. 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)：M-CSF是由间充质细胞合成的，它刺激骨髓中多能干细胞的分化成为单核细胞(单核吞噬细胞)。此化合物刺激单核细胞-吞噬细胞系列的造血细胞的存活、增殖和分化。M-CSF是mw为70kD的二硫键键合的糖蛋白二聚体，并且它结合单一类型的高亲和力受体，此种受体与c-fms原癌基因的产物等同。

2. 离子载体离子载体是钙或其它阳离子特异性试剂(例如polypeptrates)，其可以穿透脂质双层或可溶性脂质(lipid soluble)。离子载体有两种类型：载体和通道形成物(channel former)。载体，例如缬氨霉素，在特定的离子周围形成笼形结构，自由散布于双层的疏水区域。通道形成物，例如短杆菌肽，在细胞膜中形成连续的水性孔(continuousaqueous pore)，以利于离子的通过(defuse)。除了上述离子载体，本操作适用的离子载体可包括A23187(钙霉素(calcimycin))，离子霉素(ionomycin)，格尔德菌素(geldanamycin)，莫能菌素(monensin)(钠盐)，制霉菌素(nystatin)，多粘菌素B硫酸盐和雷帕霉素(rapamycin)。载体例如A23187被认为可随pH梯度聚集钙阳离子。A23187含有可解离的羧酸基团，可催化质子与其它阳离子的电中性跨膜交换(Hyono et al.，BBA389，34-46(1985)：Kolber and Haynes，Biophysics Journal，36，369-391(1981)；Hunt and Jones，Biosci.Rep.，2，921-928(1982))。A23187的两个分子以羧酸阴离子存在，因此可携带质子或等价物(equivalent)，并在释放转运二价阳离子后反向穿过细胞膜。如果存在离子载体，它可以约1-10,000ng/毫升，约1-1000/ng毫升或约10-500ng/毫升的浓度存在。可选择地，离子载体可以有效浓度存在。离子载体的有效浓度指按照本发明操作激活但不过度激活血细胞的任何浓度。浓度过量的激活剂在本文所述的治疗方法中可能不太有效。

用途，包装和分配

传递激活的细胞可以给病人的临床参数带来统计学上显著的改善。例如，施用本文所述的激活细胞可以显著增加病人的白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白水平和血小板的计数。一般来讲，持续本文所述的治疗方法可以使血液水平恢复到正常。病人的白细胞计数、红细胞计数、和血红蛋白中的每一项在四次治疗后，在一些实施方案中可以增加至少约20％，在其它实施方案中增加至少约35％，而在另外的实施方案中增加至少约50％。同样的，血小板计数在一些实施方案中增加至少约25％，在其它实施方案中增加至少约50％，而在另外的实施方案中增加至少约100％。本领域的一般技术人员理解本发明的公开包括在表述的明确范围内的血液参数改善的其它范围。

用于激活的化合物，例如一种或多种细胞因子和/或一种或多种离子载体，可以与合适的细胞培养基或其部分混合来用于分配。在可选择的实施方案中，一种或多种用于激活的化合物可以与培养基或其部分一起包装来作运输。相似的，可将用于激活的化合物的所需组合，例如一种或多种细胞因子和一种或多种离子载体，混合或者在分开的单元中，一起包装来作运输。在这些实施方案的任何一项中，培养基和/或用于激活的化合物都可以与任何剩余的培养基组分和/或用于激活的化合物混合，来形成所需要的用于培养细胞的培养基，其可在一定条件激活所述细胞。同样，在这些实施方案的任何一项中，包装在一起的组合物可包括，例如完成具有激活性质的细胞培养基的说明书和/或进行细胞培养的说明书。

可在治疗病人的设备中进行细胞培养，或者可以在远处的地点进行为了激活细胞的细胞培养。无论哪种情况，可在细胞培养收获后的短时间内将被激活的细胞施用给病人，以确保细胞仍存活。可选择地，可以在保持细胞存活的条件下将细胞储存。例如，可以将细胞与冷冻保护剂一起储存在液氮温度。可以在施用给病人的合适时间，例如用已知方法制备细胞。例如，可以在缓冲生理盐水溶液中悬浮细胞。例如，可以将其它已知的载体用于细胞的传递。

实施例

实施例1一再生障碍性贫血的治疗

I.病人

八个病人经查明有1至6年由于职业的原因接触苯的历史，经本人同意，进行本发明所述治疗。八个病人中有1男7女，年龄在24到41岁之间。全部病人都出现了身体虚弱，头昏眼花，昏厥和心率加快等症状。在这些病人中，其中有4人入院治疗是因为他们有急性的出血症状，入院后需要输血或血小板。其他4人则是慢性症状，分别进行了4个月，6个月，15个月等的标准治疗。从所有病人获得骨髓活检和抽吸样品，以证实血细胞生成。毒性水平的苯存在于所有病人的血液和骨髓中。

II.外周血单核细胞的纯化和细胞培养

取病人血样品(40-50毫升)通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(PBMC)。分离出来的PBMC置于合适体积(基于细胞浓度)的RPMI 1640培养液在无菌条件下培养48小时。培养液中含有10％胎牛血清，500IU/毫升白细胞介素-2(IL-2)(Chiron，Emeryville，美国加利福尼亚)、200IU/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Immunex，Seattle，美国加利福尼亚)、100ng/毫升A23187钙离子载体(Sigma，St.Louis，MO)，细胞培养浓度为2×10⁶细胞/毫升。培养完毕后，将贴壁细胞从培养瓶塑料表面上轻轻刮下，并与非贴壁细胞一同离心收集。离心后的细胞在底部形成团块以收集细胞。不同的病人得到不同数量的细胞。收集的细胞在生理盐水中洗涤两次，洗好的细胞先重悬于5～10毫升生理盐水中进行计数，然后再稀释于50毫升生理盐水中输入给病人。

治疗方案

其中一病人(HC)由于血细胞计数低并且伴有严重出血和感染，对此病人在前三次的治疗中使用了激活的同种异体PBMC。对其他的病人，静脉施用50ml生理盐水中的激活的PBMC。这种治疗每周一次，至少连续治疗四周。向特定病人给药的细胞数量取决于从病人中得到的细胞数量。

III. 结果

血液学参数

血液学的参数，白细胞计数，红细胞计数，血红蛋白水平和血小板计数在对每一个病人治疗前后都在监控并且列在表1中。从这些病人得到的数据表明这种治疗在增加外周血细胞的计数方面是有效的。六个病人在不止一个所列亚型中有所改善，两个病人则血小板计数有好转。大多数病人在两次治疗之后血细胞计数开始改善，并在施用本发明的激活细胞期间持续改善。通过四次治疗后，八个病人中有7个的血液学参数到达正常水平或接近正常水平。虽然总体来说病人的血细胞计数因治疗而得到改善，改善并不是均匀一致的，例如，有些病人的红细胞计数有小幅度改善，但血小板计数却有大幅度增加。注意到所有病人的血小板计数都有显著增加。

病人HC有比其他病人更为严重的急性症状。另外，病人HC还有伴有出血症状。由于从病人HC中得到的外周血细胞数量有限，所以同种异体PBMC被用于刺激病人HC的血细胞生成。使用同种异体细胞经过三次治疗后，病人HC的血计数开始好转。使用同种异体细胞经过三次治疗后，自体PBMC被用于随后的治疗。经过六次治疗后，虽然病人HC的血液学参数还没有纠正到正常水平，但病人HC持续好转。

由于施用本免疫治疗所带来的不适从轻度到中度。5个病人没有表现出显著不适。3个病人在灌输了细胞后出现寒颤，37℃至39℃的发热，头痛，恶心，呕吐和食欲降低。尽管如此，这些症状是暂时的，绝大多数持续一至两天。如果病人有不适时，施用阿司匹林。

骨髓造血作用

在治疗前和最后治疗后两星期，从所有病人获得骨髓活检和抽吸样品。如图1所示，在治疗之前，从三个最严重的病人的骨髓样品组织学中看出病人骨髓已有严重损伤。施用治疗后，发现骨髓组织学明显改善。尽管如此，对于病人HC而言，病人HC骨髓中所观察到的改善与外周血细胞计数的改善并不同步(couple)。

输血

开始治疗之前，八个病人中有4个病人症状严重，伴随有出血。这四个病人在治疗前和治疗期间要定期地给他们输入全血或血小板。经过四次治疗后，没有一个病人有出血了，全血和血小板的输入也停止了。

持续时间

本发明的以细胞为基础的治疗的有益效果不是暂时的。当治疗停止后，所有的病人的血液学参数都继续好转或稳定。一些女病人的血细胞计数在月经期有些波动，但没有一个病人的病症复发。对治疗有反应的病人LC自从最后一次治疗后已超过两个月表现为状况稳定(图2)。

讨论

此项研究的结果表明将激活的PBMC施用给再生障碍性贫血病人是高度有效的。有些病人的骨髓组织学上已接近正常，但外周血液参数还没有达到完全正常。关于这一点，看来骨髓的组织学恢复和外周血细胞计数的恢复之间存在时间差。紧密监视表现出这一时间差的病人，病人的血液参数显示出继续改善。这些病人有时需要几个星期或几个月的时间其外周血细胞的计数才能达到正常。

对研究中得到的数据进行分析可以看到，在不同的血液成分中，从治疗中获益的病人中血小板的增加是最明显、显著和快速的。血小板计数最初的增加很可能是因为血小板具有较快的生成和分化间隔。血液的其它细胞类型，例如中性粒细胞、粒细胞和网织红细胞也得到了改善，与所列的四个参数相一致(数据未显示)。与其它血细胞相比，血小板计数很可能对苯毒性更具有反应性，但由于它们较快的生成间隔，也是对本发明的疗法最有反应性的。

获得性再生障碍性贫血是一种难治愈的疾病。然而，本发明的免疫抑制疗法在治疗该疾病上是十分有效的，对于该疾病而言迄今只有骨髓移植是唯一已知的治愈方法。然而，尽管骨髓移植取得了成功，但这种疗法会产生严重的并发症，如肿瘤，(Socie et al.，Malignant tumorsoccurring after treatment of aplastic anemia，N.Eng.J.Med.1993；329(16)：1152-1157)和移植物抗宿主疾病(Ferrara et al.，Graft-versus-host disease，N.Engl.J.Med.1991(324)；324：667-674)。另外，因为整个过程的费用和/或找不到相匹配的供体，许多病人不能获得骨髓移植。为此，需要有一种简单有效而且低副作用的疗法来治疗再生障碍性贫血。本发明研究的结果表明再生障碍性贫血可以被有效地治疗并且副作用最少。相信本发明这种基于细胞的免疫疗法也同样适用于其它类型的贫血和骨髓病症。这些病症包括HIV(人类免疫缺陷病毒)感染病人接受鸡尾酒化疗后所经历的病症、以及癌症病人在放疗和化疗后的骨髓衰竭、遗传的再生障碍性贫血、以及特发性血小板减少性紫癜。

虽然不希望本发明的实施被某一特定理论基础所束缚，目前认为几种现象可能导致病人对本发明的免疫疗法的良好反应。第一种理论是，激活的细胞同时分泌多种(也许部分还不为人们所知)有效的因子。当这些多种因子一齐作用时，可以具有协同的联合效果。为本发明疗法的有效性所假设的第二种因素是，激活的免疫细胞产生一些目前未知的、对血细胞生成关键的因子，这些未知的因子可导致，至少部分导致，本发明疗法的有效性。可能有关的第三种因素是：免疫细胞能够迁移到骨髓，并且近距离地向造血干细胞和其它前体细胞递送细胞因子。此外，本发明的激活的免疫细胞能够在足够长的时间内与骨髓保持近距离以在骨髓中产生微环境的改善。导致本发明疗法有效性的第四种因素为：免疫细胞和造血细胞间的细胞接触对造血细胞生长和分化可能是必需的。第五种因素可以是：激活的免疫细胞，即使是少量，也可以在防止免疫系统对造血作用产生不良影响上发挥作用。10-100毫升血中PCMB的数量是相对少的。但这些少量的细胞对骨髓组织学和血细胞生成产生很大的影响。

考虑到先前研究的结果，施用被本发明的方案激活的血细胞的结果是事前没有料到的。除了一项研究以外，Young等报导施用的生长因子(粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)仅影响中性粒细胞数量(The treatment of severe acquired aplastic anemia，Blood.1995；85(12)：3367-3377)。那一项例外的研究显示当施用粒细胞集落刺激因子时，中性粒细胞和血小板计数显著增加。白细胞介素-3单独施用或者与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合施用对成髓作用的影响比单独施用生长因子还不理想。类似的研究(Liu等，Cellular interactions inhemopoiesis，Blood Cells 1987；13：101-110和Ettinghausen等，Hematologic effects if immunotherapy with lymphokine-activated killer cellsand recombinant interleukin-2 in cancer patients，Blood 1987；69(6)：1654-1660)发现，向病人施用激活的外周血单核细胞和白细胞介素-2，会“加重”接受这一疗法的病人的贫血和嗜曙红细胞增多。

本发明也意图包括制品，其包括如上面所更详细描述的一个或多个细胞因子和离子载体的独立包装的容器。容器内容物可以用来培养、和因而激活血细胞以用于本发明的治疗性方案。制品中可以有说明书，例如在标签上。也可以进一步包括适于培养血细胞的培养基。

实施例2-血小板缺乏的治疗

本实施例描述了对一个1岁零5个月大的患有原发性血小板减少性紫癜的女性病人的治疗。此病人在大约9个月时被诊断患此病。

此病人开始是用常规的皮质甾类和静脉内输注免疫球蛋白来治疗。虽然病人对常规治疗有反应，但病人完全依赖于皮质甾类疗法。为了维持足够的血小板水平，患者不得不接受不断增高剂量的皮质甾类。

然后，如上述所说用基于激活的细胞的疗法对病人进行治疗。治疗与实施例1所述相同，不同的是每次从病人的取血量为20毫升，而不是40-50毫升。病人每星期治疗一次，持续9个星期。先体外后体内激活的细胞在第1天，第8天，第15天，第22天，第29天，第35天，第42天，第49天，第56天施用。开始用激活细胞进行免疫疗法的同时，完全停止使用皮质甾类和常规疗法的任何其它方面。治疗期间病人的血小板水平逐渐地改善，如图2所示。病人在第49天有肺部感染，这与血小板数量的显著减少有关。病人从感染中恢复后，病人的血小板数量又回到了正常水平。

实施例3-血小板减少症的治疗

I. 病人

患有进展期血液和转移实体癌的成年病人被选入到当前的研究中(表2)。在开始研究之前，病人接受密集的化疗，结合或不结合放疗，病人产生严重骨髓抑制，定义为绝对中性粒细胞计数≤500/毫升，血红蛋白浓度≤6.5mg/毫升，以及血小板计数≤20,000/毫升。此项研究的病人接受最少至少2个星期的G-CSF、促红细胞生成素和白介素-11的联合治疗。此外，一些病人始终未从严重血小板减少症中恢复过来，严重血小板减少症定义为血小板计数≤20,000/毫升。病人依赖于预防性血小板输注，患实体癌的病人具有骨转移伴有剧烈疼痛，需要放疗以缓解疼痛。

表2：病人特征

                             

病人数目              12

年龄

中值(范围)            55(20-74)

性别

男性                  6

女性                  6

ECOG分数              1(0-2)

诊断

非小细胞肺癌          4

非何杰金氏淋巴瘤      3

结肠癌                3

急性淋巴细胞白血病    2

先前的治疗

腰椎脊柱或骨盆放疗    6

                                         

化疗方案的数目

中值(范围)            3(1-5)

化疗持续的时间(周)    24(2-52)

中性粒细胞减少症      6

                                 

病人需要满足以下标准才能具有接受试验研究的资格：美国东部肿瘤合作组织(ECOG)表现状态分数≤2；临床上没有重大的心脏病和新陈代谢疾病。足够的肝肾功能(总胆红素水平是52.0毫克/分升，血尿素氮(BUN)530毫克/分升，血清肌酸酐水平52.0毫克/分升)；正常左心室射血分数(放射性核素射血分数[RNEF]≥50％)。

预期或正在接受皮质甾类或抗凝血剂治疗的病人被排除在外。病人如在研究开始前4星期内接受了任何细胞因子或研究性试剂，也不符合入选条件。所有病人都签署书面的知情同意书。治疗方案经过医院的公共机构审核委员会(Institutional Review Board)批准。

II.外周血单核细胞的纯化和细胞培养

ABO-血型匹配的同种异体白细胞通过白细胞分离法获自健康供者，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(PBMC)。PBMC与RPMI 1640培养液(Life Technologies，Gaithersburg，MD)在无菌条件下培养48小时，培养液中含有10％胎牛血清(FCS)(江滨生物制剂，杭州)，500IU/毫升白细胞介素-2(IL-2)(瑞星生物制药，北京)、200U/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(NCPC，石家庄，中国)、100ng/毫升A23187钙离子载体(Sigma，St.Louis，MO)，细胞培养浓度为3×10⁶/毫升。预先确定IL-2和GM-CSF的浓度，以对单核细胞和T细胞具有最大刺激活性，并选择将FCS加入细胞培养，因为FCS被认为在支持人类免疫细胞的细胞生长和分化上比人血清强。用于这项研究的FCS未曾被热灭活。将贴壁细胞从塑料培养瓶上刮下，并与非贴壁细胞收集在一起。细胞用生理盐水洗涤三次，然后输注。

III.研究设计

在这一标签公开、非随机化的临床研究中，12个合格的病人被选入。病人在第0天，第l天，第2天，每天注射5×10⁷剂量的激活的免疫细胞，接着在第3天到第7天休息。每个星期进行如此3天治疗和4天休息的循环治疗，最多持续4个星期。如果在治疗中的任何时间发现血小板计数增加至超过40,000/毫升，则停止治疗。

血小板计数在每个星期监测至少3次，分别在不相邻的日子里进行监测。血小板计数≤20,000/毫升时则输注血小板。这种预防性血小板输注政策为这项研究中所有研究人员所遵守。如果发现在最近一次的血小板计数超过40,000/毫升，则血小板的计数在3天后重复一次。在整个治疗过程中不允许同时使用生长因子，以使对血小板恢复的干扰可能性最小。在细胞输注开始之前病人常规接受盐酸异丙嗪以降低副作用。

IV  细胞因子分析

细胞开始培养的两天后，没有贴壁的细胞被收集并且用生理盐水洗涤两次。而贴壁的细胞在培养瓶里同样用生理盐水轻轻地洗涤两次。洗涤过的没有贴壁的细胞放回到相同的培养瓶中，更新培养液再连续培养3天，新的培养基不含有细胞因子和钙离子载体。上清液收集好后，集中在一起用LuminexxMAP系统(Luminex，Austin，TX)进行细胞因子分析。

V.结果

A.细胞产率

在两天的培养中，有些细胞存活，并在GM-CSF、IL-2和钙离子载体刺激下增殖，而没有反应的细胞死亡。细胞培养前后的细胞数量变化不大。

B.血小板的恢复

10个患有严重和长期血小板减少症的病人对治疗有反应，他们的血小板计数增加至≥40,000/毫升的水平(表3)。另外两个病人无反应。参见图3，其显示在用先体外后体内激活的免疫细胞治疗的血小板计数(从第0天开始连续3天施用，治疗周期每周重复一次，最长4周)，每条线显示一个病人的血小板计数动力学。虚线代表血小板计数40,000/毫升。在10个血小板有改善的病人中，2个病人接受了三次治疗，3个病人接受了6次治疗，3个病人接受了9次治疗，另外2个病人接受了12次治疗；12个病人中有2个在12次治疗后没有到达治疗的终点。

C.白细胞的恢复

6个病人的白细胞计数也较低。尽管用G-CSF进行了密集治疗，这些病人的白细胞计数仍然低于正常水平。经过用激活的免疫细胞治疗，所有6个病人的白细胞计数得到改善，并恢复到正常水平(图4)。参见图4，其显示在用先体外后体内激活的免疫细胞治疗后的白细胞计数(从第0天开始连续3天施用，治疗周期每周重复一次，最长4周)，发现白细胞的恢复早于血小板的恢复，对于重度骨髓抑制病人一般要早一周到数周。如上述2名血小板无改善的病人，其白细胞计数得到了改善。研究发现血小板计数的恢复比白细胞计数的恢复通常需要更多次的治疗和更长时间。

D.细胞因子的产生

选择一组细胞因子以确定这些治疗性细胞是否产生多种细胞因子。如表3所示，在检测的19种细胞因子中，其中7种(IL-1b，IL-2，IL-6，IL-8，G-CS F，GM-CSF，MIP-1b)以非常高水平分泌，9种(IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IL-17，IL-18，IFN-γ，and MCP-1)以中等水平分泌，而另外3种(IL-7，IL-12 and Eotaxin)以非常低的水平分泌。

表3

细胞因子	浓度(pg/mL)
			培养基对照	上清
	IL-1bIL-2IL-4IL-5IL-6IL-7IL-8IL-10IL-12(p40)IL-13IL-17IL-18IFN-γTNF-aG-CSFGM-CSFMCP-1MIP-1bEotaxin	0000.140003.5400.130000019.7000			2777.1424342.96164.87141.513348812.47太高415.25.71167.5550.748.97634.69461.04178906198833.5215.543202.827.75

E.临床耐受

所有病人对先体外后体内激活的免疫细胞疗法有很好的耐受。没发现皮肤过敏、液体潴留、血栓栓塞事件、或器官毒性。最常见的副反应为寒战及发烧37-39℃、头痛、恶心、呕吐、和食欲下降。这些副反应通常是与输注有关和暂时的，大多数在细胞输注后24小时内消退。出现这些症状的病人相应地用常规疗法治疗。通常给予盐酸异丙嗪以使副反应最小。没有病人因为副反应而退出研究。

F讨论

在此研究中，运用先体外后体内培养的血细胞、特别是免疫细胞的疗法显著提高化疗和放疗诱导的血小板减少症的恢复。其结果是，患骨髓转移的病人有足够的血小板来接受缓解疼痛所急需的放疗。许多具有血小板生成作用的细胞因子的研制由于其活性有限、或显著毒性、或中和抗体而受限。白介素-11是美国食品与药品管理局迄今批准的唯一用于血小板减少症的细胞因子。在这个研究中，病人经过仔细选择，已经用过白介素-11、但对其无反应性的病人才被选入这个临床研究。

发现先体外后体内免疫疗法不但对严重的血小板减少症、而且也对中性粒细胞减少症有效。白细胞计数低下的6名病人对所述治疗反应良好，尽管G-CSF疗法无法使他们的白细胞计数提高至正常水平。这一结果与动物实验中观察到的相一致(Huaiyu Chen，Lubo Wu，Jiayu Chen，Xiaohui Wang，Jing Li，Bo Xie，and Demao Yang.Ex vivo activated immunecells promote survival and stimulate multilineage hematopoietic recovery inmyelosuppressed mice.已投稿)。所述疗法刺激多谱系血液产生的能力为患有重度和慢性骨髓抑制的病人带来显著的好处。

G-CSF被证明对治疗轻度到中度中性粒细胞减少症高度有效，但是对重度和慢性血液缺乏疗效有限。重度损伤骨髓也许需要多种生长因子(也许部分还未知)共同作用才能够恢复。尽管不希望被特定的运作理论所束缚，有可能有些目前还未知的关键因子导致了，至少部分导致了本疗法的有效性。本发明研究中所用的先体外后体内激活的免疫细胞分泌多种细胞因子和生长因子(表3)。一些分泌的细胞因子，例如GM-CSF，G-CSF，IL-1(Hestdal K，Jacobsen SE，Ruscetti FW，Dubois CM，Longo DL，Chizzonite R，Oppenheim JJ，Keller JR.In vivo effect of interleukin-1 alphaon hematopoiesis：role of colony-stimulating factor receptor modulation.Blood.15；80(10)：2486-94，1992.)，IL-6(Rodriguez Mdel C，Bernad A，AracilM.Interleukin-6 deficiency affects bone marrow stromal precursors，resulting in defective hematopoietic support.Blood.1；103(9)：3349-54.2004.)和IL-8(Fibbe WE，Pruijt JF，Velders GA，Opdenakker G，van Kooyk Y，Figdor CG，Willemze R.Biology of IL-8-induced stem cell mobilization.AnnN Y Acad Sci.30；872：71-82，1999)已经被显示是造血的。也有可能输注的细胞迁移至骨髓、肝脏和脾脏，以向造血干细胞和其它前体细胞近距离递送生长因子。可能导致本疗法有效性的另一因素为：免疫细胞和造血细胞之间的细胞接触对于造血生长和分化可能是必需的。以前用生长因子治疗苯诱导的再生障碍性贫血的经验显示，它们比本发明的方法更好和更快速地动员现有的已经定向分化的先祖细胞库，但对骨髓血细胞生成缺乏长期作用。在本实施例中描述的特定疗法对慢性疾病更有利地有效，并适于更长期应用(Jiayu Chen；Weiwei Liu；Xiaohuai Wang；HuaiyuChen；Jinming Wu；Yi Yang；Lubo Wu；Demao Yang.Ex VivoImmunotherapy for Patients with Benzene-Induced Aplastic Anemia.JournalofHematotherapy&Stem Cell Research.12：505-5 14，2003)。

在PBMC培养中应用GM-CSF、IL-2和钙离子载体可能完成细胞激活和分化。钙离子载体是强烈和非特异性的细胞激活剂；它的运用被认为增强GM-CSF和IL-2的效果。GM-CSF、IL-2、IL-12和钙离子载体联合使用曾经显示诱导单核细胞变成类似树突细胞表型的细胞(Bedrosian I，JG Roros，S Xu，HQ Nguyen，F Engels，MB Faries，GK Koski，PA Cohen and BJ Czerniecki.Granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，interleukin-2，and interleukin-12 synergize with calcium iono-phore toenhance dendritic cell function.J Immunother 23：311-320，2000)。但是，大多数制备成熟和潜能树突细胞的方案，其最佳培养时间为6到8天。本发明的治疗方法使用培养2天的细胞，推测处于细胞激活和细胞因子产生的高峰；此外，该疗法更实用和易于操作。本发明的疗法刺激多谱系血细胞，特别是血小板的能力比现有的治疗方法特别是生长因子有其优势。

实施例4-骨髓抑制的治疗

I.骨髓抑制的诱导

将10周龄雌性BALB/c小鼠(中山大学动物中心，广东，中国)分组，每组十只。骨髓抑制通过每只小鼠腹膜内注射1.5毫克卡铂(carboplantin)随后立即进行单一剂量250cGy的全身放疗而诱导。诱导骨髓抑制所用卡铂和放疗的剂量是通过在小鼠中试验各种剂量组合而得到的，死亡率为80％～100％。

II.细胞和细胞培养

人白细胞通过白细胞分离法获自健康人类供体，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(PBMC)。PBMC与RPMI1640培养液(Life Technologies，Gaithersburg，MD)在无菌条件下培养48小时，培养液中含有10％胎牛血清(FCS)(江滨生物制剂，杭州，中国)，500IU/毫升白细胞介素-2(IL-2)(瑞星生物制药，北京，中国)、200U/毫升GM-CSF(NCPC，石家庄，中国)、100ng/毫升钙离子载体A23187(Sigma，St.Louis，MO)，细胞培养浓度为3×10⁶/毫升。选择将FCS加入细胞培养，因为FCS被认为在支持人类免疫细胞的细胞生长和分化上比人血清强。用于这项研究的FCS未曾被热灭活，因为其可能含有对培养细胞激活有益的多种生长因子。将贴壁细胞从塑料培养瓶上刮下，并与非贴壁细胞收集在一起。细胞用生理盐水洗涤三次，然后输注入小鼠。

借助贴壁细胞粘附于塑料瓶的能力将非贴壁细胞与贴壁细胞分离。PBMC在不存在生长因子和钙离子载体的条件下孵育3小时，将非贴壁细胞从培养瓶中轻轻移除。然后将贴壁和非贴壁细胞分别在GM-CSF加钙离子载体、和IL-2加钙离子载体的条件下，分开培养2天。

将正常BALB/c小鼠的脾脏均质化，用蒸馏水将红细胞裂解。剩余的细胞用1ng/ml小鼠GM-CSF、2ng/ml IL-2(两者均来源于eBioscience，San Diego，CA)以及钙离子载体A23187培养2天。

III研究分组及治疗

骨髓抑制的小鼠分别用先体外后体内激活的同系(syngeneic)小鼠脾细胞和人类PBMC分别在化疗和放疗前后治疗。为了在骨髓抑制诱导后进行治疗，在第0、2、4和6天四次静脉内注射。以每只小鼠1×10⁴、1×10⁵和1×10⁶的三个剂量进行测试。也测试诱导骨髓抑制后3小时单次注射2×10⁷细胞。

对于预防性治疗，在骨髓抑制诱导前24小时进行2×10⁷激活的细胞/每只小鼠的单次注射。

IV.细胞因子分新

细胞培养开始后两天，收集非贴壁细胞，用生理盐水洗两次，而贴壁细胞也在培养瓶中用生理盐水洗两次。将洗过的非贴壁细胞放回同一培养瓶，加入不含有细胞因子和钙离子载体的新鲜的培养液，继续培养3天。收集上清并汇集以供用LuminexxMAP系统(Luminex，Austin，TX)进行细胞因子分析。

V.外周血分析

为确定化疗和放疗后的恢复，在第8、15和22天从小鼠尾静脉收集外周血。在针对小鼠血校准的Thechnicon H-1E(Technicon InstrumentsCorp，Tarrytown，NY)上进行全血计数。

VI.激活的人血细胞的干细胞动员

表4显示本发明的细胞疗法产生一定水平的干细胞动员。与IL-2、GM-CSF和钙离子载体一起培养的异种人类细胞被给予正常BALB/c雌性小鼠，1×10⁷/每只小鼠，一天一次，连续3天。最后一次注射后两天，眼窝后穿刺取外周血。用水迅速裂解红细胞，加入10xPBS以将盐浓度重新平衡到正常水平。剩下的细胞在冰浴中与抗小鼠CD34 PE(BDBiosciences Pharmingen，San Diego)单克隆抗体孵育20分钟。孵育后细胞用PBS洗3次，然后在FACSCALIBUR^TM(Becton Dickinson[BD]；SanJose，CA)上分析。使用前向侧向散射(forward side scatter)和侧向散射作为射门参数样品引入流式细胞计，并使用碎屑扣除(debrissubtraction)技术，以确定细胞特性。共计数30,000个事件，来确定单核细胞级分。使用CELLQUEST软件(BD)进行分析。来自未处理正常小鼠的细胞作为对照。如表4所示，表达CD34的细胞群体从正常小鼠中的0.34％(标准差)增加至用激活细胞处理小鼠中的1.63％，表明先体外后体内激活的异种人类免疫细胞从骨髓刺激和动员干细胞至外周血循环的能力。

表4.细胞疗法增加外周血干细胞的数量.

	正常小鼠	在第5天的治疗小鼠
			％CD34阳性细胞	0.3 5±0.22	1.55±0.45

VII.使用在没有离子载体的条件下培养的先体外后体内血细胞对 骨髓抑制小鼠的挽救

用GM-CSF和抗人CD3抗体培养和激活PBMC，所述PBMC被成功用于救活骨髓抑制的小鼠，如图7所示。如本文所述收集和培养细胞，唯一不同点是他们用GM-CSF与小鼠抗人CD3单克隆抗体以1微克/毫升培养两天。骨髓抑制的诱导与前述相同。小鼠被静脉内注射3次，分别为化疗和放疗诱导后即刻、48小时和96小时，剂量为1×10⁶细胞/只小鼠。如图7所示，该培养过程有效激活血细胞以治疗骨髓抑制。此外，异种人类细胞被成功用于小鼠。

使用各种组合的细胞因子和细胞激活剂的各种培养条件对血细胞生成具有类似作用。被用来激活混合群体的外周血单核细胞的IL-2、GM-CSF和钙离子载体的组合是有效的，但使用不同细胞激活剂的其它培养条件也有效。因此，用来实施本文所述的实施方案的培养条件并不局限于使用钙离子、GM-CSF、和IL-2中的一种或组合。

VIII.结果

A.短期和长期的成活率

参见图5，其显示先体外后体内激活的同系小鼠脾细胞促进存活，骨髓抑制的小鼠用先体外后体内激活的小鼠脾细胞处理4次，分别为在骨髓抑制诱导后即刻、第2天、第4天和第6天。骨髓抑制的小鼠在化疗和放疗后第0、2、4和6天以3个剂量四次接受静脉内注射激活的小鼠脾细胞和人PBMC。对照小鼠接受新鲜的没有进行先体外后体内激活的小鼠脾细胞。如图5所示，未处理的对照小鼠和接受新鲜小鼠脾细胞的小鼠存活率低，为0-30％。相反，激活的小鼠脾细胞将骨髓抑制小鼠的存活率显著增高至80-100％。存活率在治疗组之间没有显著差异。注意到以1×10⁷/只小鼠接受四次新鲜小鼠脾细胞注射的小鼠与其他对照组相比具有稍高的存活率。用异种人类细胞进行四次治疗对骨髓抑制小鼠具有类似作用(数据未显示)。

参见图6，其显示单次注射先体外后体内激活的同系脾细胞和异种人类免疫细胞增进存活，骨髓抑制的小鼠在骨髓抑制诱导后立即接受单次注射2×10⁷先体外后体内激活的细胞。用先体外后体内的细胞进行四次处理挽救了很大一部分骨髓抑制小鼠，进行试验以考察单次治疗是否能改善存活率。结果显示化疗和放疗后每只小鼠立即单次注射2×10⁷激活的细胞也提高骨髓抑制小鼠的存活率和血液学恢复(图6)，虽然存活率的增高不如四次治疗那么高。

跟踪用激活的免疫细胞挽救的骨髓抑制小鼠最长6个月，以观察长期存活。发现所以被挽救的小鼠在治疗后都存活长达6个月。尽管在诱导骨髓抑制后施用本疗法对存活具有强烈效果，化疗和放疗前对小鼠预防性治疗无法挽救小鼠(数据未显示)。

参见图6，骨髓抑制小鼠在骨髓抑制诱导后立即接受单次注射2×10⁷先体外后体内激活的细胞。为了进一步研究不同亚群的激活免疫细胞在挽救骨髓抑制小鼠中发挥的作用，人类贴壁和非贴壁免疫细胞被分别培养，和注射入骨髓抑制小鼠。如图8所示，两种群体都能提高骨髓抑制小鼠的存活，虽然贴壁细胞比非贴壁细胞更有效。

B.血细胞计数的恢复

在治疗前后进行总血细胞计数。参见图9，骨髓抑制的小鼠诱导骨髓抑制后立即、第2、4、6天接受1×10⁷先体外后体内激活的人类细胞的注射。化疗和放疗后的血细胞计数定为100％。图9显示接受1×10⁷细胞四次后的小鼠恢复曲线。在第3周接受治疗小鼠的血细胞计数开始改善，在第5周完全恢复。注意到血小板计数先于白细胞和红细胞一周得到显著改善。通常，发现由治疗导致的血细胞计数的恢复速度与治疗剂量和次数很相关(数据未显示)，且一旦血细胞计数开始改善，2-3周内开始完全恢复。

C.讨论

此实施例的结果显示先体外后体内激活的免疫细胞对治疗化疗和放疗引起的骨髓抑制有效。虽然目前市场上的药物如G-CSF，GM-CSF，促红细胞生成素和IL-11对轻至中度的骨髓抑制有效，但它们对重度和慢性的骨髓抑制，特别是，癌症病人中大剂量化疗引起的血小板减少症缺乏疗效。比较生长因子，使用激活的免疫细胞在治疗骨髓抑制上有其优势。第一，激活的细胞显然产生多种生长因子用于血细胞生成，并且这些生长因子共同作用，可能具有协同组合效果。也有可能有些迄今未知的关键因子导致，至少部分导致，本发明疗法的有效性。不想被特定理论所束缚，先体外后体内激活的免疫细胞以及由细胞输注所导致的随后的体内免疫应答可能导致生长因子的产生。第二，输注的细胞可能迁移到骨髓，肝脏，脾脏，以近距离释放生长因子至造血干细胞和其它前体细胞。进一步，它们能够与骨髓保持近距离足够长时间以改善微环境。第三，输注的细胞与造血细胞之间的细胞接触对于造血细胞生长和分化也可能是必需的。

先体外后体内激活的免疫细胞产生的细胞因子和趋化因子显示某些令人感兴趣的特性，其中分别代表T辅助细胞Th1/Th2亚组的四种主要细胞因子-IFN-γ，IL-12，IL-4和IL-10，与已知具有强大造血活性的IL-1 β，IL-6，IL-8，G-CSF和GM-CSF相比，具有相对低水平。异种人细胞与同系小鼠细胞一样有效，提示本疗法的机理不是MHC依赖或介导的。

在细胞培养中使用IL-2可能帮助T细胞存活和被激活，不想被特定理论所束缚，IL-2激活的T细胞在体内比其他试剂如抗CD3单克隆抗体或PHA或ConA激活的T细胞具有更长的生存能力和细胞因子产生。出于同一原因，GM-CSF被用于刺激骨髓细胞。为了保证T和骨髓细胞的完全激活，钙离子载体被用来与IL-2和GM-CSF共刺激。

GM-CSF和钙离子载体被显示能够共同诱导单核细胞分化成类似树突细胞表型的细胞。但是，大部分的文献中制备成熟和有效的树突细胞最适宜培养时间是6至8天。本发明的疗法使用培养2天的细胞，预计是细胞因子生产的细胞激活的高峰。此外，这些疗法更实用和易于操作。

此外，不需要进行额外的步骤以制备干细胞的纯化制品或高度富集的单核细胞制品。此外，这种操作针对于以某一浓度和持续时间将细胞暴露于培养因子，以刺激细胞获得用于免疫目的的表型，例如表达某种细胞表面抗原。这种方法不适用于本疗法，本疗法不针对获得这种表型或测量或获得这种标记物的表达。此外，培养的细胞类型和培养时间的差异不必然导致由本发明描述的血细胞激活方法带来的激活状态。此外，本疗法包括骨髓抑制和/或血细胞生成作用的治疗，其为未被这些其它方案所指示的治疗。

*    *    *    *    *

所有本文引用的文献，专利，专利申请和其它文件都包括在参考文献中。如果出现争议，应以本文中的叙述为准。

由于本发明可以被多种形式修改但并不违背本发明的中心内容，本发明的范围并不受限于叙述的实施方案。因此，本发明的范围应为权利要求及其等同物所决定。

表1.基于细胞的免疫疗法前后的病人血液学谱

病人	年龄/性别	治疗次数	类型	WBC(×103/mL)	RBC(×106/mL)	HGB(g/dl)	PLT(×103/mm3)	WBC(×103/mL)	RBC(×106/mL)	HGB(g/dl)	PLT(×103/mm3)
												HCYMTBLCYXJX	32/女29/女33/女25/男25/女29/女	644445	急性慢性急性急性慢性急性	2.7+/-0.23.6+/-0.33.2+/-0.21.4+/-0.22.5+/-0.32.7+/-0.7	1.2+/-0.13.8+/-0.52.3+/-0.31.6+/-0.32.7+/-0.23.0+/-0.2	4.0+/-0.311.1+/-0.48.4+/-0.45.7+/-0.38.2+/+0.48.1+/-3.4	28+/-399+/-117+/-516+/-722+/-344+/-18	3.8+/-0.256.7+/-0.34.7+/-0.35.7+/-0.23.5+/-0.34.5+/-0.7	2.0+/-0.23.9+/-0.43.2+/-0.34.8+/-0.32.8+/-0.23.6+/-0.1	7.0+/-0.312.7+/-0.511.5+/-0.713.5+/-0.79.8+/-0.512.0+/-0.4	43+/-3182+/-17107+/-11135+/-14100+/-10126+/-8

ZLSC

41/女29/女

44

慢性慢性

3.1+/-0.62.4+/-0.3

4.0+/-0.62.6+/-0.1

12.6+/-1.910.0+/-3.5

154+/-3554+/-4

3.7+/-0.12.8+/-0.2

4.3+/-0.022.9+/-0.2

13.2+/-1.311.0+/-0.3

187+/-2171+/-8

治疗前后连续5天测量和分析血液学参数。数据显示为平均值+/-标准差。WBC白细胞；RBC红细胞；HGB血红蛋白；PLT：血小板

Claims (37)

1.治疗重度骨髓抑制病人的方法，包含向病人施用先体外后体内培养的血细胞，以增加血液成分的浓度。

2.权利要求1的方法，其中所述病人是人。

3.权利要求1的方法，其中所述骨髓抑制与癌症病症有关。

4.权利要求1的方法，其中血液缺陷包含中性粒细胞减少症、白细胞减少症、血小板减少症，或它们的组合。

5.权利要求1的方法，其中血液缺陷包含重度或慢性血小板减少症。

6.权利要求1的方法，其中所述骨髓抑制是由放疗或化疗诱导的。

7.权利要求1的方法，其中向病人施用治疗有效量的血细胞。

8.权利要求1的方法，其中血细胞在细胞因子和离子载体存在下培养。

9.权利要求1的方法，其中血细胞在细胞因子和离子载体存在下培养，所述离子载体包含A23187。

10.权利要求1的方法，其中血细胞在细胞因子存在下培养，所述细胞因子包含白介素-2。

11.权利要求1的方法，其中血细胞在细胞因子存在下培养，所述细胞因子包含巨噬细胞集落刺激因子。

12.权利要求1的方法，其中所述培养进行少于约2天。

13.权利要求1的方法，其中所述血细胞对病人而言是自体或同种异体的。

14.权利要求1的方法，其中所述血细胞通过离心与血清分离。

15.权利要求1的方法，其中所述血细胞是外周血单核细胞。

16.权利要求1的方法，其中所述血细胞在哺乳动物血清存在下培养。

17.权利要求1的方法，其中所述血细胞来自免疫可接受的供体。

18.权利要求1的方法，其中所述施用通过静脉内注射进行。

19.权利要求1的方法，其中所述先体外后体内培养的血细胞的施用包含施用多个剂量。

20.权利要求1的方法，其中培养纯化的外周血单核细胞，以形成先体外后体内培养的血细胞。

21.权利要求1的方法，其中所述血细胞在白介素、细胞刺激因子和离子载体存在下培养。

22.权利要求1的方法，其中所述血细胞包含至少3种类型的细胞。

23.权利要求1的方法，其中所述纯化的外周血单核细胞从通过白细胞分离法获得的细胞收集物纯化，并加以培养以形成先体外后体内培养的血细胞。

24.权利要求1的方法，其中所述纯化的外周血单核细胞在培养过程中分为贴壁和非贴壁的细胞，并且无论是贴壁还是非贴壁细胞都被用于形成先体外后体内培养的血细胞。

25.权利要求1的方法，其中所述先体外后体内培养的血细胞引起多谱系血细胞生成。

26.治疗患有中性粒细胞减少症病症的病人的方法，所述方法包含向所述病人施用先体外后体内培养的血细胞，以增加血液成分的浓度。

27.权利要求26的方法，其中所述病人已被暴露于放疗或化疗形式的癌症治疗。

28.权利要求26的方法，其中向病人施用治疗有效量的血细胞。

29.权利要求26的方法，其中在细胞因子和离子载体存在下培养血细胞。

30.权利要求26的方法，其中血细胞在细胞因子存在下培养，所述细胞因子包含巨噬细胞集落刺激因子。

31.权利要求26的方法，其中所述血细胞对病人而言是自体或同种异体的。

32.权利要求26的方法，其中所述血细胞是外周血单核细胞。

33.权利要求26的方法，其中所述血细胞在白介素、细胞刺激因子和离子载体存在下培养。

34.权利要求26的方法，其中所述血细胞包含至少3种类型的细胞。

35.权利要求26的方法，其中所述纯化的外周血单核细胞从通过白细胞分离法获得的细胞收集物纯化，并加以培养以形成先体外后体内培养的血细胞。

36.权利要求26的方法，其中所述纯化的外周血单核细胞在培养过程中分为贴壁和非贴壁的细胞，并且无论是贴壁还是非贴壁细胞都被用于形成先体外后体内培养的血细胞。

37.权利要求26的方法，其中所述先体外后体内培养的血细胞引起多谱系血细胞生成。

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