JPH0728732B2 - 動物細胞増殖促進剤及び無血清培地 - Google Patents

動物細胞増殖促進剤及び無血清培地

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JPH0728732B2
JPH0728732B2 JP3042868A JP4286891A JPH0728732B2 JP H0728732 B2 JPH0728732 B2 JP H0728732B2 JP 3042868 A JP3042868 A JP 3042868A JP 4286891 A JP4286891 A JP 4286891A JP H0728732 B2 JPH0728732 B2 JP H0728732B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞増殖促進剤及
びこれを含有せしめた無血清培地に関する。本発明の動
物細胞増殖促進剤及び無血清培地は、リンパ球、ハイブ
リドーマ等の無血清培地で増殖しにくい動物細胞の増殖
に有用であって生理活性物質の産生培地、生体細胞移植
用培地等として利用される。
【０００２】
【従来技術】従来、動物細胞の培養液には、アミノ酸、
ビタミン、糖、無機塩類のほかに通常５〜２０％の血清
が加えられている。そして、血清を除くと細胞は増殖を
停止して死滅する。しかし、血清は、高価で培地のコス
トの７５〜９５％を占め、またロット差が著しく安定し
た増殖が得られないこと、高圧蒸気滅菌できないのでマ
イコプラズマ・ウイルスで汚染される機会があること、
５００種以上のタンパク質を含んでいるので細胞によっ
て産生された生理活性物質の単離精製を困難にしている
こと等の欠点があった。そこで、このような欠点を除く
ために無血清培地の使用が行われている。このような無
血清培地の具体的な例としてイーグルのＭＥＭ（Minimu
m Essential Medium) 培地を基本培地とし、これにアル
ブミン、インシュリン、トランスフェリン等の成分を添
加した無血清培地、修飾イーグルＭＥＭ培地を基本培地
とし、これに牛血清を硫安分画して得られる細胞増殖因
子を添加した無血清培地等数多くの無血清培地が知られ
ている。しかし、これらは無血清培地として動物細胞の
培養に汎用的に用いられてはいるものの細胞増殖促進効
果が血清培地よりも低かったり、分画したものであるに
せよ実際には血清成分を使用していたり、あるいは価格
が高く、経済性が劣る等の問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
問題を解決することを目的としてなされたものである。
すなわち、本発明は、血清成分を全く使用することなく
あるいはその使用を極力抑えて血清培地と同様あるいは
それ以上に動物細胞の増殖を促進し、しかも経済的に有
利に用いられる動物細胞増殖促進剤及びこれを含有せし
めた無血清培地を提供することを目的とする。そして、
本発明は、このような無血清培地を用いることによって
動物細胞の増殖を促進し、細胞生産物の収率を高め、こ
れの単離精製を容易に行えるようにしようとするもので
ある。さらに、本発明は動物細胞の増殖を促進すること
ができる性質を利用して癌患者体中から採取したリンパ
球を体外で増殖させて癌細胞への攻撃性を高め、これを
再び患者の体内に戻して癌細胞を殺滅する、いわゆる癌
の養子免疫療法（adoptive immunotherapy）における体
外でのリンパ球の増殖培地を提供しようとするものであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために種々の成分の動物細胞増殖能に
ついて検討したところ、ヒトリゾチームやその他のリゾ
チームの動物細胞増殖能がいちじるしく高いことを見出
し、本発明を完成するに至ったものである。すなわち、
本発明は、リゾチームを有効成分とする動物細胞増殖促
進剤、及びリゾチームを含有せしめてなる無血清培地に
関する。
【０００５】リゾチームは、卵白、魚類粘膜および動植
物組織等に存在する、酵素活性を有する蛋白質であっ
て、種々の細菌を溶解する作用を有しているため、食品
の防腐剤、あるいは抗菌剤、血液凝固剤、抗炎症剤等の
医薬として利用できることがすでに知られている。なか
でもニワトリ卵白中には特に多量のリゾチームが含まれ
ており、比較的容易に純度の高いものが単離できる。し
たがって現在食品等の防腐剤としてあるいは消炎酵素剤
および風邪薬への配合など医薬品として使されているリ
ゾチームはニワトリ卵白由来のものがよく使用される。
本発明では、リゾチームとしてニワトリ卵白由来のリゾ
チームばかりではなく、ヒトリゾチーム、牛リゾチー
ム、パパイヤリゾチーム、Ｔ４リゾチーム等、種々の起
源のリゾチームが用いられる。特に、異種蛋白質による
免疫応答を考慮して最近ヒトリゾチームの利用が注目さ
れるようになってきている。本発明においてもヒトリゾ
チームを用いることが好ましい。ヒトリゾチームはヒト
の胎盤、白血球、尿、母乳、涙等の各種組織および分泌
物中に見出され、現在純度９９％程度に抽出され、研究
用に用いられている。また、組換えＤＮＡ技術の手法の
利用によるヒトリゾチームの大量生産法（工業的生産方
法）の開発に関する検討も進められており、工業技術院
ではすでに合成ヒトリゾチーム遺伝子の酵母による発現
と生産ヒトリゾチームの菌体外分泌に成功している（特
開昭６２−２４８４８８号公報）。さらに本発明者と工
業技術院は共同で生産条件の改良を行い、ヒトリゾチー
ムの分泌生産量を飛躍的に向上させることに成功してい
る（特開平２−２３４６７３号公報）。
【０００６】本発明は、このようなヒトリゾチームが、
リンパ球、ハイブリドーマ、線維芽細胞等の動物細胞の
増殖を促進することを見出してなされたものである。そ
してこの作用は、本発明者らが検討したところ、他の組
織由来のリゾチーム、例えば卵白リゾチームでも見出さ
れた。しかし、ヒトリゾチームによる作用がいちじるし
く強く、この点でヒトリゾチームを用いることが特に好
ましい。本発明ではリゾチームを単独で用いてもよい
が、リンパ球を増殖させる場合にはこれをサイトカイン
と併用するとその効果を高めることができる。なかでも
リンホカインと併用するとその効果をいちぢるしく高め
ることができる。サイトカインとしては、モノカイン、
リンホカイン等がある。モノカインの例としてはマクロ
ファージ活性化因子、単球活性化因子等を挙げることが
できる。また、リンホカインとしては、インターロイキ
ン２、インターロイキン３、インターロイキン４、イン
ターロイキン６、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化促進因
子、γ−インターフェロン等を例示することができる。
これらのうちインターロイキン２が特に好ましい。さら
に、サイトカインは動物細胞培地に予め添加しておいて
もよいし、またリゾチームと同時に添加してもよい。
【０００７】本発明における動物細胞増殖促進剤は、リ
ゾチームを単独に含有していてもよく、あるいはサイト
カインと併用して含有させてもよい。さらにこれに他の
成長促進因子、例えばアルブミン、インシュリンあるい
はトランスフェリン等を配合してもよく、またこれらの
成長促進因子を培地組成物の一部または全部を混合した
ものであってもよい。剤型は、粉末、顆粒、液体等各種
のものが用いられる。
【０００８】また、本発明における無血清培地は、リゾ
チームあるいはこれにサイトカインあるいはさらに上記
した成分を配合した動物細胞増殖促進剤を無血清基礎培
地に含有させたものであって、無血清基礎培地としては
従来知られているいずれの無血清基礎培地をも用いるこ
とができるし、またその組成を変更しても該培地で動物
細胞の増殖が可能な限り、使用することができる。この
ような培地としては、ＡＳＦ１０４（味の素株式会
社）、エスクロンＳＦ−０２（三光純薬）等を例示する
ことができる。しかし、特に、このような無血清基礎培
地として好適なものに、本発明者らの開発したＮＯＣ−
９０９、ＮＯＣ−４０４、ＮＯＣ−９０５等の基礎培地
がある。ＮＯＣ−９０９の培地主要組成を表１及び表２
に、ＮＯＣ−９０５の培地主要組成を表３及び表４に、
またＮＯＣ−４０４のそれを表５及び表６にそれぞれ示
す。本発明で使用する培地は、液体培地であっても固体
培地であってもよい。
【０００９】
【表１】 （ＮＯＣ−９０９培地主要組成） ──────────────────────────────────── 基礎培地 (mg/l) ＲＰＭＩ １６４０ イーグルＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル 上記基礎３種混合粉末培地 9,830 アミノ酸 Ｌ−アラニン 20 Ｌ−グルタミン 300 Ｌ−アルギニンＨＣｌ 15 Ｌ−アスパラギン（Ｈ2 Ｏ） 15 グリシン 5 Ｌ−プロリン 5 Ｌ−セリン 15 Ｌ−スレオニン 15 Ｌ−バリン 15 ビタミン アスコルビン酸−Ｎａ 5 ビタミンＢ12 0.00125 ビオチン 0.0025 ────────────────────────────────────
【表２】 （ＮＯＣ−９０９培地主要組成） ──────────────────────────────────── 他の有機化合物 ピルビン酸−Ｎａ 110 ｄ−グルコース 100 塩化コリン 25 プトレッシン２ＨＣｌ 0.0125 ヒポキサンチン 0.025 チミジン 0.0125 ホルモン ヒューマンアポトランスフェリン 10 ヒトインスリン 10 ヒト血清アルブミン 2,000 金属 硫酸第１鉄（７Ｈ2 Ｏ） 1 セレナイト−Ｎａ 0.0017 緩衝剤 グリシルグリシン 1,500 炭酸水素ナトリウム 1,400 ────────────────────────────────────
【００１０】
【表３】 （ＮＯＣ−９０５培地主要組成） ──────────────────────────────────── 基礎培地 (mg/l) ＲＰＭＩ １６４０ イーグルＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル 上記基礎３種混合粉末培地 9,830 アミノ酸 Ｌ−アラニン 20 Ｌ−グルタミン 300 Ｌ−アルギニンＨＣｌ 15 Ｌ−アスパラギン（Ｈ2 Ｏ） 15 グリシン 5 Ｌ−プロリン 5 Ｌ−セリン 15 Ｌ−スレオニン 15 Ｌ−バリン 15 ビタミン アスコルビン酸−Ｎａ 5 ビタミンＢ12 0.000125 ビオチン 0.0025 ────────────────────────────────────
【表４】 （ＮＯＣ−９０５培地主要組成） ──────────────────────────────────── 他の有機化合物 ピルビン酸−Ｎａ 110 ｄ−グルコース 100 塩化コリン 25 プトレッシン２ＨＣｌ 0.0125 ヒポキサンチン 0.0025 チミジン 0.00125 ホルモン ヒューマンアポトランスフェリン 10 ヒトインスリン 10 金属 硫酸第１鉄（７Ｈ2 Ｏ） 1 セレナイト−Ｎａ 0.0017 緩衝剤 グリシルグリシン 1,500 炭酸水素ナトリウム 1,400 ────────────────────────────────────
【００１１】
【表５】 （ＮＯＣ−４０４培地主要組成） ──────────────────────────────────── 基礎培地 (mg/l) イーグルＭＥＭ 4,560 ★ ＲＰＭＩ １６４０ 5,040 ★ アミノ酸 Ｌ−アルギニンＨＣｌ 15 Ｌ−アスパラギン（Ｈ2 Ｏ） 15 Ｌ−グルタミン 300 グリシン 5 Ｌ−プロリン 5 Ｌ−セリン 30 Ｌ−スレオニン 15 Ｌ−バリン 15 ビタミン シアノコバラミン 0.01 ビオチン 0.01 パントテン酸−1/2 Ｃａ 10 塩化コリン 25 ────────────────────────────────────
【表６】 （ＮＯＣ−４０４培地主要組成） ──────────────────────────────────── 他の有機化合物 ｄ−グルコース 500 ｄ−マンノース 100 ピルビン酸−Ｎａ 110 プトレッシン２ＨＣｌ 0.02 ヒポキサンチン 0.1 チミジン 0.025 エタノールアミン 20 ホルモン ヒトインスリン 10 ３，３′５−トリヨード−Ｌ−サイロニン−Ｎａ 0.0065 金属 塩化第２鉄（６Ｈ2 Ｏ） 5 硫酸銅（５Ｈ2 Ｏ） 0.00002 酢酸亜鉛（２Ｈ2 Ｏ） 0.00002 亜セレン酸 0.0014 キレート剤および緩衝剤 ジヒドロキシエチルグリシン 815 グリシルグリシン 1,125 炭酸水素ナトリウム 1,400 ─────────────────────────
───────────★ 通常の1/2 の濃度
【００１２】リゾチームの無血清培地中の含有量は、無
血清培地１リットル当り０．１〜２０００ｍｇ、好まし
くは０．５〜５００ｍｇ程度、さらに好ましくは１０〜
２００ｍｇ程度がよい。ヒトリゾチームでは、特に好ま
しい含量は培地１リットル当り１０〜２００ｍｇ程度で
ある。また、サイトカインの含有量は、無血清培地ｍｌ
当り、１〜２，０００単位、好ましくは１０〜１，００
０単位である。また、リンホカインを使用するときもこ
の程度の量を使用することができる。リンホカインのう
ちインターロイキン−２（ＩＬ−２）が特に好ましく、
その含有量は培地ｍｌ当たり１０〜１，０００単位がよ
い。また、無血清培地には、本発明の目的に反しない限
りウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を併用してもよい。
本発明の無血清培地にはこのようなＢＳＡを従来の血清
培地にくらべて少量含有せしめた培地をも包含する。
【００１３】本発明は、リンパ球、例えばヒト末梢血急
性リンパ性白血病由来細胞、ハイブリドーマ、例えば抗
ＨＢｓ抗体産生ハイブリドーマ、線維芽細胞等の動物細
胞の培養に利用することができる。特に、リンパ球の培
養、すなわち、Ｔ細胞（ヘルパー細胞、サプレッサー細
胞、キラー細胞等）、Ｂ細胞あるいはＮＫ細胞（Natura
l Killer細胞）の培養に用いることができる。
【００１４】
【発明の効果】本発明において動物細胞を無血清培地で
培養するとその増殖を促進することができるので血清成
分の影響を受けることなく、動物産生生理活性物質を収
率よく採取することができる。
【００１５】さらに本発明の特徴とする効果には次のも
のがある。近年、米国を中心に生体細胞移植療法が進展
してきており、我が国でもその研究が活発化してきてい
る。このような生体細胞移植療法には、例えば癌の養子
免疫療法（adoptive immunotherapy）、自己骨髄移植療
法、自己皮膚移植療法、あるいは胎児のランゲルハンス
島前駆細胞の糖尿病患者への移植、胎児の神経細胞のパ
ーキンソン病患者への移植、胎児の肝臓細胞の血友病患
者への移植等を挙げることができる。癌の養子免疫療法
では、癌患者の体内からリンパ球を取り出しリンパ球を
体外で増殖させ、癌細胞への攻撃性を高めた上で再び患
者の体内に戻して癌細胞を殺滅する方法がとられてい
る。また、場合によっては癌細胞を採取し、また血液中
からリンパ球を採取し、両者を培養してキラーＴ細胞を
選択的に増殖させ、このキラーＴ細胞を癌患者に投与し
ている。これらの方法は免疫系細胞を選択することによ
って、制癌剤を用いる方法にくらべて副作用が小さく、
さらに免疫系細胞が体中を循環するので転移性の癌に有
効であるといわれている。この養子免疫療法には次の３
療法がある。
【００１６】（１） ＬＡＫ（Lymphokine activated k
iller)細胞療法 この方法は、末梢血からリンパ球を採取し、ＩＬ−２と
ともに培養して活性化（ＬＡＫ細胞）し、体内に戻す方
法で、培養期間の短かい点（３〜７日）に特長がある
が、腫瘍細胞に対する特異性が低く、担癌組織への集積
が悪く、体内にもどすときＩＬ−２の大量同時投与を必
要とする等の問題点がある。 （２） ＴＩＬ（Tumor infiltrating lymphocytes) 療
法 腫瘍部位には、癌細胞を特異的に攻撃する細胞（キラー
細胞）が高密度で存在するので、腫瘍部位からリンパ球
を採取し、ＩＬ−２とともに培養した後、体内に戻す方
法で、ＬＡＫ細胞にくらべて５０〜１００倍の活性があ
り、特異性及び集積性が高い点で特長を有するが、培養
期間が長い（３０〜６０日）という問題点がある。 （３）ＣＩＬ（Cytotoxic T Lymphocyetes)療法 末梢血からリンパ球を採取し、また一方腫瘍部位から癌
細胞を分離し、両者を混合し、ＩＬ−２とともに培養し
てキラーＴ細胞を誘導した後、体内に戻す方法で、腫瘍
細胞に対する特異性や担癌組織への集積性は高いが、癌
細胞採取時癌細胞が分離しにくいことがあり、またサブ
レッサーＴ細胞を不活性化するため予め癌患者に不活化
剤（抗癌剤）を投与しておく必要がある等の問題点があ
る。
【００１７】したがって、これらの療法を発展させるた
めには、リンパ球を効率よく増殖させる必要がある。こ
のようにこれらの療法では、リンパ球、骨髄細胞、皮膚
線維芽細胞等をいかに効率よく安全に体外の培地上で増
殖させるかが重要なポイントになる。そして、これらの
培地成分として血清を使用すると前述のようにマイコプ
ラズマ・ウィルスの汚染の機会があったり、一定品質の
ものが得られ難く細胞の増殖を一定にすることが大変難
しかったり、あるいは経済コストが高くなる等の欠点が
あった。これらの欠点を防ぐために無血清培地の使用が
望まれており、無血清培地においてはその増殖因子の開
発が最も重要な問題となっていた。本発明では、増殖因
子としてリゾチームが有効であることを見出し、リゾチ
ームを使用することによって血清を使用したときよりも
動物細胞の増殖がいちじるしく促進され、前記欠点を防
止することができ、生体細胞移植療法の進展に大きく資
することができるものである。
【００１８】一方、さらにモノクロナール抗体に関して
は、感染症などの診断、アフィニティクロマトなどによ
る生理活性物質の精製、ターゲット療法などの医療用そ
の他の研究用として、その利用が注目されてきている
が、本発明のリゾチームは、ハイブリドーマの増殖及び
抗体産生能を促進するので、上記各種のモノクロナール
抗体を低価格で生産することができるようになる。そし
て、血清にみられるように血清の摂取法や保存法の相違
によるロットの変動がなく、また抗体の精製が非常に容
易となり、モノクロナール抗体の増産に資することがで
きる。
【００１９】次に、本発明を実施例を示して具体的に説
明する。
【実施例１】表１及び表２に示す組成のＮＯＣ−９０９
培地に、ヒトリゾチームを培地当り、４〜１００ｍｇ／
ｌ添加して無血清培地を得た。この培地でヒト末梢血急
性リンパ性白血病由来Ｔリンパ芽球様株化細胞の一つと
して、ＮＯＣ−９０９培地で馴化したＣＥＭ細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ１１９）を１×１０4 細胞／ｍｌになるよ
うに接種しＣＯ2 を５％濃度で吹き込みながら３７℃で
培養を行った。培養３日目の細胞数を表７に示す。この
表から、ヒトリゾチームの添加量は４〜１００ｍｇ／ｌ
で充分細胞増殖促進効果を示すが、１０〜４０ｍｇ／ｌ
が好適であることが分かる。
【００２０】
【表７】（ヒトリゾチーム添加濃度の影響）
【００２１】
【実施例２】ヒトリゾチームを培地当り４０ｍｇ／ｌ添
加する以外は、実施例１と同様に培地を調製し、これ
に、ＮＯＣ−９０９培地で馴化したＣＥＭ細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ１１９）１×１０4 細胞／ｍｌになるように
接種し、ＣＯ2 を５％濃度で吹込みながら３７℃で６日
間培養した。対照として、ヒトリゾチームを添加せずに
上記と同様の方法で培養を行った。これらの結果を図１
に示す。図１はＣＥＭ細胞についての培養結果を示した
もので、いずれの培養物も培養日数が増加するに従って
細胞は増殖した。そして、明らかにヒトリゾチームを添
加した培地の方が無添加培地にくらべ細胞数が多く、そ
の増殖が促進されることがわかる。
【００２２】
【実施例３】ヒトリゾチームを培地当り４０ｍｇ／ｌ添
加する以外は、実施例１と同様に培地を調製し、これ
に、ＮＯＣ−９０９培地で馴化中のＡＬＬ細胞を１×10
5 細胞／ｍｌになるように接種し、ＣＯ2 を５％濃度で
吹込みながら３７℃で４日間培養した。対照として、ヒ
トリゾチームを添加せずに上記と同様の方法で培養を行
った。ＡＬＬ細胞について第２日目及び第４日目の細胞
数を表８に示した。この表から明らかなようにヒトリゾ
チーム添加培地は、無添加培地にくらべて細胞の増殖が
有意に促進されており、細胞の種類にかかわらず、ヒト
リゾチームは細胞増殖に対して有用であることがわか
る。
【００２３】
【表８】（ＡＬＬ細胞の増殖）
【００２４】
【実施例４】ＮＯＣ−９０９培地にヒトリゾチーム４０
ｍｇ／ｌを添加して無血清培地を調製し、この培地にＮ
ＯＣ−９０９培地馴化ＣＥＭ細胞を１×１０4 細胞／ｍ
ｌになるように接種し、ＣＯ2 を５％濃度で吹き込みな
がら３７℃で７日間培養した。対照として、上記ＣＥＭ
細胞を、ヒトリゾチーム無添加のＮＯＣ−９０９培地あ
るいはリンパ球細胞用に通常用いられている無血清基礎
培地ＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco Laboratory製、市
販品) に通常の血清（ＦＢＳ）を１０％添加した血清培
地を使い同様の条件で培養した。その結果を図２に示
す。図２にみられるように、ＮＯＣ−９０９培地馴化Ｃ
ＥＭ細胞は、ヒトリゾチーム添加ＮＯＣ−９０９培地に
おいてＦＢＳ添加培地よりもその増殖が顕著に促進され
た。
【００２５】
【実施例５】表５及び表６に組成を示したＮＯＣ−４０
４培地に、ヒトリゾチーム４０ｍｇ／ｌを添加して無血
清培地を調製した。この培地に、抗ＨＢｓ抗体産生ハイ
ブリドーマＲ−３３（クローンＥ８）を１×１０5 細胞
／ｍｌになるように接種し、ＣＯ2 を５％濃度で吹き込
みながら１０日間培養を行ってＨＢｓ抗体を産生させ
た。また、対照としてヒトリゾチーム無添加のＮＯＣ−
４０４培地にアポトランスフェリン及びＦｅＳＯ4 −７
Ｈ2 Ｏ １ｍｇ／ｌ添加した培地に上記ハイブリドーマ
Ｒ−３３（クローンＥ８）を同様に接種し、同様の条件
で１０日間培養を行った。この結果を表９に示す。この
表から明らかなようにヒトリゾチーム添加培地は無添加
培地に比べて、ハイブリドーマの増殖および抗体産生が
促進されており、ヒトリゾチームは抗体を増産させる上
でも有用であることがわかる。
【００２６】
【表９】 ──────────────────────────────────── ３日目 10日目 生細胞数／ml PHA価 生細胞数／ml PHA価 ──────────────────────────────────── 無添加 65.9×104 × 80 0 × 320 40mg／l ヒトリゾチーム添加 98.6×104 × 80 0 × 1280 ────────────────────────────────────
【００２７】
【実施例６】ヒト抹消血から採血し、単球およびマクロ
ファージの貧食剤としてシリカゲル、ラテックスあるい
はカルボニルアイオンなどを採血液に対して約１０％の
割合で添加し３７℃で１時間インキュベートした後、常
法に従ってリンパ球を分離した。これを無血清培地（Ｎ
ＯＣ−９０５）に懸濁し細胞数を計測した。次に初発リ
ンパ球数５×１０5 ／ｍｌによるようにリンパ球を、ヒ
トリゾチーム（ＨＬＹ）およびＩＬ−２を添加したＮＯ
Ｃ−９０５培地に接種し、客量０．２ｍｌの９６穴ウエ
ル（６〜１０連）を用い培養してＨＬＹおよびＩＬ−２
の添加濃度とリンパ球の生育との関係について検討を行
った。培養４日目に 3Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを培地に
加え、さらに４時間培養してチミジンをリンパ球に取り
込ませた。
【００２８】その後、リンパ球をフィルターに吸着さ
せ、純水で洗浄し、フィルターをカクテル液に浸漬し、
液体シンチレー、ションカウンターで取り込まれた 3Ｈ
−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅから生ずるβ線量を計測すること
によってヒトリンパ球の 3Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取
り込み能（ＤＮＡ合成能）を測定した。その結果を図３
に示す。図３にみられるようにＩＬ−２の濃度に依存し
てチミジンの取り込み量が多くなるという一般に知られ
ている現象が確認出来た。そしてＩＬ−２単独使用の場
合よりＩＬ−２とヒトリゾチームを併用したときの方が
チミジンの取り込み量は多くなり、さらにＩＬ−２単独
の場合のチミジン取り込み量を最大にするＩＬ−２濃度
は５００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌであったものが、ヒトリゾチ
ームとの併用により２００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌまで低下さ
せ、養子免疫療法におけるＩＬ−２の使用量を低減させ
ることができる。またヒトリゾチームと併用するときの
ＩＬ−２は２００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ前後が好適範囲であ
る。
【００２９】
【実施例７】ＩＬ−２ ２００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌとヒト
リゾチーム０〜１００ｍｇ／ｌとをＮＯＣ−９０５培地
に添加した培地を用いヒトリンパ球を培養した。この点
以外は、実施例６と同様にしてヒトリンパ球を培養し、
チミジンの取り込み量を測定した。この結果を、図４に
示す。この図からみて、ヒトリゾチームを用いると図３
と同様にヒトリゾチームの濃度に依存してチミジンの取
り込み量は多くなるが、５０ｍｇ／ｌ付近からその取り
込みの割合は減少する。
【００３０】
【実施例８】ＮＯＣ−９０５培地にＩＬ−２ ２００Ｕ
／ｍｌあるいはこれにヒトリゾチーム（ＨＬＹ）１００
ｍｇ／ｌまたはニワトリ卵白リゾチーム（ＣＬＹ）１０
０ｍｇ／ｌを添加し、実施例６と同様にして、チミジン
の取り込み量を測定した。その結果を表１０に示す。
【００３１】
【表１０】 ──────────────────────────────────── 培 地 取り込み量 DPM ──────────────────────────────────── NOC-905 146.8±20.5 NOC-905 ＋ IL-2 200 U/ml 4195.4±430.1 NOC-905 ＋ IL-2 200 U/ml＋HLY 100mg/l 9617.0±799.4 NOC-905 ＋ IL-2 200 U/ml＋CLY 100mg/l 6241.2±843.1 ────────────────────────────────────
【００３２】
【実施例９】実施例６と同様の方法でリンパ球を分離、
精製し、初発濃度５×１０5 ／ｍｌとして０．５ｍｌ容
量の２４穴ウェルを用いＩＬ−２およびヒトリゾチーム
（ＨＬＹ）を添加したＮＯＣ−９０９培地およびＮＯＣ
−９０５培地を用い、リンパ球を培養した。１週間に約
２回の割合で継代（最初は培地の半量を交換し、その後
は１／５量交換）した。培養が進むにつれて細胞量が増
加するので２４穴ウェルから、３．５ｃｍシャーレ、６
ｃｍシャーレ、２５ｍｌフラスコと順次培養基を大きく
した。この培養期間の適宜の段階で顕微鏡観察を行って
リンパ球の生存の有無を確認した。この結果を表１１に
示す。この結果から分るように、ヒトリゾチームを添加
した無血清培地、特にＮＯＣ−９０５培地を用いたとき
にヒトリゾチーム添加によるリンパ球の生存期間がいち
ぢるしく延長され、しかも継代を長期間行うことができ
る。
【００３３】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２によるＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１１
９）細胞の培養結果を示す。
【符号の説明】
−●− ＮＯＣ−９０９培地のみを使用した場合の結果
た場合の結果 −◎− ヒトリゾチーム４０ｍｇ／ｌ添加したＮＹＳＦ
−９０９培地を使用した場合の結果
【図２】実施例４によるＮＯＣ−９０９培地馴化ＣＥＭ
細胞の培養結果をそれぞれ示す。
【符号の説明】
−〇− ＦＢＳ １０％添加したＲＰＭＩ １６４０培
地を使用した場合の結果 −●− ＮＯＣ−９０９培地のみを使用した場合の結果 −◎− ヒトリゾチーム４０ｍｇ／ｌ添加したＮＯＣ−
９０９培地を使用した場合の結果
【図３】実施例６のＩＬ−２の濃度変化によるチミジン
取り込み量の変動を示す。
【符号の説明】
−○− ＩＬ−２単独使用した場合 --●-- ＩＬ−２とヒトリゾチーム１００ｍｇ／ｍｌ添
加した培地使用した場合 −◎− ＩＬ−２とヒトリゾチーム２０ｍｇ／ｍｌ添加
した培地を使用した場合
【図４】実施例７のヒトリゾチーム（ＨＬＹ）の濃度変
化によるチミジンの取り込み量の変動を示す。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リゾチームを有効成分とする動物細胞増
    殖促進剤
  2. 【請求項２】 リゾチームを含有せしめてなる無血清培
    地
  3. 【請求項３】 リゾチームとサイトカインとを含有させ
    てなる無血清培地
  4. 【請求項４】 サイトカインがリンホカインである請求
    項３記載の無血清培地
  5. 【請求項５】 無血清培地がリンパ球用の培地である請
    求項２〜４のいずれかに記載の無血清培地
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