CN105907712B

CN105907712B - 抗原活化的免疫细胞及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN105907712B
Application number: CN201610262108.7A
Authority: CN
Inventors: 田耕; 夏燕; 毕冬梅; 李小燕; 肖奕丹
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2036-04-25
Also published as: CN105907712A

Abstract

本发明公开了一种抗原活化的免疫细胞及其培养方法和应用。本发明抗原活化的免疫细胞培养方法包括如下步骤：采集患者的外周血单个核细胞的步骤和将所述单个核细胞与肿瘤抗原和/或细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养的步骤。本发明抗原活化的免疫细胞用于制备细胞治疗肿瘤药物。本发明抗原活化的免疫细胞培养方法全程采用无血清培养基，有效避免了任何可能的外源性感染；抗原特异性强，多种细胞被激活，作用更接近人体抗肿瘤作用的整体效应，培养时间短。本发明抗原活化的免疫细胞和细胞治疗肿瘤药物能够在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。

Description

抗原活化的免疫细胞及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种抗原活化的免疫细胞及其培养方法和其应用。

背景技术

DC细胞又称树突状细胞，是一种具有高效杀伤活性的异质性细胞群，其在外人体周血淋巴细胞中的比例为1％～5％，临床证实，DC经大量扩增后，具有显著杀伤肿瘤和清除病毒的活性，且DC在机体细胞免疫和体液免疫中起重要调控作用。

DC细胞免疫疗法是生物治疗中最重要组成部分，其过程是提取患者自身的免疫细胞在体外活化、修饰、增殖后回输患者体内，诱导机体产生特异性或非特异性的免疫应答，在患者体内发挥杀灭肿瘤细胞和抗病毒作用。由于DC免疫细胞本身的生物特性，决定了其自2011年以来较理想、较成熟的肿瘤生物治疗用途。

DC细胞治疗方案的优势主要体现在以下4个方面。

1、效率性，有效率高：DC细胞治疗技术是继干扰素以来，首次把总有效率提高到70％以上的生物治疗。

2、无毒副作用，用自己的抗癌细胞对抗肿瘤。DC细胞疗法通过生物工程技术提取患者自身细胞经培养、增殖、修饰后回输到患者体内，不会产生排异反映，无毒副作用，变耐药性，安全有效。

3、安全性，所有细胞均在国际认证的GMP实验室培养安全可靠。

4、不易复发，DC细胞具有永久记忆功能，和天花疫苗一样DC能长期记忆肿瘤信息，能长期刺激抗癌系统对肿瘤发动攻击。

虽然DC治疗方案具有许多优点，但是DC细胞培养存在下述不足：

1.培养的细胞种类单一；2.培养周期相对较长。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种抗原活化的免疫细胞及其培养方法，以解决现有DC细胞培养存在培养的细胞种类单一；2.培养周期相对较长的技术问题。

本发明另一目的在于提供一种抗肿瘤药物，以克服现有其他细胞治疗药物存在外源性感染、培养获取时间长从而耽误患者肿瘤播散的风险。

为了实现上述发明目的，作为本发明的一个方面，提供了一种抗原活化的免疫细胞培养方法。本发明培养方法包括如下步骤：

采集患者的外周血单个核细胞；

将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养；其中，所述肿瘤抗原包括前列腺癌特异性的抗原蛋白(PSA)、黑色素瘤特异性的抗原(MAGE-3)、NY-ESO-1中的至少一种，所述细胞因子包括IL-2，IL-14，G-CSF中的至少一种。

作为本发明的另一方面，提供了一种抗原活化的免疫细胞。所述抗原活化的免疫细胞是采用本发明抗原活化的免疫细胞培养方法培养获得。

作为本发明的再一方面，提供了一种细胞治疗肿瘤药物，其特征在于：包含有有效剂量的本发明抗原活化的免疫细胞。

与现有技术相比，本发明抗原活化的免疫细胞培养方法具有以下优点：

1.全程采用无血清培养基，有效避免了任何可能的外源性感染；

2.抗原特异性强，采用重组表达的肿瘤特异性抗原，可大量制备，避免了采用肿瘤组织作为抗原时抗原量的不确定性，同时，针对不同的肿瘤类型可采用不同的肿瘤抗原；

3.多种细胞被激活，作用更接近人体抗肿瘤作用的整体效应：本发明培养方法获得的抗原活化的免疫细胞以抗原递呈细胞为中心，同时包括大量抗原特异性活化的抗肿瘤T淋巴细胞等，是一个以抗原在体外启动抗肿瘤免疫，输入体内后触发后续一系列级联、网络化免疫反应，在体内重新活化以杀伤性T细胞及其抗肿瘤细胞因子为主，以NK/NKT、甚至体液免疫为辅的多条抗肿瘤免疫途径。

4.培养时间短：整个制备时间缩短至48小时以内，极大的保持了效应细胞的活性和增殖能力。突破了传统基于树突状细胞或T淋巴细胞治疗，克服了原有制备手段复杂、效应细胞老化、增殖能力下降，体内生存时间短以及由此导致的制备时间长和费用昂贵的缺点，具有明显的创新优势。同时，由于培养时间短，回输方便，大大减小了患者采样后等待治疗的时间，避免了潜在的大量采集血细胞后患者肿瘤免疫失调、导致肿瘤扩散的可能。

本发明抗原活化的免疫细胞由于本发明培养方法培养获得，本发明细胞治疗肿瘤药物含有本发明抗原活化的免疫细胞，因此，本发明抗原活化的免疫细胞和细胞治疗肿瘤药物能够在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。这样，本发明抗原活化的免疫细胞的特异性既包括针对多种抗原表位的多表位特异性，又包括针对每种抗原表位的多种效应手段(杀伤性T细胞、Th1、细胞因子、NK/NKT、体液等)，这种良好的特异性具有优秀的抗肿瘤作用。

附图说明

图1为本发明实施例抗原活化的免疫细胞培养方法的工艺流程图；

图2为本发明实施例1诱导扩增的抗原活化的免疫细胞进行体外刺激机体分泌抗肿瘤的细胞因子的凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种抗原活化的免疫细胞培养方法。在一实施例中，所述抗原活化的免疫细胞培养方法流程如图1所示，其包括如下步骤：

S01：采集患者的外周血单个核细胞；

S02：单个核细胞活化培养：将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养。

在上述本发明实施例抗原活化的免疫细胞培养方法中，抗原活化的免疫细胞(Antigen Activated Immune Cells，AAIC)，在本发明实施例中，其是通过白细胞分离技术从患者的血液中收集大量具有抗肿瘤潜能的单个核细胞(以单核细胞和淋巴细胞为主)，通过特殊的分离、纯化、培养、用肿瘤特异性抗原刺激获得的大量细胞。这些细胞包含以树突细胞为核心的多种活化的效应细胞(如肿瘤靶标特异性杀伤性T细胞)，回输到病人体内后会诱导靶标特异性的抗肿瘤免疫反应，从而达到识别肿瘤和清除肿瘤的作用。

其中，上述步骤S01中，作为本发明的一实施例，外周血单个核细胞的采集可以但不仅仅按照如下方法：

首先通过白细胞分离技术获得患者的白细胞，再采集获得外周血单个核细胞。

在一实施例中，该白细胞分离技术可以是本领域常规的白细胞分离技术，在具体实施例中，可以直接采用白细胞分离机进行分离和收集患者的白细胞。在另一具体实施例中，分离和收集患者的白细胞的数量可以控制在(1-3)×10⁹个。

在另一实施例中，采集获得外周血单个核细胞可以是采用密度法离心收集外周血单个核细胞。

在进一步实施例中，在将步骤S01的采集的单个核细胞加入步骤S02所述无血清培养基中进行活化培养之前，还包括对所述单个核细胞进行培养前质控检查的步骤，如图中的步骤S01’。在具体实施例中，所述培养前质控检查的步骤S01’包括活细胞计数、无菌检测和FACS分析步骤。

其中，所述活细胞计数的方法-采用血球计数板计数；

无菌检测的方法-采用凝胶法测定细菌内毒素；

FACS分析的方法-采用流式细胞仪分析细胞表型。

通过增设前期质控检查的步骤，从而对活细胞数量和细胞类型，以保证单个核细胞的活力，从而进一步提高AAIC的活化率。

上述步骤S02中，采用重组表达的肿瘤特异性抗原，一方面可大量制备，避免了采用肿瘤组织作为抗原时抗原量的不确定性。另一方面针对不同的肿瘤类型可采用不同的肿瘤抗原，即针对每一种肿瘤类型，AAIC均使用其特异性的肿瘤抗原。针对每一种肿瘤类型，AAIC使用的肿瘤抗原具有多种特异性，活化针对多种蛋白质抗原、多肽抗原。

在一实施例中，加入无血清培养基中的所述肿瘤抗原包括前列腺癌特异性的抗原蛋白(PSA)、黑色素瘤特异性的抗原(MAGE-3)、NY-ESO-1中的至少一种。

在另一实施例中，加入无血清培养基中的所述细胞因子包括IL-2，IL-14，G-CSF中的至少一种。

在具体实施例中，肿瘤抗原和细胞因子可以有如下组合：

一具体实施例中，所述肿瘤抗原为所述NY-ESO-1，且所述细胞因子包括IL-14、G-CSF。

另一具体实施例中，所述肿瘤抗原为所述前列腺癌特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF。

再一具体实施例中，所述肿瘤抗原为所述黑色素瘤特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF。

中上述各实施例的基础上，在所述活化培养的过程中，所述肿瘤抗原的终浓度为500-1000U/ml，所述IL-2的终浓度为500-1000u/ml，所述IL-14的终浓度为10-50ng/ml，所述G-CSF的终浓度为50-150ng/ml。

如在一具体实施例中，当所述肿瘤抗原为所述NY-ESO-1，且所述细胞因子包括IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述NY-ESO-1的终浓度为1000U/ml，所述IL-14的终浓度为10ng/ml，所述G-CSF的终浓度为100ng/ml。

在另一具体实施例中，当所述肿瘤抗原为所述前列腺癌特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述前列腺癌特异性的抗原蛋白的终浓度为500U/ml，所述IL-2的终浓度为1000u/ml，所述IL-14的终浓度为20ng/ml，所述G-CSF的终浓度为150ng/ml。

在再一具体实施例中，当所述肿瘤抗原为所述黑色素瘤特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述黑色素瘤特异性的抗原的终浓度为1000U/ml，所述IL-2的终浓度为500u/ml，所述IL-14的终浓度为50ng/ml，所述G-CSF的终浓度为100ng/ml。

这样，由于针对不同的肿瘤类型可采用不同的肿瘤抗原。如在具体实施例中，采用前列腺癌特异性的抗原蛋白可以激活前列腺癌特异性的免疫细胞群。在另具体实施例中，采用黑色素瘤特异性的抗原可激活黑色素瘤特异性的免疫细胞群。在又具体实施例中，采用肿瘤特异性共享抗原如NY-ESO-1、MAGE-3等可激活多种抗肿瘤免疫细胞群。另外，上述各实施例中，通过对这些肿瘤蛋白质抗原、多肽抗原进行重组优化、组合、添加辅助性肽链，产生了不同于其他产品的抗原组合。通过使用这些肿瘤蛋白质抗原、多肽抗原的重组优化、组合、添加辅助性肽链，实现了对多抗原、对多表位特异性的杀伤性T细胞的活化，以及以杀伤性T细胞为主的多个次要(NK/NKT，Th1)、下游(细胞因子，体液)等多价的、网络化的特异性抗肿瘤作用。这样产生的AAIC将在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。因此AAIC的特异性既包括针对多种抗原表位的多表位特异性，有包括针对每种抗原表位的多种效应手段(杀伤性T细胞、Th1、细胞因子、NK/NKT、体液等)，这种良好的特异性具有优秀的抗肿瘤作用。

在另一实施例中，在步骤S02的所述活化培养的过程中，所述单个核细胞在所述无血清培养基的浓度为(1-5)×10⁶。

通过对单个核细胞与所述肿瘤抗原和/或细胞因子的浓度和其在无血清培养基的浓度的控制和优化，提高肿瘤抗原和/或细胞因子对单个核细胞的活化效果，从而提高有效AAIC的量，并提高AAIC的生成速率，缩短降低活化培养的时间。

在一实施例中，该步骤S02中所用的无血清培养基选用但不仅仅为1640培养基。

在进一步实施例中，在上述步骤S02之后，也即是在将所述单个核细胞加入所述无血清培养基中进行活化培养之后，还包括对所述活化培养后的细胞进行活化培养后质控检查的步骤。在具体实施例中，活化培养后质控检查的步骤包括活细胞计数、无菌检测、内毒素检测和FACS分析步骤。

内毒素检测的方法-凝胶法。

通过增设后期质控检查的步骤，通过基本的检菌、内毒素检测等项目以保证活化后的AAIC的质量，还对活化的AAIC表面标志上做了更加严格的控制，如对AAIC中主要细胞成分的检测和控制，具体的如CD40、CD54等树突细胞表面标志物、CD62L、CD57等T细胞表面标志物均要求的表达有十数倍增高，充分保证了AAIC产品的表型，这些表型研究表明都是树突细胞和杀伤性T细胞良好功能的标志。

因此，由上述可知，AAIC培养方法对活化培养工艺进行优化，一是围绕产品质量控制的改进：在产品质量控制上，我们除了基本的检菌、内毒素检测等项目，在产品表面标志上做了更加严格的要求，如对产品中主要细胞成分的要求，CD40、CD54等树突细胞表面标志物、CD62L、CD57等T细胞表面标志物均要求的表达有十数倍增高，充分保证了AAIC产品的表型，这些表型研究表明都是树突细胞和杀伤性T细胞良好功能的标志。二是围绕生产过程简化、优化的改进：我们对AAIC的生产流程做了大量的改进，使患者细胞在获得肿瘤杀伤和诱导抗肿瘤免疫作用的功能以外，尽可能少的受非自体因素的影响，大大的降低了潜在污染、细胞老化、抗肿瘤潜能降低等可能。三是极大的缩短了培养时间，整个活化培养时间缩短至48小时以内，极大的保持了效应细胞的活性和增殖能力，由于培养时间短，回输方便，大大减小了患者采样后等待治疗的时间，避免了潜在的大量采集血细胞后患者肿瘤免疫失调、导致肿瘤扩散的可能。而传统培养方式均在一周左右的时间，过程复杂，操作繁多，产品质量良莠不齐，从而突破了传统基于树突状细胞或T淋巴细胞治疗，克服了原有制备手段复杂、效应细胞老化、增殖能力下降，体内生存时间短以及由此导致的制备时间长和费用昂贵的缺点。

另外，本发明实施例AAIC培养方法能够针对每一种肿瘤类型均使用其特异性的肿瘤抗原。针对每一种肿瘤类型，AAIC培养方法所使用的肿瘤抗原具有多种特异性，活化针对多种蛋白质抗原、多肽抗原。通过使用这些肿瘤蛋白质抗原、多肽抗原的重组优化、组合、添加辅助性肽链，实现了对多抗原、对多表位特异性的杀伤性T细胞的活化，以及以杀伤性T细胞为主的多个次要(NK/NKT，Th1)、下游(细胞因子，体液)等多价的、网络化的特异性抗肿瘤作用。这样产生的AAIC将在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。因此AAIC的特异性既包括针对多种抗原表位的多表位特异性，有包括针对每种抗原表位的多种效应手段(杀伤性T细胞、Th1、细胞因子、NK/NKT、体液等)，这种良好的特异性具有优秀的抗肿瘤作用。

其次，活化培养获得的AAIC如上所述，AAIC是多抗原刺激产生的产品，同时AAIC是包含多重细胞类型，不仅仅是单一的树突细胞，它的抗肿瘤作用具有多价特异性和多重特异性，即具有横向的多价抗原，又具有纵向的同一抗原的多重特异性效应，形成强大的抗肿瘤协同效应，这一效应真实的模拟了体内免疫系统抗击“非己”抗原时的情况，具有全面性、仿真性。其优点是：一，避免了过去其他产品使用单一抗原多肽的单价性，抗肿瘤作用不全面，在杀伤肿瘤过程中肿瘤细胞容易发生耐受、逃逸免疫杀伤；二，避免了其他产品抗肿瘤作用的单一层面，很多产品使用单一的树突细胞，细胞在体外活化过于充分，回输后容易死亡，同时不利于树突细胞对其相互作用的下游效应细胞进行活化，AAIC是一个多细胞混合培养产品，其相互产生的细胞因子等对下游肿瘤特异性效应细胞有良好的激活作用，这种多细胞共培养的方式正是体内局部或全身产生抗肿瘤免疫时的真实反映。

另一方面，在上述AAIC培养方法的基础上，本发明实施例还提供了一种抗原活化的免疫细胞(AAIC)。在一实施例中，该AAIC是有上文本发明实施例AAIC培养方法活化培养获得。这样本发明所述AAIC如上文所述的，具有能够在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。其中，本发明实施例AAIC的特异性既包括针对多种抗原表位的多表位特异性，又包括针对每种抗原表位的多种效应手段(杀伤性T细胞、Th1、细胞因子、NK/NKT、体液等)，这种良好的特异性具有优秀的抗肿瘤作用。

再一方面，本发明实施例还提供了一种细胞治疗肿瘤药物。在一实施例中，本发明实施例细胞治疗肿瘤药物包含有有效剂量的上文本发明实施例AAIC。这样，由于本发明实施例细胞治疗肿瘤药物含有上文本发明实施例AAIC，因此，该细胞治疗肿瘤药物具有上文本发明实施例AAIC的特性，如具有能够在体内诱导产生多个表位特异性的抗肿瘤效应网络，各个效应网络之间相互协作共同实现抗肿瘤作用。而且，如上文所述，AAIC的培养时间短，因此，缩短了本发明实施例细胞治疗肿瘤药物获得时间，大大减小了患者采样后等待治疗的时间，从而使得患者能够及时得到治疗，避免了潜在的大量采集血细胞后患者肿瘤免疫失调、导致肿瘤扩散的可能。

下面通过具体实施例对上述本发明实施例抗原活化的免疫细胞及其培养方法进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种抗原活化的免疫细胞培养方法以及由该方法培养的抗原活化的免疫细胞。该抗原活化的免疫细胞培养方法包括以下步骤：

S11.外周血单个核细胞(PMBC)悬液制备：

抽取病人外周血50ml，用生理盐水1:1稀释后加入淋巴细胞分离液15ml，离心(2000rpm，20min)，收集白膜层细胞；

用50ml盐水洗三次，最后用含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-14的1640培养液(12ml)重悬；

S12.AAIC的诱导扩增：

将步骤S11制备的PMBC悬液分装入六孔板中，PMBC浓度5×10⁶/ml，2ml/孔，加入对应的抗原NY-ESO-1，1000U/ml；

置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中培养；

第5天收获AAIC，取样进行活细胞计数，内毒素检测，流式细胞检测，结果合格后可用于细胞回输。

将本实施例1诱导扩增的AAIC进行体外培养，并将培养的产物进行凝胶电泳试验，得知其AAIC刺激机体能够分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子。

实施例2

本实施例提供一种抗原活化的免疫细胞培养方法以及由该方法培养的抗原活化的免疫细胞。该抗原活化的免疫细胞培养方法步骤如实施例1中培养步骤，不同之处在于肿瘤抗原为前列腺癌特异性的抗原蛋白(PSA)，细胞因子为IL-2、IL-14和G-CSF的组合，其中，PSA的终浓度为500u/ml，IL-2的终浓度为1000u/ml，IL-14的终浓度为20ng/ml，G-CSF的终浓度为150ng/ml。

实施例3

本实施例提供一种抗原活化的免疫细胞培养方法以及由该方法培养的抗原活化的免疫细胞。该抗原活化的免疫细胞培养方法步骤如实施例1中培养步骤，不同之处在于肿瘤抗原为黑色素瘤特异性的抗原(MAGE-3)，细胞因子为IL-2、IL-14和G-CSF的组合，其中，MAGE-3的终浓度为1000U/ml，IL-2的终浓度为500u/ml，IL-14的终浓度为50ng/ml，G-CSF的终浓度为100ng/ml。

将本实施例2、3诱导扩增的AAIC进行体外培养，并将培养的产物进行凝胶电泳试验，得知其AAIC刺激机体也能够分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子。

由实施例1-3提供的AAIC的体外实验得知，本发明实施例提供的AAIC包括针对多种抗原表位的多表位特异性，又包括针对每种抗原表位的多种效应手段，这种良好的特异性具有优秀的抗肿瘤作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗原活化的免疫细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

采集患者的外周血单个核细胞；

将所述单个核细胞与肿瘤抗原和细胞因子加入无血清培养基中进行活化培养；所述肿瘤抗原为前列腺癌特异性的抗原蛋白、黑色素瘤特异性的抗原或NY-ESO-1，其中，所述肿瘤抗原为所述NY-ESO-1，所述细胞因子为IL-14、GM-CSF；所述肿瘤抗原为所述前列腺癌特异性的抗原蛋白，所述细胞因子为IL-2、IL-14、G-CSF；所述肿瘤抗原为所述黑色素瘤特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子为IL-2、IL-14、G-CSF；对所述活化培养后的细胞进行活化培养后质控检查，检查结果合格的细胞用于细胞回输。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述肿瘤抗原为所述NY-ESO-1，且所述细胞因子包括IL-14、GM-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述NY-ESO-1的终浓度为1000U/ml，所述IL-14的终浓度为10ng/ml，所述GM-CSF的终浓度为100ng/ml；

所述肿瘤抗原为所述前列腺癌特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述前列腺癌特异性的抗原蛋白的终浓度为500U/ml，所述IL-2的终浓度为1000u/ml，所述IL-14的终浓度为20ng/ml，所述G-CSF的终浓度为150ng/ml；

所述肿瘤抗原为所述黑色素瘤特异性的抗原蛋白，且所述细胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF时，在所述活化培养的过程中，所述黑色素瘤特异性的抗原的终浓度为1000U/ml，所述IL-2的终浓度为500u/ml，所述IL-14的终浓度为50ng/ml，所述G-CSF的终浓度为100ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：在将所述单个核细胞加入所述无血清培养基中进行活化培养之前，还包括对所述单个核细胞进行培养前质控检查的步骤。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述培养前质控检查的步骤包括活细胞计数、无菌检测和FACS分析步骤。

5.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：在将所述单个核细胞加入所述无血清培养基中进行活化培养之后，还包括对所述活化培养后的细胞进行活细胞计数、无菌检测、内毒素检测和FACS分析步骤。

6.一种抗原活化的免疫细胞，其特征在于：所述抗原活化的免疫细胞是采用权利要求1-5任一所述的培养方法培养获得。

7.一种细胞治疗肿瘤药物，其特征在于：包含有有效剂量的权利要求6所述的抗原活化的免疫细胞。