CN103013915B

CN103013915B - 一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法

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Publication number: CN103013915B
Application number: CN201310007145.XA
Authority: CN
Inventors: 高岱清; 于华; 马伟; 赵鹏; 解西河; 魏晓芳; 李长优; 孙伟红
Original assignee: 高岱清
Current assignee: Hangzhou Kang Wanda Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2033-01-09
Also published as: CN103013915A

Abstract

本发明公开了一种制备高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：a、从外周血中采集和分离单个核细胞；b、将步骤a得到的单个核细胞加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养，6天后收集树突状细胞；c、在含有步骤b收集树突状细胞的培养液里，加入相应的抗原和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD），继续培养，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。该制备方法在负载肿瘤抗原时加入PPD，类似于免疫佐剂的作用，增加了DC处理肿瘤抗原的能力，从而间接的提高了由这些细胞刺激产生的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。

Description

一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式。肿瘤细胞免疫治疗是肿瘤生物治疗中疗效最为切实的方法之一，由于肿瘤细胞的多态性决定了根治肿瘤不可能仅仅依靠一种方法。抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC) 是能摄取、加工处理抗原，并将抗原递呈给淋巴细胞的一类免疫细胞，作为特异性肿瘤杀伤细胞产生和制备过程中不可缺少的组成部分，在肿瘤的免疫治疗中发挥着不可替代的作用。树突状细胞（dendritic cell；DC）是存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原递呈细胞之一，富集于淋巴组织及非淋巴组织中，具有强大的抗原递呈能力，可将抗原肽表达到树突细胞的Ⅰ类和Ⅱ类上，并分别激活CD4、CD8T细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成，非常适用于多种肿瘤的免疫疗法。

DC用于肿瘤免疫治疗的疗效与DC数量和DC负载肿瘤抗原的量密切相关。目前常规DC制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，加入DC无血清培养液，适量的白介素-4，GM-CSF等细胞因子将单核细胞培养成DC细胞，再加入相应的肿瘤抗原继续培养2天，使DC成为负载肿瘤抗原的DC，这种细胞与淋巴细胞共同培育，产生具有肿瘤特异性杀伤活性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），CTL细胞的杀伤活性与DC的数量和DC负载肿瘤抗原的量有密切的关系。虽然这种方法通过添加细胞因子，使DC的数量明显增加，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足，进而影响对肿瘤的治疗效果。如中国专利文献CN101755045A公开了一种树突状细胞的制备方法，在多种细胞因子（GM-GSF、SCF）存在下培养树突状细胞前体细胞，制备足够数量的DC细胞用于免疫治疗，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，进而影响对肿瘤的治疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中制备的树突状细胞由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足，进而影响对肿瘤的治疗效果的技术问题，进而提供一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，既可以保证树突状细胞的数量，又可以提高树突状细胞负载肿瘤抗原的量。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：

a、从外周血中采集和分离单个核细胞；

b、将步骤a得到的单个核细胞加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，然后置于培养箱中培养后收集树突状细胞；

c、在含有步骤b收集树突状细胞的培养液里，加入相应的抗原和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物，继续培养，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。

所述步骤c培养液中结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD）的浓度为0.1u/ml-2u/ml。

所述步骤c培养液中结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD）的浓度为0.5u/ml，继续培养的时间为2天。

所述步骤b中将培养液置于 37℃、5%CO2培养箱中培养6天收集树突状细胞。

所述步骤a中所述分离单个核细胞是将获得的血细胞样本，用淋巴细胞分层液除去混杂的红细胞和粒细胞，用生理盐水低速离心洗涤3次，除去血小板获得。

所述步骤b中IL-4浓度为5ng/ml-100ng/ml，GM-CSF浓度为10ng/ml-500ng/ml，培养3-4天补液至原体积。

所述步骤b中IL-4浓度为50ng/ml，GM-CSF浓度为250ng/ml。

所述步骤b的培养液中加入抗生素。

本发明还涉及一种所述方法制备的高活性负载抗原的树突状细胞。

本发明所述的技术方案相对于现有技术具有以下优点：

本发明首先按照常规方法将单个核细胞培养成DC细胞，再加入相应的肿瘤抗原和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD），继续培养，使DC成为负载肿瘤抗原的DC，这种细胞与淋巴细胞共同培育，产生具有肿瘤特异性杀伤活性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），CTL细胞的杀伤活性与DC负载肿瘤抗原的量有密切的关系。由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足。在负载肿瘤抗原时加入PPD，类似于免疫佐剂的作用，增加了DC处理肿瘤抗原的能力，从而间接的提高了由这些细胞刺激产生的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。临床试验表明用本发明方法制备的DC治疗100例恶性肿瘤术后的患者，病人的5年生存率达到85%以上，而采用常规治疗方法制备的DC治疗病人的5年生存率只有15%-35%。

具体实施方式

实施例1

从外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，调整IL-4浓度为5ng/ml，GM-CSF浓度为10ng/ml，然后置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，6天后收集树突状细胞；再加入作为抗原的恶性黑色素瘤细胞株裂解物和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD），调整PPD浓度为0.1u/ml，继续培养2天，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。

实施例2

从外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，调整IL-4浓度为100ng/ml，GM-CSF浓度为500ng/ml，然后置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，6天后收集树突状细胞；再加入作为抗原的恶性黑色素瘤细胞株裂解物和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD），调整PPD浓度为2u/ml，继续培养2天，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。

实施例3

从外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，调整IL-4浓度为50ng/ml，GM-CSF浓度为255ng/ml，然后置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，6天后收集树突状细胞；再加入作为的抗原恶性黑色素瘤细胞株裂解物和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD），调整PPD浓度为0.5u/ml，继续培养2天，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。

实施例4

从外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4、GM-CSF、链霉素，调整IL-4浓度为50ng/ml，GM-CSF浓度为255ng/ml，链霉素浓度为25ng/ml，然后置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，6天后收集树突状细胞；再加入作为抗原的恶性黑色素瘤细胞株裂解物和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD），调整PPD浓度为0.5u/ml，继续培养2天，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。

其他用作本发明制备方法的肿瘤细胞抗原包括肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤细胞等。

对比例

按照中国专利文献CN101755045A公开的方法制备树突状细胞，收集树突状细胞，置于DC无血清培养液中，再加入作为抗原恶性黑色素瘤细胞株裂解物和生理盐水，继续培养2天，即可获得负载抗原的树突状细胞。

MTT法检测CIK细胞的杀伤活性

将实施例1-3和对比例所得负载抗原的树突状细胞分别与恶性黑色素瘤细胞共同培养，培养6小时后，用MTT法检测肿瘤细胞死亡比例来比较杀瘤活性，结果换算成杀瘤单位（LU）如下表1：

Figure 201310007145X100002DEST_PATH_IMAGE001

实验例

1、治疗对象：恶性黑色素瘤患者100例，年龄47-73岁，男性55例，女性45例。所有患者均进行过放疗或化疗，病情未得到有效控制。血清肿瘤标志物不同程度升高，患者预期生存大于3个月，重要生命器官正常，无严重细菌感染，无生物制品过敏史。

2、治疗过程：所有患者均在放疗或化疗终止后15天采用实施例4制备方法所得的负载抗原的树突状细胞静脉输注进行治疗。每天一次，5天为一疗程，每次输注细胞为（50-150X10⁸）细胞。第一疗程完成后的第三个月进行第二疗程治疗，多数患者接受两个或两个以上疗程治疗。

3、疗效评估：

1）影像学指标（CT指标）

负载抗原的树突状细胞治疗疗效评定采用WHO通用实体瘤疗效评定标准。完全缓解（CR）：可测量的病灶完全消失，维持4周以上；部分缓解（PR）：可测量的病灶最大直径及最大垂直横泾的乘积缩小一半以上，无新病灶出现；好转（MR）：可测量的病灶两径乘积缩小25-50%，无新病灶出现；稳定（SD）：可测量的病灶两径乘积缩小＜25%或增大＜25%，无新病灶出现；进展（PD）：可测量的病灶两径乘积增大＞25%，或出现新的病灶。

2）血清动态肿瘤标志物（甲胎蛋白）检测：

治疗前、治疗后每月进行一次检测，甲胎蛋白不再升高、稳定或持续下降为有效。

3）生命质量评分：

按照国际通行标准KPS评分方法，对患者治疗前、后动态生命质量进行评分，分数增加为有效。

4）免疫功能检测：对患者治疗前、后动态T淋巴细胞亚群进行检测，观察T淋巴细胞亚群变化情况，反映患者免疫功能恢复情况。

4、结果：

治疗后影像学指标：CR 6例、PR 21例、MR 23例、SD 26例、PD 24例。

有效率（CR+PR+MR+SD）=76%

肿瘤标志物检测结果：下降67例，稳定11例，升高22例。

生命质量评分：82例升高，7例稳定，11例降低。

T细胞亚群检测：治疗后有 77 例患者T细胞杀伤活性升高，占 77 %。

对比实验例

使用对比例所得负载抗原的树突状细胞对相同体质、病情状态的100例患者进行临床试用，治疗过程和疗效评估方法同实验例，结果如下：

结果：

治疗后影像学指标：CR 2例、PR 16例、MR 15例、SD 21例、PD 46例。

有效率=（CR+PR+MR+SD）=54%

肿瘤标志物检测结果：下降62例，稳定9例，升高29例。

生命质量评分：17例升高，18 例稳定，65例降低。

T细胞亚群检测：治疗后有 46例患者T细胞杀伤活性升高，占46%。

虽然本发明已经通过上述具体实施例对其进行了详细阐述，但是，本专业普通技术人员应该明白，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变化，均属于本发明所要保护的范围。

Claims

1.一种高活性负载以恶性黑色素瘤细胞株裂解物为抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、从外周血中采集和分离单个核细胞；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c培养液中结核分枝杆菌纯蛋白衍生物的浓度为0.1u/ml-2u/ml。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c培养液中结核分枝杆菌纯蛋白衍生物的浓度为0.5u/ml，继续培养的时间为2天。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b中将培养液置于 37℃、5%CO2培养箱中培养6天收集树突状细胞。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中所述分离单个核细胞是将获得的血细胞样本，用淋巴细胞分层液除去混杂的红细胞和粒细胞，用生理盐水低速离心洗涤3次，除去血小板获得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b中IL-4浓度为5ng/ml-100ng/ml，GM-CSF浓度为10ng/ml-500ng/ml，培养3-4天补液至原体积。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b中IL-4浓度为50ng/ml，GM-CSF浓度为250ng/ml。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤b的所述培养液中加入抗生素。