CN105018427B

CN105018427B - 一种增强ctl免疫反应的dc细胞培养方法

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Publication number: CN105018427B
Application number: CN201510397637.3A
Authority: CN
Inventors: 丛秀丽
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Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2035-07-08
Also published as: CN105018427A

Abstract

本发明公开了一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，该方法采用sh‑RNA去除蛋白质泛素化修饰途径中的Ube1L的表达，有效地提高了DC细胞对肿瘤抗原的呈递能力；发挥更有效地体内杀伤肿瘤的能力；该方法采用临床级别无血清培养基进行DC细胞的培养，同时通过加入1％人血白蛋白和改变细胞因子的剂量配比，将培养时间缩短到4天，减少了时间、空间和人员占有率；该方法调整了促熟细胞因子组合的种类和剂量，使获得的成熟DC细胞能够更有效地促进CD8+CTL细胞增殖，从而提高了抗肿瘤的疗效。

Description

一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法

技术领域

本发明涉及细胞制备领域，具体为一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法。

背景技术

CTL：又称细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)：是白细胞的亚群，为一种特异CD8+T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。

蛋白质泛素化修饰：是泛素～蛋白酶体系统降解细胞内蛋白质的主要步骤，通过由泛素激活酶(ubiquitin～activating enzyme,E1，Ube1L)、泛素结合酶 (ubiquitinconjugating enzyme,E2)和泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3)等一系列酶活动将泛素连接到特定蛋白质分子上，然后连接泛素的蛋白质被蛋白酶体降解或发生功能改变。

泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。

DC细胞：又称树突状细胞(Dendritic cells,DC)，1973年，Steiman和Cohn 首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞(dendriticcells，DCs)。DCs是机体免疫反应的始动者，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，是唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。 DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。

DC抗肿瘤的机制如下：①DC可以高表达MHC～Ⅰ类和MHC～Ⅱ类分子，MHC 分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽～MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC～I类限制性CTL反应和MHC～Ⅱ类限制性的CD4+Thl反应。同时， DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7～1、CD86/B7～2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。②DC与T细胞结合可大量分泌IL～ 12、IL～18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；③DC分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines，CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL～12、IFN～γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化DC，上调IL～12及CD80、 CD86的表达；同时DC也直接向CD8+T细胞呈递抗原肽，在活化的CD4+T细胞辅助下使CD8+T细胞活化，CD4+和CD8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。

DC分布广泛，但数量极微。它主要来源于骨髓系，也可由人外周血单核细胞在细胞因子诱导下直接分化形成成熟的树突状细胞。目前的经典制备方法是：采集人体外周血，分离得到单个核细胞，在体外利用磁珠分选的方法分离出单核细胞，然后应用各种细胞因子共同培养7天后诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原，制成负载肿瘤抗原的DC。再将这些DC细胞注入体内后刺激体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞增殖，发挥长期肿瘤监视作用和肿瘤杀伤作用，达到消灭肿瘤的目的。

现有技术中CD细胞的培养方法通常为：

1)、将采集的血液以密度梯度离心法分离，收集单个核细胞。

2)、细胞沉淀用含1％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基重悬，调节细胞浓度3～4×10⁶/mL，于37℃， 5％CO2培养箱中孵育2小时，弃去悬浮细胞。

3)、用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬贴壁细胞，调整细胞浓度为1× 10⁶/mL，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和IL-4，于 37℃，5％CO2培养箱中培养7天。期间每隔3天半量换液，补充细胞因子。

4)、第七天加入IL-1β(10ng/mL)，IL-6(10ng/mL)，TNF-α(10ng/mL)， PGE2(1μg/mL)，孵育24小时。

5)、第8天收获成熟DC细胞。

但是这种方法使用含有胎牛血清的培养基，在人体可能会产生针对异种蛋白的过敏反应，培养时间为8天，漫长的培养过程降低了DC细胞的活性，增加了体外培养过程中细菌等微生物污染的机会，现有的促进DC成熟的细胞因子，不能大量地诱导Th1-DC的产生，因此不能有效地促进细胞毒性T细胞增殖，最终获得的DC抗原摄取、加工和呈递能力较低，只有15～20％，不能有效地激活细胞毒性T细胞(CTL)的增殖和杀伤能力。因此，寻求一种有效的DC培养方法是提高免疫治疗疗效的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中获得的DC周期长、摄取和呈递肿瘤抗原的能力只有15～20％，不能有效地激活细胞毒性T细胞(CTL)的增殖和杀伤能力的缺陷，提供一种有效的DC培养方法是提高免疫治疗疗效的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1)、采集血液，制备贴壁单核细胞；

2)、贴壁单核细胞的诱导分化

用含1％人血白蛋白的无血清培养液重悬贴壁单核细胞，调整贴壁单核细胞的浓度为1～2×10⁶/mL，加入400～1000pFU/细胞量的Ube1L sh-RNA慢病毒于 37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中孵育2小时后，更换新鲜的1％人血白蛋白的无血清培养液，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml 的细胞因子IL-4，于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测；

培养第72h，半量补充新鲜的1％人血白蛋白的无血清培养液和终浓度为 50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，并加入促熟细胞因子组合，于37℃，5％CO2培养箱中孵育16～24小时；

培养第96h，收集成熟DC细胞，进行细胞染色和流式检测和Western blotting方法检测蛋白质ISGylation表达水平。

进一步的，所述步骤2)中的促熟细胞因子组合的添加量为10～20μg/mL poly(IC)，5～10μg/mL LPS，500～1000IU/mL IFN～γ，10～20ng/mL TNF～α。

进一步的，采集血液，制备贴壁单核细胞的方法为：

1)、将新鲜采集的血液收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，摇匀；

2)、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，按照稀释后的血液与淋巴细胞分离液的体积比为3：2，将稀释后的血液缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，注意保持液层分界清晰；

3)、在20℃下900g离心25min，离心结束后，吸取单个核细胞层液体，移入新的离心管中；

4)、以5倍于3)中收集到的单个核细胞层液体积的生理盐水稀释单个核细胞层液，在4℃下400g离心5min；

5)重复步骤4)两次，去除上清液；

6)、用无血清培养液重悬细胞，调节细胞密度为2～3×10⁶/mL，于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中孵育1小时，弃去悬浮细胞，获得贴壁的单核细胞。

本发明的增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，适用于外周血、脐血来源的DC细胞培养，经验证，可获得以上所呈现的结果，两者之间无明显差异，在肿瘤的治疗中，采取DC细胞在肿瘤局部淋巴结附近皮下注射的方式，有效地提高肿瘤局部淋巴结和肿瘤组织内部的效应性CTL细胞的增殖，增强了抗肿瘤的疗效。

与现有技术相比，具有以下有益效果：

一、采用sh-RNA去除蛋白质泛素化修饰途径中的Ube1L的表达，从而去除了DC细胞中的蛋白质泛素化，有效地提高了DC细胞对肿瘤抗原的呈递能力；而且，经sh-RNA处理的DC细胞倾向于诱导较高比例的抗原特异性的效应性CTL 细胞，使其活化和增殖能力明显增强，发挥更有效地体内杀伤肿瘤的能力。

二、应用临床级别无血清培养基进行DC细胞的培养，同时通过加入1％人血白蛋白和将细胞因子的添加量的终浓度调整为50～100ng/mL的GM-CSF和15～ 50ng/ml的IL-4，将培养时间缩短到4天，有效地提高了细胞的纯度和活性，减少了体外长时间培养的污染可能性，减少了时间、空间和人员占有率。

三、调整了促熟细胞因子组合的种类和剂量，使获得的成熟DC细胞能够更有效地促进CD8+CTL细胞增殖，从而提高了抗肿瘤的疗效。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的单个核细胞分离图例；其中1是血浆层，2是单个细胞核，3 是分离液层(含有粒细胞)，4是红细胞层(含有大量红细胞)；

图2是本发明的Ube1L sh-RNA慢病毒载体示意图；

图3a是未成熟DC(第三天)；

图3b是成熟DC(第四天)；

图3c未成熟DC(第三天)；

图3d成熟DC(第四天)；

图4a是成熟前DC细胞流式检测图SSC-FSC；

图4b是成熟前DC细胞流式检测图HLA-DR；

图4c是成熟前DC细胞流式检测图CD86 APC；

图5a是成熟后DC细胞流式检测图SSC-FSC；

图5b是成熟后DC细胞流式检测图HLA-DR；

图5c是成熟后DC细胞流式检测图CD86 APC；

图6a未处理成熟后的DC细胞中蛋白质ISGylation表达水平---WB结果图；

图6b是sh-RNA DC成熟后蛋白质ISGylation表达水平---WB结果图；

图7a是未处理DC-CTL细胞的OVA蛋白质抗原特异性的OT-I CD8+CTL细胞的增殖情况；

图7b是sh-RNA DC-CTL细胞OVA蛋白质抗原特异性的OT-I CD8+CTL细胞的增殖情况；

图8a是本发明的肿瘤体积大小；其中，5是无DC治疗组，6是未处理DC 治疗组，7是sh-RNA DC治疗组；

图8b是本发明的肿瘤重量；

图9a是未处理DC组的肿瘤组织浸润的淋巴细胞检测；

图9b是sh-RNA DC组的肿瘤组织浸润的淋巴细胞检测；

图9c是未处理DC的肿瘤组织浸润的淋巴细胞检测；

图9d是sh-RNA DC组的肿瘤组织浸润的淋巴细胞检测；

图9e是未处理DC组与sh-RNA DC组的肿瘤组织浸润的淋巴细胞检测对比图；

图10a未处理DC组的肿瘤局部淋巴结中CD8+CTL细胞检测；

图10b sh-RNA DC组肿瘤局部淋巴结中CD8+CTL细胞检测；

图10c是未处理DC组与sh-RNA DC组的组肿瘤局部淋巴结中CD8+CTL细胞检测对比图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，包括以下几个步骤：

1)、采集血液，制备贴壁单核细胞；

①、将新鲜采集的外周血或者脐血收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，迅速摇匀避免发生凝血；需要运输时，需要将血袋和生物冰袋一起放入特制的保温箱，保持温度为4～25℃，温差不超过±5℃。6小时内运送至实验室。运输途中保证血液不经过X线照射，并远离辐射源。

②、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，按照稀释后的血液与淋巴细胞分离液的体积比为3：2，将稀释后的血液缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，注意保持液层分界清晰；如图1所示；

③、在20℃下900g离心25min，离心结束后，可观察到离心管中液面分层，尽可能的吸取单个核细胞层液体，移入新的离心管中；

④、以5倍于③中收集到的单个核细胞层液体积的生理盐水稀释单个核细胞层液，在4℃下400g离心5min；

⑤重复步骤④两次，去除上清液；

⑥、用无血清培养液重悬细胞，调节细胞密度为2～3×10⁶/mL，于37℃， 5％体积浓度的CO2培养箱中孵育1小时，弃去悬浮细胞，获得贴壁的单核细胞。

2)、贴壁单核细胞的诱导分化

用含1％人血白蛋白的无血清培养液重悬贴壁单核细胞，调整贴壁单核细胞的浓度为1～2×10⁶/m L加入400～1000pFU/细胞量的Ube1L sh-RNA慢病毒于 37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中孵育2小时后，更换培养基，并加入终浓度为 50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃，5％ CO2培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测，检测结果见图3和图4和图5。

图3和图4可知，促熟细胞因子添加前后，DC细胞形态发生明显改变。未成熟DC细胞有明显的针状突起，呈放射状。成熟后的DC细胞体积稍大，表面针状突起变为球形突起。最后变成不规则形状，由图5可知：成熟的DC细胞颗粒增多，体积变大，HLA-DR和CD86的表达量明显增高。慢病毒处理不影响DC细胞的成熟和表型变化。

培养第72h，半量补充新鲜培养液和细胞因子，并加入促熟细胞因子组合，促熟细胞因子组合的添加量为10～20μg/mL poly(IC)，5～10μg/mL LPS，500～ 1000IU/mL IFN～γ，10～20ng/mL TNF～α，于37℃， 5％CO2培养箱中孵育16～ 24小时；

培养第96h，收集成熟DC细胞，进行细胞染色和流式检测和Western blotting方法检测蛋白质ISGylation表达水平，检测见过见图6所示。

由图6可见，成熟的DC细胞呈现活化状态，其胞质中蛋白质ISGylation的表达增高，伴随着ISG15因子的产生。经sh-RNA处理的DC细胞，因为缺乏 Ube1lL的表达，无蛋白质ISGylation的修饰，因此伴随着较高水平的游离ISG15 因子的产生。

特异性细胞毒性T细胞(CTL)的增殖体外试验

OT-I CD8+T细胞是一种TCR转基因细胞，其TCR可特异性识别MHC-I类分子提呈的OVA抗原。CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，能够自由进入细胞，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度变会减弱至一半，以此类推。采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

1)、采集血液，制备贴壁单核细胞；

⑤重复步骤④两次，去除上清液；

⑥、用无血清培养液重悬细胞，调节细胞密度为2～3×10⁶/mL，于37℃， 5％体积浓度CO2培养箱中孵育1小时，弃去悬浮细胞，获得贴壁的单核细胞。

2)、贴壁单核细胞的诱导分化

用含1％人血白蛋白的无血清培养液重悬贴壁单核细胞，调整贴壁单核细胞的浓度为1～2×10⁶/mL，加入Ube1L sh-RNA慢病毒，于37℃， 5％体积浓度的 CO2培养箱中孵育2小时后，更换培养基，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测，检测结果见图3和图4。

培养第72h，半量补充新鲜培养液和细胞因子，加入20-50μg/mL OVA蛋白质抗原，孵育2小时后，加入促熟细胞因子组合，poly(IC)(10-20μg/mL)， LPS(5-10μg/mL)，IFN-γ(500-1000IU/mL)，TNF-α(10-20ng/mL)，于 37℃， 5％CO2培养箱中孵育16-24小时。

培养第96h，收集成熟DC细胞，与CFSE标记的OT-I CD8+T细胞按照 1:1～1:5比例进行混合，于37℃，5％CO2培养箱中培养3天，收集细胞，进行流式检测CD8+T细胞增殖情况，见图7所示，由图7的流式细胞仪的检测显示，和未处理的DC细胞相比，shRNA-DC细胞能够有效地促进OVA抗原特异性的OT-I CD8+T细胞增殖，伴随着明显的CFSE的荧光衰减。

抗原特异性CD8+CTL细胞杀伤肿瘤的体内实验

肿瘤局部组织中效应性CD8+CTL细胞的浸润，代表着机体的抗肿瘤免疫和消灭肿瘤细胞的能力，两者之间呈正比关系。DC细胞诱导增殖的CTL细胞中包括初始T细胞(CD62L+CD44-)，具有杀伤能力的效应性T细胞(CD62L-CD44+) 和记忆性T细胞(CD62L+CD44+)。其中效应性CTL细胞是真正直接杀死肿瘤细胞的T细胞。

C57/B16小鼠骨髓来源的DC细胞疫苗制备(未处理DC细胞和sh-RNA DC细胞)同特异性细胞毒性T细胞(CTL)的增殖体外试验。

选取C57/B16小鼠作为实验鼠，腹部皮下接种表达OVA抗原的黑色素瘤细胞， 1×10⁶个细胞/只(第0天)。

在接种肿瘤细胞部位的局部淋巴结附近皮下注射DC细胞疫苗(1×10⁵细胞/ 只)，每三天一次，共3次(第0，3和6天)。

肿瘤细胞接种后的第10天，观察到明显的肿瘤生长。处死小鼠后，测量肿瘤重量(见图8)，流式测定肿瘤组织内(见图9)以及局部淋巴结内的淋巴细胞的浸润情况(见图10)。

由图8可知，应用针对OVA肿瘤抗原的DC疫苗治疗后，与未经任何治疗的对照组相比，肿瘤负荷减少。此外，与未处理的DC细胞治疗组相比，经sh-RNA DC细胞治疗的小鼠，其肿瘤生长的速度明显降低，表现为较小的肿瘤体积和重量。说明sh-RNA DC细胞可诱导更强的抗肿瘤免疫反应。

由图9可知：经过sh-RNA处理的DC细胞可以诱导较多的肿瘤特异性CD8+ CTL在肿瘤组织中的浸润，从而更好地发挥杀伤肿瘤的作用。表现为经sh-RNA DC 细胞治疗后，肿瘤负荷明显降低。

由图10可知：在肿瘤局部淋巴结，sh-RNA DC细胞诱导增殖的CD8+CTL细胞中，以效应性T细胞为主，即较多的CD62L-CD44+CTL细胞，已经具备识别和杀伤肿瘤的能力，因此经sh-RNA DC细胞治疗的小鼠肿瘤负荷小。相反，未处理的DC细胞诱导较多的初始性T细胞，即CD62L+CD44-CTL细胞，其尚未获得识别肿瘤抗原的能力，不能有效的杀伤肿瘤，因此经未处理的DC细胞治疗的小鼠表现为较大的肿瘤负荷。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1)采集血液，制备贴壁单核细胞；

2)贴壁单核细胞的诱导分化

用含1％人血白蛋白的无血清培养液重悬贴壁单核细胞，调整贴壁单核细胞的浓度为1～2×10⁶/mL，加入400～1000PFU /细胞量的Ube1L sh-RNA慢病毒于37℃， 5％体积浓度的CO₂培养箱中孵育2小时后，更换新鲜的1％人血白蛋白的无血清培养液，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃， 5％CO₂培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测；

培养第72h，半量补充新鲜的1％人血白蛋白的无血清培养液和终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，并加入促熟细胞因子组合，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育16～24小时；

2.如权利要求1所述的一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，其特征在于，所述步骤2)中的促熟细胞因子组合的添加量为10～20μg/mL poly(IC)，5～10μg/mL LPS，500～1000IU/mL IFN～γ，10～20ng/mL TNF～α。

3.如权利要求1所述的一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，其特征在于，采集血液，制备贴壁单核细胞的方法为：

1)将新鲜采集的血液收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，摇匀；

2)将血液以等体积生理盐水稀释混匀，按照稀释后的血液与淋巴细胞分离液的体积比为3：2，将稀释后的血液缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，注意保持液层分界清晰；

3)在20℃下900g离心25min，离心结束后，吸取单个核细胞层液体，移入新的离心管中；

4)以5倍于3)中收集到的单个核细胞层液体积的生理盐水稀释单个核细胞层液，在4℃下400g离心5min；

5)重复步骤4)两次，去除上清液；

6)用无血清培养液重悬细胞，调节细胞密度为2～3×10⁶/mL，于37℃， 5％CO₂培养箱中孵育1小时，弃去悬浮细胞，获得贴壁的单核细胞。

4.如权利要求1所述的一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，其特征在于，所述血液为外周血或者脐血。