CN108300692A - 一种制备hpv抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法 - Google Patents

一种制备hpv抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备HPV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法。具体地，本发明公开了HLA‑A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采或静脉采血收集外周血单个核细胞，用CpG ODN 2395增强B细胞的抗原提呈功能，用负载HLA‑A2402限制性HPV抗原肽的B细胞刺激外周血单个核细胞，并用rhIL‑2、rhIL‑7、rhIL‑15、rhIL‑21联合促进T细胞生长。本方法制备的目标CTL具有制备简单、制备周期短、成本低、高增殖能力、高杀伤活性、高细胞活率等特点，可用于HPV感染相关疾病包括宫颈癌的免疫治疗。

Description

一种制备HPV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术开发与应用研究领域，具体涉及人类白细胞抗原-A2402限制性抗HPV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的制备方法。
背景技术
宫颈癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤，是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第三常见的恶性肿瘤。在发展中国家是仅次于乳腺癌居第二位的常见恶性肿瘤，是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)的数据，每年有50万新增宫颈癌病例，25万人因其死亡。发展中国家更是这种疾病的重灾区，每年有20万人因此死亡，占全球死亡人数的80％。大量研究表明，宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)的持续性感染密切相关。目前已经发现和鉴定出200多种HPV亚型，其中30多种与宫颈病变有关。根据其致病能力的大小分为低危型和高危型，而高危型主要导致宫颈癌的发生，以HPV16/18型多见，其编码的E6、E7癌蛋白是宫颈上皮恶性转化中的关键性蛋白。
目前，FDA已经批准3种HPV预防性疫苗上市，即针对HPV16/18型的二价疫苗Cervarix(葛兰素史克生产)、针对HPV16/18/11/6型的四价疫苗Gardasil(默沙东公司生产)和针对HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58型的九价疫苗Gardasil(默沙东公司生产)。继Cervarix(希瑞适)(人乳头状瘤病毒疫苗[16型和18型])获得中国食品药品监督管理总局(CFDA)的上市许可，成为国内首个获批的预防宫颈癌的HPV疫苗之后，2017年5月，四价人乳头瘤病毒疫苗Gardasil(佳达修)获得了CFDA的上市批准，成为正式走进中国市场的第二个预防性HPV疫苗。从目前监测结果来看，HPV疫苗对预防宫颈癌前病变及宫颈癌是安全有效的，但对已经感染HPV和患有宫颈癌的妇女作用是甚微的。
在宫颈癌的病变部位，HPV E6和E7蛋白处于恒定的高表达状态，为宫颈癌免疫治疗特异性靶向抗原提供了选择优势，鉴于此，许多治疗性疫苗策略主要集中于刺激生成和激活能识别表达靶标抗原E6和E7感染细胞的T细胞。目前，宫颈癌治疗性疫苗主要有多肽类疫苗、活载体疫苗(细菌疫苗和病毒疫苗)、DNA疫苗、蛋白质疫苗、核酸类、细胞类等，这些疫苗均能在体内产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)反应，并获得对肿瘤攻击的抵抗能力。
由于CTL表位肽多为短的线性多肽，稳定性差，免疫原性低，在体激发CTL反应能力有限，所以限制了多肽类疫苗的广泛应用；活载体疫苗一般用细菌和病毒作为载体，本身存在安全性隐患，尤其是对免疫力低下的人，另外，中和抗体的产生限制了二次免疫治疗疗效，同时也降低了载体疫苗发挥固有免疫原性的可能；DNA疫苗是将病毒DNA直接编码成抗原，利用宿主的抗原提呈细胞(APC)与T细胞结合，产生细胞核体液免疫反应，无主要组织相容性复合体(MHC)限制性，通过MHC途径激发HPV早期蛋白的细胞免疫，但DNA疫苗的免疫原性较弱，树突状细胞(DC)是APC的免疫反应中最重要的免疫细胞。因此，目前的研究是以DC为载体来增强DNA疫苗的免疫反应，可产生特异性T细胞反应及CTL反应。该疫苗虽然有很多优点，但外源性抗原的持续性表达可能使低水平分泌的免疫原被低水平的抗体消除，若长期处于高表达状态，则可诱导超免疫发生，导致整个机体处于免疫抑制状态，容易受到其它病菌的影响，还有抗DNA抗体产生等。最可怕的潜在问题是致癌基因部分整合到宿主染色体上，有可能使正常的宿主细胞转化成为癌细胞，但是几率较小。蛋白质疫苗避开了肽疫苗与MHC限制性的缺点，可含有所有的抗原表位，且安全性很好，但这类疫苗普遍存在免疫原性比较低。因为是外源性蛋白，蛋白疫苗是要经过MHC II途径递呈来发生抗体反应，而不是诱导T细胞应答反应，因此这类疫苗改造的策略是如何建立起一个MHC I类途径。蛋白质疫苗的改进思路主要是通过加入佐剂和附加物来提高其免疫原性和CD8+T细胞反应。
目前尚无有效的HPV治疗性疫苗问世。对于宫颈癌患者而言，免疫治疗的关键在于诱发有效的HPV特异CTL，从而有效抑制肿瘤的发展并清除已感染或已恶变的上皮细胞。因此构建针对HPV抗原特异性的CTL将是治疗宫颈癌的有效方法。
CTL是一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，成为研究的热点。而研究已经证实CTL是免疫系统控制和清除HPV感染的中心环节，因此直接向患者体内回输体外扩增的功能正常的特异性CTL的过继免疫治疗可以起到清除HPV感染的细胞的作用。
CTL常用的制备方法有肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外扩增法、TCR基因修饰法和体外抗原致敏法，这些方法由于存在取材有限、制备周期长、存在安全隐患、细胞扩增效率低等缺点，限制了其大规模的应用。
因此，亟需开发一种制备简单、制备周期短、成本低、扩增倍数高、杀伤率高的人类白细胞抗原(HLA)-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题建立一种基于血液的制备简单、制备周期短、成本低、扩增倍数高、杀伤率高的HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。
该方法可以实现从少量血液中简便、快速、特异的制备出HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL。首先，该方法利用常规外周血样本进行制备，不受样本取样难、取样不规范或者样本不合格等问题的影响；第二，该方法利用商业化试剂进行制备，不受试剂产地、厂家垄断等影响；第三，该方法可减少标本的采样体积，避免资源的浪费。具有可重复性、可靠、快速、成本低等优点，易于实现产业化。
本发明提供了一种制备抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，其包括：
a)从受试者获得血液，并分离外周血单个核细胞；
b)采用细胞培养基将a)中获得的外周血单个核细胞调整至密度为1×106个/mL至3×106个/mL；
c)向b)中获得的外周血单个核细胞的培养物中加入终浓度为10-50μg/mL的CpGODN，并加入终浓度为10-50μg/mL的抗原或抗原肽，以刺激B细胞与抗原递呈；
d)将c)中获得的经刺激的外周血单个核细胞的培养物加入到培养器皿中，在适合细胞生长的条件下进行培养；
e)在d)中培养2-4天后，向培养器皿中加入无血清培养基，所述无血清培养基中含有重组人白介素2(rhIL-2)、重组人白介素7(rhIL-7)、重组人白介素15(rhIL-15)和重组人白介素21(rhIL-21)，加入培养器皿后，各自的终浓度为：rhIL-2：200-1000IU/mL；rhIL-7：50-100ng/mL；rhIL-15：50-100ng/mL；rhIL-21：50-100ng/mL，并在适合细胞生长的条件下继续培养；
f)继续培养2-4天后，向培养器皿中加入无血清培养基，所述无血清培养基中含有rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21，加入培养器皿后，各自的终浓度为：rhIL-2：200-1000IU/mL；rhIL-7：50-100ng/mL；rhIL-15：50-100ng/mL；rhIL-21：50-100ng/mL，在适合细胞生长的条件下继续培养；
g)重复f)1-10次，获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。
在一个具体的实施方案中，在b)中所述的细胞培养基为含5-20％(v/v)的来自所述受试者经灭活的自体血浆的RPMI-1640培养基。优选地，该细胞培养基含有10％(v/v)的来自所述受试者经灭活的自体血浆，以及90％的RPMI-1640培养基。
在一个具体的实施方案中，在b)中将a)中获得的外周血单个核细胞调整至密度为2×106个/mL。
在一个具体的实施方案中，在c)中加入的CpG ODN选自CpG-B ODN或CpG-C ODN亚型。任选地，所述的CpG-B ODN亚型选自ODN2006或ODN BW006，所述的CpG-C ODN亚型选自CpG ODN2395或ODN M362。优选地，在c)中加入的CpG ODN为CpG ODN2395。
在一个具体的实施方案中，在c)中加入的CpG ODN终浓度为10-50μg/mL，优选15-45μg/mL，优选20-40μg/mL，优选10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL。优选地，CpG ODN为CpG ODN 2395。
在一个具体的实施方案中，在c)中加入的抗原或抗原肽的终浓度为10-50μg/mL，优选15-45μg/mL，优选20-40μg/mL，优选10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL。
在一个可选的实施方案中，在c)中加入的抗原肽可以是任何人类白细胞抗原限制性分型的抗原肽，这种抗原肽可以根据疾病、病原体、以及受试者的人类白细胞抗原限制性分型进行选择。
在一个具体的实施方案中，抗原肽为人乳头瘤病毒的抗原肽。优选地，抗原肽是序列如SEQ ID NO:1所示的抗原肽，肽序列为VYDFAFRDL。
在一个具体的实施方案中，在a)之前还包括检测受试者人类白细胞抗原限制性分型的步骤。
在一个具体的实施方案中，抗原肽序列可以进行改造。具体地，通过在不同位点用D型氨基酸单突变或双突变替换而进行改造。
在一个具体的实施方案中，在e)和f)中向培养器皿中加入无血清培养基，所述无血清培养基中含有rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21。其中，加入培养器皿后，rhIL-2的终浓度为200-1000IU/mL，优选300-900IU/mL，优选400-800IU/mL，优选500-700IU/mL，优选200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL；加入培养器皿后，rhIL-7的终浓度为50-100ng/mL，优选60-90ng/mL，优选70-80ng/mL，优选50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL。加入培养器皿后，rhIL-15的终浓度为50-100ng/mL，优选60-90ng/mL，优选70-80ng/mL，优选50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL。加入培养器皿后，rhIL-21的终浓度为50-100ng/mL，优选60-90ng/mL，优选70-80ng/mL，优选50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL。
在一个具体的实施方案中，所述的无血清培养基为X-VIVO15无血清培养基。
在一个具体的实施方案中，经历10至21天的刺激、培养获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞；优选经历10天、14天、17天、21天；最优选经历14天。
在一个具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人，更优选地，所述受试者是人类白细胞抗原A2402限制性的人。
本发明另一方面提供了一种用于上述的方法中的试剂盒，其包含：用于刺激B细胞与抗原递呈的CpG ODN和抗原或抗原肽，以及用于抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞扩增的rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21。
本发明另一方面提供了一种通过上述的方法获得的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞在制备用于治疗与人乳头瘤病毒相关疾病的药物中的用途。
本发明的有益效果是：本发明采用CpG ODN 2395作为B细胞激活剂，增强B细胞的抗原递呈作用，可以避免使用DC细胞作为抗原递呈细胞进行制备时的制备时间长、DC产量低、成本高等缺点。抗原提呈细胞的活化状态决定了T细胞免疫应答的质量和效率。静息APC导致T细胞免疫耐受和无能，而充分活化的APC则自主地触发高效的T细胞应答。鉴于TLR9结构性地表达在B细胞表面，采用TLR9激动剂CpG ODN活化B细胞研究其APC的潜能已成为该领域的热点。CpG ODN可以有效地诱导抗原刺激的初始B细胞增殖并延长其存活时间，并促进B细胞共刺激分子CD80、CD86及MHC I、II类分子的表达，提示CpG具有增强初始B细胞抗原提呈的能力。γ链细胞因子在始动、维持及调节免疫稳态和炎症反应中发挥重要作用。γ链细胞因子具有多重功能，如在健康及疾病中作为调节和效应分子发挥作用，因此，该家族因子、受体及其信号转导通路可成为治疗性干预的潜在靶点。IL-2、IL-7、IL-15、IL-21共用细胞因子受体亚单位γ链(γc)，对于调控淋巴细胞稳态起重要作用，可刺激T细胞增殖、诱导细胞毒性T细胞产生，促进B细胞增殖和免疫球蛋白合成，诱导NK细胞生成及存活，促进CD8+记忆性T细胞增殖与生存。因此成为升高T细胞水平和功能，增强CTL应答等重要的细胞因子。
本发明的一种快速制备HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL的方法，经测定其培养的细胞制备周期短(约14天)，增殖能力高(18倍)，杀伤活性高(72.4％)，细胞活率高(97％)；在其平行试验中，CTL细胞在细胞比例、杀瘤性、增值率指标上比较稳定，所以此发明方法不仅可以用在科学研究而且能够满足临床需求，是目前为止CTL细胞体外培养最优方法。
本发明的一种快速制备HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL的方法，操作简单、方便，适合外周血、单采血等多种标本，也适合EBV、CMV等病毒，在CTL细胞制备领域可以得到广泛的应用。
附图说明
图1为经HLA-A2402抗原负载后，用流式检测方法检测目标CTL中CD8+/IFNγ+细胞比例；
图2为制备的HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL在不同效靶比例时杀伤Caski细胞的能力；
图3为制备的HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL在不同培养时间细胞的增殖能力；
图4为制备的HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL在不同培养时间细胞培养上清中IFNγ的分泌情况。
具体实施方式
下面以实施例方式进一步描述本发明，但无论如何下面的实施例旨在是举例说明性质的，不能对本发明所要求保护的范围构成限制。因为本领域技术人员众所周知，除了下面所列实施例之外，可以对实施例所述实施方案进行个别改变亦能实现本发明的目的，因此这些改变也处于本发明所要求保护的范围内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：HLA-A2402限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备
(1)HLA-A2402+分型检测：采集被检者血液2mL(EDTA抗凝)，外送检测HLA分型(北京博奥晶典生物技术有限公司)。
(2)抗原肽合成：HPV16E6抗原肽，位点为49-57，序列为VYDFAFRDL的9肽(SEQ IDNO:1，以下简称为HPV16E649-57肽)，化学合成(上海吉尔生化有限公司)，以无菌双蒸水充分溶解，多肽浓度为2mg/ml，分装保存于-80℃。
(3)外周血采集及外周血单个核细胞(PBMC)分离：用肝素抗凝的真空采血管采集外周静脉血50mL，经Ficoll密度梯度离心法后获得PBMC：
a.将采集的血样转至50mL离心管(康宁，货号430828)，室温下用Thermo X3FR离心机调至3000rpm转速，离心分离10min；
b.吸取上层血浆于培养时备用；按0.9％生理盐水：剩余血液＝1：1的比例稀释血液，取2支50mL离心管中分别加入15mL淋巴细胞分离液(GE，货号17-1440-03)，缓慢的按稀释血：淋巴细胞分离液＝2:1加在淋巴细胞分离液之上；
c.将加好稀释血的离心管进行密度梯度离心，室温下将Thermo X3FR离心机调至2000rpm升1降1，离心20min，离心后分层由上至下分为四层，分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层；
d.吸取上层血浆至50ml离心管中，56℃水浴灭活10min，离心取上清留用；
e.离心完毕后吸取淋巴细胞层的单个核细胞，用大于单个核细胞10倍体积的0.9％生理盐水充分混匀、洗涤，1200rpm离心10min，弃上清，重复三次后，进行细胞计数。用细胞培养基(90％(v/v)RPMI-1640培养基(Gibco，货号22400-089)加10％(v/v)分离PBMC时获得的已灭活自体血浆获得)将细胞稀释为2×106个/mL，加入到50mL离心管中待用。
(4)B细胞刺激与抗原递呈：向淋巴细胞离心管中加入CpG ODN2395(InvivoGen，货号tlrl-2395-1)至终浓度为10-50μg/mL(在本实施例中采用20μg/mL)，加入HPV16E649-57肽至终浓度为10-50μg/mL(在本实施例中采用20μg/mL)，刺激B细胞，发挥抗原递呈作用，加入CpG ODN和肽之后直接转袋，记为第0天。
(5)转袋：将上述离心管中细胞通过60mL注射器(BD，货号309654)转移至细胞培养袋中(Takara，型号：Cultilife215)，细胞培养箱中培养(37℃；5％CO2)，一般每个培养袋中具有细胞培养物15-35mL。
(6)CTL培养与扩增：培养至第三天时，在培养体系中加入含rhIL-2(ProSpec，CYT-209)、rhIL-7(ProSpec，CYT-254)、rhIL-15(ProSpec，CYT-230)、rhIL-21(ProSpec，CYT-408)的X-VIVO15无血清培养基(LONZA，货号04-418Q)，以联合促进T细胞生长。加入的X-VIVO15无血清培养基体积与步骤(5)中接种的培养物的体积相同。在所获得的整体培养体系中，rhIL-2终浓度为200-1000IU/mL(在本实施例中采用500IU/mL)；rhIL-7终浓度为50-100ng/mL(在本实施例中采用75ng/mL)；rhIL-15终浓度为50-100ng/mL(在本实施例中采用75ng/mL)；rhIL-21终浓度为50-100ng/mL(在本实施例中采用75ng/mL)。之后继续在细胞培养箱中培养细胞，观察细胞生长状态，如果细胞增殖情况较好，培养液变黄，则每3天补一次与第三天时加入的相同体积的无血清培养基，并按补入无血清培养基后，培养物的整体体积补入终浓度为200-1000IU/mL的rhIL-2，终浓度为50-100ng/mL的rhIL-7，终浓度为50-100ng/mL的rhIL-15以及终浓度为50-100ng/mL的rhIL-21，以维持rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21在整体培养体系中的浓度，直至第21天收获全部细胞。
(7)在不同培养时间，显微镜下观察细胞生长状态，收集细胞进行细胞计数、细胞活率分析、流式检测及杀伤能力检测，收集细胞培养上清进行IFNγ分泌检测。
实施例2：流式细胞仪检测细胞扩增后CD8+/IFNγ+细胞比例
(1)取实施例1中培养第14天所获得的细胞样本，1×106细胞/管，PBS洗涤2次。
(2)加入抗原肽(HPV16E649-57肽，上海吉尔生化有限公司)及蛋白转运抑制剂Golgi-stop(BD，货号554715)刺激激活细胞，细胞培养箱内孵育3h。
(3)加入流式检测抗体进行流式表型检测：人CD8-APC抗体(BD，货号555369)，室温下避光孵育30min，PBS洗涤2次。
(4)加入固定破膜液(BD，货号554715)，室温下避光孵育30min，PBS洗涤2次。
(5)加入流式检测抗体进行胞内因子流式检测：人IFNγ-PE抗体(BD，货号559327)，室温下避光孵育30min，PBS洗涤2次。
(6)细胞通过流式细胞仪(BD AccuriTMC6)进行分析。
结果如图1所示，经过14天的诱导培养，CD8+/IFNγ+细胞与对照组(未加肽)相比升高约10％(图1中的Q1-UR区)。
实施例3：乳酸脱氢酶(LDH)法细胞杀伤活性检测
取对数生长期的Caski细胞株(购于中国食品药品检定研究院)作为靶细胞，并调整细胞密度为3×104个/mL，每孔取100μL铺于96孔培养板中。取本发明实施例1中获得的第14天的CTL细胞调整密度为3×104个/mL、3×105个/mL、6×105个/mL、1.2×106个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL，使效靶比分别为1:1、10:1、20:1、40:1，每组设三个复孔。
(1)分析板设置
a.效应细胞自发LDH释放：不同效靶比，取相应数量效应细胞加至反应板；
b.实验孔：不同效靶比细胞混合；
c.靶细胞最大LDH释放孔；
d.靶细胞自发LDH释放孔；
e.容积纠正控制：若使用细胞裂解液裂解细胞，需设置容积纠正控制，以无细胞的100μl培养液加入10μl裂解液组成。
f.培养液背景；
加样完成后，离心250g离心4min以保证效靶细胞充分接触。
(2)细胞培养和上清获取
置反应板于培养箱中4小时。在获取上清前45分钟，加10μl裂解液至最大释放孔中。裂解完成后，250g离心4min。
(3)LDH测定
a.转上清50μl至酶联板；
b.配制底物混合液；
c.每孔加50μl重组底物混合液，避光，室温孵育30min；
d.每孔加入50μl终止液；
e.吸管去除大气泡，1小时内490nm处读数。
(4)计算
a.实验孔、效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔均吸光度均减去培养液背景吸光度；
b.靶细胞最大释放孔减去容积控制孔吸光度；
c.计算细胞杀伤率：
结果如图2所示，本发明制备的CTL细胞对人宫颈癌Caski细胞株具有较高的杀伤活性，在1:1、10:1、20:1、40:1的效靶比下杀伤率即可达到13.7％、34.3％、45.2％和72.4％。
实施例4：细胞扩增后细胞量、扩增倍数及活率
(1)总细胞扩增倍数：将上述实施例1中扩增第0、2、7、10、14、17、21天获得的细胞，用台盼蓝染色后再用血细胞计数器进行计数，将当前的总细胞数除以培养前的单个核细胞总数，数值即为细胞的扩增倍数。
(2)细胞活率(％)＝未染色的细胞数/观察的细胞总数×100。
结果参见表1和图3，镜下观察可见培养之初细胞折光度好，状态佳，散在，培养一定天数后可见细胞数量增加，细胞聚集。从图3可以看出，培养至第2天时细胞数量没有明显变化，从第7天开始细胞数量显著增加。
表1：扩增前后细胞数量、扩增倍数、活率对照表
实施例5：ELISA法检测细胞培养上清中IFNγ的分泌
(1)取实施例1中收集的不同培养时间的细胞上清，室温融化，取出检测试剂盒(达科为，货号DKW12-1000-096)，使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。
(2)根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白都应做复孔。
(3)加样：100μL/孔加入稀释后的“Cytokine standard”至标准品孔，100μL/孔加入样品至样品孔，100μL/孔加稀释缓冲液R(1×)入空白对照孔。
(4)加检测抗体：50μL/孔加入稀释后的生物素化抗体。混匀后盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育2小时。
(5)洗板：扣去孔内液体，300μL/孔，加入1×洗涤缓冲液；停留1分钟后弃去孔内液体。重复3次，每一次在滤纸上扣干。
(6)加酶：100μL/孔加入链霉亲和素-HRP。盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育20分钟。
(7)洗板：重复步骤5。
(8)显色：100μL/孔加入TMB，室温(18-25℃)避光孵育5-30分钟之间，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。
(9)终止反应：迅速100μL/孔加入终止缓冲液终止反应。
(10)读板：终止后10分钟内，用双波长即检测波长450nm、参考波长或校正波长610-630nm同时读板。
结果如图4所示，本发明制备的CTL在扩增第0、2、7、10、14、17、21天收集细胞培养上清，检测IFNγ的分泌，随着培养时间的增加，IFNγ分泌量呈增加趋势，培养第14天分泌量达到峰值，之后分泌量下降。
序列表
<110> 吉林省拓华生物科技有限公司
<120> 一种制备HPV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法
<130> 380001CG
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)
<400> 1
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5

Claims (10)

1.一种制备抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，其包括：
a)从受试者获得血液，并分离外周血单个核细胞；
b)采用细胞培养基将a)中获得的外周血单个核细胞调整至密度为1×106个/mL至3×106个/mL；
c)向b)中获得的外周血单个核细胞的培养物中加入终浓度为10-50μg/mL的CpG ODN，并加入终浓度为10-50μg/mL的抗原或抗原肽，以刺激B细胞与抗原递呈；
d)将c)中获得的经刺激的外周血单个核细胞的培养物加入到培养器皿中，在适合细胞生长的条件下进行培养；
e)在d)中培养2-4天后，向培养器皿中加入无血清培养基，所述无血清培养基中含有rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21，加入培养器皿后，各自的终浓度为：rhIL-2：200-1000IU/mL；rhIL-7：50-100ng/mL；rhIL-15：50-100ng/mL；rhIL-21：50-100ng/mL，并在适合细胞生长的条件下继续培养；
f)继续培养2-4天后，向培养器皿中加入无血清培养基，所述无血清培养基中含有rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21，加入培养器皿后，各自的终浓度为：rhIL-2：200-1000IU/mL；rhIL-7：50-100ng/mL；rhIL-15：50-100ng/mL；rhIL-21：50-100ng/mL，在适合细胞生长的条件下继续培养；
g)重复f)1-10次，获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在b)中所述的细胞培养基为含5-20％(v/v)的来自所述受试者的经灭活的自体血浆的RPMI-1640培养基；
任选地，在b)中将a)中获得的外周血单个核细胞调整至密度为2×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在c)中加入的CpG ODN选自CpG-B ODN或CpG-CODN亚型；
任选地，所述的CpG-B ODN亚型选自ODN2006或ODN BW006，所述的CpG-C ODN亚型选自CpG ODN 2395或ODN M362；
优选地，在c)中加入的CpG ODN为CpG ODN 2395。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在c)中加入的CpG ODN终浓度为20μg/mL，加入的抗原或抗原肽的终浓度为20μg/mL；
优选地，抗原肽为来自人乳头瘤病毒的抗原肽；
优选地，抗原肽为序列如SEQ ID NO:1所示的抗原肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在e)和f)中向培养器皿中加入无血清培养基，所述无血清培养基中含有rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21，加入培养器皿后，各自的终浓度为：rhIL-2：500IU/mL；rhIL-7：75ng/mL；rhIL-15：75ng/mL；rhIL-21：75ng/mL；
任选地，所述的无血清培养基为X-VIVO15无血清培养基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，经历10至21天的刺激、培养获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞；
优选地，经历14天刺激、培养。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在a)之前还包括检测受试者人类白细胞抗原限制性分型的步骤。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物；优选是人；更优选为人类白细胞抗原A2402限制性的人。
9.一种用于权利要求1-8中任一项所述的方法中的试剂盒，其包含：用于刺激B细胞与抗原递呈的CpG ODN和抗原或抗原肽，以及用于抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞扩增的rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15和rhIL-21。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法获得的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞在制备用于治疗与人乳头瘤病毒相关疾病的药物中的用途。
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