CN105543170A - 一种可刺激t细胞扩增的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可刺激T细胞扩增的组合物，组合物的活性因子由Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体、IL-2、IL-7和IL-21共5种细胞因子组成。通过HIV-1特异性多肽组合+多重细胞因子组合可有效连续刺激对HIV-1感染者抗原特异性记忆性T细胞（TSCM和TCM）细胞在体外扩增，同时提高了扩增后CD8+记忆性T细胞，尤其是CD8+？TSCM的比例。可以延长过继免疫治疗回输细胞的半衰期，从而延长了其发挥免疫监控的时效，更具有长期控制HIV-1潜伏感染的潜力。该方法具有操作简单、取材容易等优点，为抗感染过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种可刺激T细胞扩增的组合物，及使用该组合物对CD8+T细胞进行扩增的培养方法。
背景技术
艾滋病是目前威胁人类生命安全的重要疾病，而人类免疫缺陷病毒是艾滋病主要致病因素。现阶段对艾滋病的重要治疗手段是通过鸡尾酒疗法，患者长期服用药物达到控制病毒和病程的目的。但是鸡尾酒疗法无法完全清除病毒，由于HIV-1的潜伏感染，一旦停止服药，病毒会迅速反弹。另一方面HIV-1通过高频突变，会逐渐产生耐药性。并且长期服药，对患者自身也是沉重负担。
研究显示，HIV抗原特异性的CD8+T细胞对病毒储存库的控制与清除，发挥了非常重要作用；并且经过多年探索，现已发现若干针对HIV-1抗原的CD8+T细胞克隆，杀伤病毒感染细胞的能力尤其突出。所以将艾滋病患者体内HIV-1抗原特异性的CD8+T细胞分离，经过体外扩增后，再回输患者体内进行过继性免疫治疗可作为功能性治愈艾滋病的候选方案之一，但是现行方案还有诸多问题有待解决，需要进一步优化完善。
一方面，所有的病毒和细菌都感染都会携带关键蛋白质抗原表位，免疫系统会将完整的这些表位为“外源物质”，由此触动免疫攻击。最近研究显示，如果艾滋病患者启动抗病毒治疗较晚，感染后不久HIV可快速改变这些“标记”区域，所以患者体内携带着的病毒储藏库几乎完全是由携带逃逸突变的HIV-1所构成，此时病毒蛋白的一些关键部分发生的氨基酸转变使得它们变得难以被免疫系统识别。
2015年，来自RobertF.Siliciano团队的邓凯博士通过深度测序，发现若干CD8+T细胞识别的抗原表位，其对应HIV-1感染细胞未发生逃逸突变。并且首次从患者处分离出了杀伤性T细胞，将它发生们与未突变HIV-1抗原多肽混合培养，发现用非突变HIV-1多肽混合物预处理的CD8+T细胞启动了对患者HIV-1感染细胞的强烈反应，具有高达68％的杀伤率。
另一方面，CD8+效应T细胞(EffectTcell,Teff)的寿命较短，无法在体内维持长时间的免疫应答。因此，寿命较长的CD8+记忆T细胞(MemoryTcell)正在成为过继性免疫治疗中的主要细胞，得到越来越多的重视与应用。近年来，干细胞样记忆T淋巴细胞(Tstemcellmemorycells,TSCM)陆续在小鼠、猕猴等模式生物及人体中被发现。这群细胞处于记忆细胞的分化上游，经诱导能分化成记忆细胞，同时具有较强的自我更新及抗肿瘤能力。因此，TSCM被认为是过继性免疫治疗的重要细胞来源。目前，体外扩增CD8+记忆T细胞的方法主要包括：用Anti-CD3抗体和Anti-CD28抗体体外非特异扩增CD8+T细胞；用抗原提呈细胞体外激活抗原特异性CD8+T细胞。用IL-2、IL-7和IL-15扩增CD8+记忆T细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供可刺激T细胞扩增的组合物，及使用该组合物对CD8+T细胞进行扩增的培养方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种可刺激CD8+T细胞体外扩增的组合物，其活性因子由Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体、IL-2、IL-7和IL-21共5种细胞因子组成。优选的，各因子的使用终浓度分别为：Anti-CD3抗体终浓度0.8～1.2μg/mL、Anti-CD28抗体终浓度0.8～1.2μg/mL、IL-2终浓度8～12ng/mL、IL-7终浓度8～12ng/mL、IL-21终浓度18～22ng/mL。更佳的，各因子的使用终浓度分别为：Anti-CD3抗体终浓度1μg/mL、Anti-CD28抗体终浓度1μg/mL、IL-2终浓度10ng/mL、IL-7终浓度10ng/mL、IL-21终浓度20ng/mL。
特别的，该组合物为CD8+T细胞培养基，或者是培养基添加剂。
一种体外扩增CD8+T细胞的方法，包括如下步骤：
收集HIV-1感染患者的外周血单个核细胞PBMC经刺激产生的CD8+T细胞；
将收集的CD8+T细胞悬浮培养于培养基中，待细胞广泛激活后加入活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2，继续培养至少24h后，继续加入IL-2、IL-7和IL-21中的至少一种细胞因子，继续培养，扩增CD8+T细胞。
作为上述方法的进一步改进，使用IL-2和HIV-1抗原多肽组合来刺激PBMC产生CD8+T细胞。
更进一步的，上述方法中使用的HIV-1抗原多肽组合为已突变或未突变HIV-1抗原多肽组合，其中，已突变HIV-1抗原多肽组合为：SL9:SLYNTVATL、IL9:ILKEPVHGV、RY9:RYLRDQQLL、TW10:TSTLQEQIGW和LY9:LYNTVATLY；未突变HIV-1抗原多肽组合为：WF9:WASRELERF、TV9:TLNAWVKVV、TL9:TPQDLNTML、EW10:ETINEEAAEW、GL9:GPGHKARVL和KF11:KAFSPEVIPMF。
更进一步的，将收集的CD8+T细胞悬浮培养于培养基中7d后，活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2。
更进一步的，加入活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2后继续培养48h后，加入IL-2、IL-7和IL-21继续培养，扩增CD8+T细胞。
更进一步的，Anti-CD3抗体添加的终浓度为1μg/mL、Anti-CD28抗体添加的终浓度为1μg/mL、IL-2添加的终浓度为10ng/mL、IL-7添加的终浓度为10ng/mL、IL-21添加的终浓度为20ng/mL。
本发明的有益效果是：
本发明方法可以有效提高抗原特异性CD8+记忆T细胞的数量和比例，IL-2+IL-7+IL-21细胞因子组合不仅提高了CD8+T细胞的扩增倍数，而且同时提高了扩增后CD8+记忆性T细胞，尤其是CD8+TSCM的比例。可以延长过继免疫治疗回输细胞的半衰期，从而延长了其发挥免疫监控的时效，更具有长期控制HIV-1潜伏感染的潜力。
本发明通过两轮刺激，兼顾了抗原特异性CD8+T细胞的扩增和记忆性CD8+T细胞。
本发明使用的HIV-1抗原多肽组合，无论是急性期感染患者还是慢性期感染患者都未发生逃逸突变，所以相比已突变的多肽，这些多肽组合刺激的CD8+T更具有杀伤病毒感染细胞的潜力。
本发明使用的是多种HIV-1抗原多肽组合，相比单一多肽刺激，会有多种CD8+T细胞克隆被激活，可以更广泛地发挥杀伤病毒感染细胞的作用。
本发明使用多种HIV-1抗原多肽组合，更具有广谱性，可以有效防止HIV-1通过高频突变逃逸免疫识别，从而对HIV-1更有效地进行免疫监控。
本发明使用的IL-2+IL-7+IL-21细胞因子组合，相比单独施加IL-2和IL-2+IL-7组合的传统扩增方法，可以进一步提高HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增倍数。
附图说明
图1：扩增HIV-1抗原特异性的CD8+记忆T细胞扩增流程。
图2：HIV-1感染患者的PBMC经过抗原肽组合刺激后，HIV-1抗原特异性CD8+T细胞比例增加。
图3：HIV-1感的染患者PBMC经过抗原肽组合刺激后，HIV-1抗原特异性CD8+T细胞干扰素γ分泌增加。
图4：经过磁珠富集，细胞因子组合可以大量扩增HIV-1感染患者CD8+T细胞
图5：经过细胞因子组合刺激扩增后，HIV-1感染患者CD8+TSCM细胞的比例增加。
图6：经过细胞因子组合刺激扩增后，HIV-1感染患者CD8+TCM细胞的比例增加。
图7：经过细胞因子组合刺激扩增后，HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞比例得以维持。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。HIV-1感染患者的外周血由广州市第八人民医院提供。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
对HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞特异性激活和扩增
在过去的几十年中，HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞结构和功能已经有很详细的研究。本发明的扩增HIV-1抗原特异性的CD8+记忆T细胞扩增流程如图1所示。
从HIV-1感染患者外周血中分离外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)(用PBS将10mL患者外周血稀释到25mL，混匀，逐滴小心地加入25mL人淋巴细胞分离液之上；于20℃，以1500rpm/min离心30min；小心吸出PBMC，加入3-5倍体积的PBS溶液；于20℃，以300g离心15min；弃上清液，再向离心管中加入15mLPBS溶液，重悬混匀；于20℃，以300g离心5min；弃上清液，用1640培养液定容至1mL；用细胞计数器进行细胞计数。
将分选出来的外周血单个核细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，均匀铺于12孔板中，每孔细胞数为2×106。
利用HIV-1抗原特异性多肽刺激混合物和IL-2扩增HIV-1抗原特异性CD8+T细胞。实验对铺板后的PBMC进行4种不同的处理，每种处理设置三个复孔作为平行对照，并在细胞培养的第1天施加相应刺激，其中PHA作为阳性对照的刺激物。已突变HIV-1抗原多肽组合的序列共五条混合：SL9+IL9+RY9+TW10+LY9；未突变HIV-1抗原多肽组合的序列共六条混合：WF9+TV9+TL9+EW10+GL9+KF11。两种多肽组合的工作浓度均为1μg/mL。IL-2的工作浓度均为10ng/mL，直接加入培养液中。各组具体的处理如下：
| 分组 | 处理 |
| 第一组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐23 --> |
| 第二组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐2+1μg/mL(终浓度)已突变HIV‐1抗原多肽组合 |
| 第三组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐2+1μg/mL(终浓度)未突变HIV‐1抗原多肽组合 |
| 第四组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐2+1μg/mL(终浓度)PHA |
抗原多肽的序列具体如下：
将细胞培养板置于5％CO2、饱和湿度及37℃的细胞培养箱中进行培养，7天后进行检测和下一步操作。
HIV-1抗原特异性CD8+T细胞比例检测和功能性检测
不同刺激组合刺激7天后的PBMC，在细胞培养的7天，对每组细胞进行取样，利用以下流式抗体：抗人CD8抗体-V450，抗人CD25抗体-APC-Cy7，对细胞进行染色，检测对HIV-1特异性多肽组合反应的CD8+T细胞比例。
同时，对每组细胞进行取样，利用PBS洗去刺激物，然后将细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，不再继续施加细胞因子，以便让PBMC中激活的细胞重新静息。
培养5-7天后，对RPMI1640培养基悬浮细胞计数，离心弃上清，无血清RPMI1640培养基重新悬浮细胞，终浓度为1×106/mL。然后将细胞加入预包被干扰素γ抗体的96孔PVDF实验板中，体积为100μL/孔，细胞在孔中的分布要尽量均匀。细胞浓度为1×105/孔。按照与此前的预刺激方案，每组细胞加入对应的相同刺激物。其中，负对照孔100μL无血清培养基为背景，正对照每孔加入10μL的PHA，终浓度为1μg/mL，实验组分别加入HIV-1抗原多肽组合刺激物(用RPMI1640配制成10×终浓度，10μL/孔)到实验孔。当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37℃，5％CO2培养箱培养16-24小时。
根据常规的技术，培养16-24小时后，对PBMC细胞进行干扰素γ酶联免疫斑点检测实验。
各组具体的处理如下：
| 分组 | 处理4 --> |
| 第一组 | 无刺激物 |
| 第二组 | 1μg/mL(终浓度)已突变HIV‐1抗原多肽组合 |
| 第三组 | 1μg/mL(终浓度)未突变HIV‐1抗原多肽组合 |
| 第四组 | 1μg/mL(终浓度)PHA |
结果显示：和已突变多肽刺激效果类似，HIV-1感染患者的PBMC经过未突变抗原肽组合刺激后，同样使CD25阳性细胞的比例有同等程度的增加，同时酶联免疫斑点实验显示干扰素γ分泌细胞增加(图3)，即反应了HIV-1抗原特异性CD8+T细胞比例增加(图2)。
HIV-1感染患者CD8+T细胞的扩增
对HIV-1抗原多肽组合和IL-2刺激7天PBMC，根据常规的技术，进行CD8+T细胞富集分选：孵育CD8+T细胞生物素阴选一抗，20分钟；10倍体积的PBS(含0.5％BSA、2％EDTA)稀释，混合均匀后，300g10分钟；孵育欧联亲和素的磁珠，30分钟；进行细胞富集，得到CD8+T细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计数细胞后调整细胞至所需浓度。
将分选得到的患者CD8+T细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，细胞密度为每毫升1-2×106细胞，在细胞培养的第7天广泛激活细胞：加入Anti-CD3抗体(1μg/mL)、Anti-CD28抗体(1μg/mL)、IL-2(10ng/mL)。培养的第10天，即细胞广泛激活48小时候后，对铺板后的CD8+T细胞进行3种不同的处理，第一种为IL-2，第二种为IL-2和IL-7组合，第三种为IL-2、IL-7和IL-21组合。
在细胞培养的第12天、第14天、第17天、第19天，根据细胞扩增数量，添加新鲜的培养基，扩大培养体系，维持与之前相同的细胞密度，并施加与第10天相同工作浓度的细胞因子组合，以维持细胞状态，继续扩增细胞，同时使细胞向记忆细胞方向分化。
各组具体的处理如下：
| 分组 | 处理 |
| 第一组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐2 |
| 第二组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐2+10ng/mL(终浓度)IL‐7 |
| 第三组 | 10ng/mL(终浓度)IL‐2+10ng/mL(终浓度)IL‐7+20ng/mL(终浓度)IL‐21 |
细胞培养第21天，对每组细胞进行细胞计数，用以下公式计算扩增效率。
结果显示：相比单独施加IL-2和IL-2+IL-7组合，IL-2+IL-7+IL-21细胞因子组合可以进一步提高HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增倍数(图4)。
检测HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增后记忆性细胞的比例
在细胞培养的21天，利用以下流式抗体：抗人CD8抗体-V450、抗人CD45RA抗体-ECD、抗人CD45RO抗体-PerCp-Cy5.5、抗人CCR7抗体-AlexaFluor700、抗人CD62L抗体-PE-Cy7、抗人CD122抗体-PE、抗人CD95抗体-APC；对扩增后的CD8+T细胞进行标记，检测CD8+TCM细胞和CD8+TSCM细胞的比例。
结果显示：相比单独施加IL-2和IL-2+IL-7组合，IL-2+IL-7+IL-21细胞因子组合不仅可以进一步提高HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增倍数，而且使CD8+TCM和CD8+TSCM细胞的比例增加(图5和6)。
检测HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增后抗原特异性的细胞的比例
在细胞培养的21天，利用加载了HIV-1gag蛋白的抗原的四聚体：SL9(SLYNTVATL)或TV9(TLNAWVLVV)，检测HIV-1抗原特异性的CD8+T细胞的比例。其中，在慢性感染病人中，SL9已经发生逃逸突变，而TV9未发生逃逸突变。
结果显示：经过细胞因子组合刺激扩增后，两种HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞比例均得以维持(图7)。
Claims (10)
1.一种可刺激CD8+T细胞体外扩增的组合物，其活性因子由Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体、IL-2、IL-7和IL-21共5种细胞因子组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：各因子的使用终浓度分别为：Anti-CD3抗体终浓度0.8～1.2μg/mL、Anti-CD28抗体终浓度0.8～1.2μg/mL、IL-2终浓度8～12ng/mL、IL-7终浓度8～12ng/mL、IL-21终浓度18～22ng/mL。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：各因子的使用终浓度分别为：Anti-CD3抗体终浓度1μg/mL、Anti-CD28抗体终浓度1μg/mL、IL-2终浓度10ng/mL、IL-7终浓度10ng/mL、IL-21终浓度20ng/mL。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的组合物，其特征在于：该组合物为CD8+T细胞培养基。
5.一种体外扩增CD8+T细胞的方法，包括如下步骤：
1)收集HIV-1感染患者的外周血单个核细胞PBMC经刺激产生的CD8+T细胞；
2)将收集的CD8+T细胞悬浮培养于培养基中，待细胞广泛激活后加入活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2，继续培养至少24h后，继续加入IL-2、IL-7和IL-21中的至少一种细胞因子，继续培养，扩增CD8+T细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：使用IL-2和HIV-1抗原多肽组合来刺激PBMC产生CD8+T细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：HIV-1抗原多肽组合为已突变或未突变HIV-1抗原多肽组合，其中，已突变HIV-1抗原多肽组合为：SL9:SLYNTVATL、IL9:ILKEPVHGV、RY9:RYLRDQQLL、TW10:TSTLQEQIGW和LY9:LYNTVATLY；未突变HIV-1抗原多肽组合为：WF9:WASRELERF、TV9:TLNAWVKVV、TL9:TPQDLNTML、EW10:ETINEEAAEW、GL9:GPGHKARVL和KF11:KAFSPEVIPMF。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将收集的CD8+T细胞悬浮培养于培养基中7d后，活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2。
9.根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于：加入活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2后继续培养48h后，加入IL-2、IL-7和IL-21继续培养，扩增CD8+T细胞。
10.根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于：Anti-CD3抗体添加的终浓度为1μg/mL、Anti-CD28抗体添加的终浓度为1μg/mL、IL-2添加的终浓度为10ng/mL、IL-7添加的终浓度为10ng/mL、IL-21添加的终浓度为20ng/mL。
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