CN101519646A

CN101519646A - 一种cik细胞及其制备方法和细胞制剂

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Publication number: CN101519646A
Application number: CN200910045790A
Authority: CN
Inventors: 徐鸣
Original assignee: SHANGHAI DEJIA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI DEJIA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2009-09-02
Anticipated expiration: 2029-02-06
Also published as: CN101519646B

Abstract

本发明公开一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂。该制备CIK细胞的方法，包括以下步骤：将分离好的单个核细胞置于含有植物血凝素的培养液中，培养24～72小时后，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28单抗的培养瓶中，同时加入含IL－1α和IL－2的培养液，继续培养5～15天，其中每隔2～3天分瓶培养一次。该方法制备出的CIK细胞具有细胞增殖明显提高，CD8细胞比例较大增加，抗瘤谱广，杀瘤活性增强等特点。对手术后的肿瘤患者可有效预防转移复发；与放化疗联合应用可降低前者的毒副作用，增强患者耐受性，提高疗效；对晚期患者可明显延长生命周期，提高生活质量。

Description

一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂

技术领域

本发明属于体外细胞培养领域，特别涉及一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂。

背景技术

肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式，CIK细胞(Cytokine induced killer cell，CIK)治疗是目前国际上公认的最有效的肿瘤生物治疗手段。

CIK细胞是在体外条件下，将人外周血单个核细胞用多种细胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于其主要效应细胞表面既有T细胞的表面标志(TCR-α/β，CD3)，也有NK细胞的表面标志(CD56)，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC(主要组织相容性复合体)限制性杀瘤优点。CIK细胞中的主要效应细胞CD3 CD56细胞在正常人外周血中极为罕见，仅1％～5％，在体外经多因子培养28～30天，CD3 CD56细胞迅速增多，较培养前升幅达1000倍以上。将CIK细胞注入患者体内来治疗肿瘤，可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下，直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的免疫功能，最大可能地恢复细胞正常的生长调节，为彻底地进行肿瘤治疗提供了新的途径。CIK细胞治疗法是由美国斯坦福大学骨髓移植于1991年建立(Schmidt-WolfIGH，et al.J.Exp.Med.1991；174：139-149)。目前该方法在国内外肿瘤治疗中已得到广泛应用。与过去过继免疫治疗所使用过的淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer，LAK)和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)相比，CIK具有更强的细胞增殖能力和更强的抗肿瘤细胞作用，且毒副作用很小。

CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注细胞的数量和杀伤活性。因为CIK细胞为一种以T淋巴细胞为主的异质细胞群，其中对肿瘤有杀伤作用的主要是靠CD3+CD56+和CD8+这两种细胞，因此，提高CD3+CD56+和CD8+的比例以及提高体外培养CIK细胞的数量对提高肿瘤治疗效果非常重要。目前传统的方法是将分离得到的患者外周血单个核细胞，用干扰素-γ刺激24h，随后再用CD3单抗、IL-1α、IL-2等刺激因子进行诱导。这些方法的CIK细胞的增殖力较低，CIK细胞中的CD3+CD56+细胞、CD8+细胞的比例不高，对肿瘤的治疗效果有待进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的方法所得CIK细胞存在增殖力较低，CD3+CD56+细胞、CD8+细胞的比例不高的不足，提供一种新的制备方法以及所制得CIK细胞，该CIK细胞的增殖力较强，CD3+CD56+和CD8+细胞的比例较高，具有更佳的治疗肿瘤的效果。

本发明人经过广泛的研究和反复试验发现：1)CIK细胞制备中，干扰素-γ刺激外周血单个核细胞(PBMC)后很多细胞会发生凋亡，也就是说干扰素-γ刺激是造成这些细胞调亡的重要原因，这直接影响了细胞数量的扩增，而植物血凝素(PHA)对PBMC的诱导效果和干扰素-γ相同，干扰素-γ可以完全由PHA代替用于制备CIK细胞；2)抗CD3单抗与抗CD28单抗联合共同诱导CIK细胞，比抗CD3单抗一种单抗诱导的CIK细胞具有更高的增殖力；3)将抗CD3单抗与抗CD28单抗包被在培养瓶壁上，比游离状态的效果更好，所需的单抗总量降低，而又增加了CIK细胞的增殖力。因此，本发明人从以上三方面对现有的CIK细胞制备方法进行改进，终于令人惊喜的获得了增殖力强、CD3+CD56+和CD8+细胞的比例高、肿瘤的治疗效果更好的CIK细胞，从而完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种制备CIK细胞的方法，包括以下步骤：将分离好的单个核细胞置于含有植物血凝素的培养液中，培养24～72小时后，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28单抗的培养瓶中，同时加入含IL-1α和IL-2的培养液，继续培养5～15天，其中每隔2～3天分瓶培养一次。

根据本发明，所述的植物血凝素的终浓度较佳的为1U/ml。植物血凝素可以刺激培养24～72小时，较佳的刺激48小时。因为一般情况，T淋巴细胞的增殖周期是48～60小时，因此刺激48小时，就能够保证细胞开始增殖。所述的培养液较佳的是GT-T503或1640培养基。所述的抗CD3单抗和抗CD28单抗较佳的包被密度是采用两种单抗的浓度各为1～2μg/ml的包被液包被。当包被浓度小于1μg/ml，对细胞增殖有影响，增殖倍数降低；大于2μg/ml后对提高增殖倍数没有明显影响，由于抗CD3、CD28单抗价格昂贵，增大浓度就将增加成本，最佳的浓度为1μg/ml。所述的IL-1α的终浓度较佳的为20U/ml，IL-2的终浓度较佳的为300U/ml。继续培养5～15天，最佳的继续培养10天。一般继续培养20天以后CIK细胞的增殖力、CD3+CD56+、CD8+两种细胞的比例不会再增加，15天后CIK细胞的杀伤能力将逐渐下降，因此选择15天收获细胞，进行临床应用。继续培养到细胞密度达到3～5×10⁸细胞/ml时，较佳的应该分瓶培养，一般每隔2～3天分瓶培养一次，较佳的每2天就分瓶培养。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种如上所述的方法所制备的CIK细胞。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种CIK细胞制剂，包括CIK细胞和IL-2，其中，所述的CIK细胞为如上所述的CIK细胞。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明制备出的CIK细胞的生物学特性：

(1)细胞组成：T淋巴细胞(CD3+)大于90％。T淋巴细胞中各亚群的比例因个体差异有一定变化范围，一般为：CD3+CD56+细胞为40～60％，CD8+细胞为65～85％，CD3-CD56+细胞为25～45％。

(2)增殖数量高：新型人体CIK细胞培养方法扩增的数量比传统CIK细胞明显强大，体外培养10天后前者细胞的扩增数是后者的3～5倍，是LAK细胞的100倍左右。

(3)杀瘤活性高：用MTT法检测二者的杀伤活性，结果：新型人体CIK细胞培养方法诱导出的CIK细胞比传统CIK细胞明显强大，前者是后者的3～5倍。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：该方法制备出的CIK细胞具有细胞增殖明显提高，CD8细胞比例较大增加，抗瘤谱广，杀瘤活性增强等特点。对手术后的肿瘤患者可有效预防转移复发；与放化疗联合应用可降低前者的毒副作用，增强患者耐受性，提高疗效；对晚期患者可明显延长生命周期，提高生活质量。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 本发明的CIK细胞的制备

(1)外周血单个核细胞(PBMC)采集制备

用血细胞分离机在无菌条件下采集肿瘤患者抗凝血，生理盐水对倍稀释，比重为1.077的淋巴细胞分离液(中科院天津血研所生物科技公司产品)与稀释血按1：2加入离心管中，离心2500rpm/30min，分离得PBMC，用Hanks液洗涤2次，用无血清培养液GT-T503调整细胞浓度，使得细胞浓度为2×10⁶细胞/ml的细胞悬液。

(2)本发明的新型人体CIK细胞诱导与扩增

将分离获得的细胞悬液置于含有PHA(植物血凝素)10U/ml的GT-T503培养液中，放入225cm²的培养瓶(美国CORNING公司)中，150ml/瓶，置入37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养48h，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28单抗的225cm²的培养瓶中，同时加入CIK细胞诱导液(含终浓度100U/ml的IL-1α和100U/ml的IL-2的GT-T503培养液)继续培养48h，每24h观察细胞生长情况，并做细胞计数。离心去上清，在如上包被的225cm²的培养瓶中用上述CIK细胞诱导液调整细胞浓度为2×10⁶细胞/ml继续培养。每隔48小时，按上述细胞密度分瓶扩增培养一次，培养十天后收获细胞(共分瓶扩增培养5次)。

其中的抗CD3、CD28单抗包被方法为：在GT-T503培养液中加入抗CD3、CD28单抗(美国Sigma公司)，制备成抗CD3、CD28单抗浓度分别为1μg/ml的包被液，将50ml该包被液置入225cm²培养瓶中，4℃过夜或37℃ 4h，弃去包被液，将培养瓶口旋紧备用。

对比例1 传统的CIK细胞的制备

按照参考文献(任欢，邢淑贤等：CIK细胞体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究，中国肿瘤生物治疗杂志。1999，6(1)：17-21)中的方法进行传统CIK细胞培养：分离外周血PBMC细胞，将分离的细胞置入含有干扰素-γ(浓度为1000U/ml)，浓度5％(v/v)CO₂培养箱中培养24小时，加入抗CD3单抗(10μg/ml)，IL-1α(100U/ml)，IL-2(100U/ml)据细胞生长情况进行扩增，10天后收获即为CIK细胞。

实施例2 CIK细胞各指标的检测

1)无菌试验和热源检测

实施例1和对比例1收获的CIK细胞，无菌试验和热源检测均为阴性。

2)表型检测

用流式细胞仪检测细胞表型。

表型检测结果，实施例1收获的CIK细胞中，T淋巴细胞(CD3+细胞)占细胞总数的90％以上。其中，T淋巴细胞中各亚群的比例因个体差异有一定变化范围：CD3+CD56+细胞的比例为40～60％，CD8+细胞的比例为65～85％，CD3-CD56+细胞的比例为25～45％。对比例1收获的CIK细胞中，CD3+CD56+细胞的比例是25～35％；CD8+细胞的比例是45～60％。

3)活细胞计数检测

检测方法为常规：从培养瓶中吸取0.1ml培养液，对其所含的CIK细胞用台盼兰进行染色，活细胞被染成兰色，死细胞不能被染色，在显微镜下计数200个细胞，看被染色细胞的比例。

活细胞计数检测结果：50ml外周血分离出PBMC，按实施例1收获的CIK细胞数为8×10⁹细胞；按对比例1收获的CIK细胞数为2×10⁹细胞。可见，本发明的人体CIK细胞培养方法诱导出的CIK细胞比传统CIK细胞明显强大，前者是后者的3～5倍。

4)MTT法检测CIK细胞的杀伤活性

将CIK细胞与肿瘤细胞共同培养(实验用肿瘤细胞株有两种：1、对NK敏感的K562肿瘤株；2、对NK不敏感的HL-60肿瘤株)，培养6小时后，用MTT法检测肿瘤细胞死亡比例来比较杀瘤活性。结果换算为杀瘤单位(LU)。

实施例1的CIK细胞为31LU/10⁶细胞，对比例1的传统CIK细胞杀瘤单位为23LU/10⁶细胞。

实施例3 本发明的新型CIK细胞制剂

将实施例1中体外培养10天后收获的CIK细胞置入50ml离心管中，离心1000rpm/10min，收集1×10¹⁰细胞，生理盐水洗涤一次，弃上清液，用生理盐水将沉淀细胞打均，转移到100ml输液瓶中，加IL-2 50万单位，注射用生理盐水100ml，制备成细胞悬液，留样，进行指标检测。CIK细胞活率记数大于95％，细菌检测、热源检测均为阴性的为合格。合格者加盖封口，低温保存待用。

实施例4 肿瘤患者治疗

1、治疗对象：肝癌中、晚期无法手术患者11例，年龄47～73岁，男性10例，女性1例。所有患者均进行过化疗，病情未得到有效控制。血清肿瘤标志物甲胎蛋白在400U/L以上。患者预期生存大于3个月；重要生命器官正常；无严重细菌感染；无生物制品过敏史。上述是经无锡东方肿瘤医院诊断确诊的患者。

2、治疗过程：所有患者均在化疗终止后15天采用实施例3所得的CIK细胞静脉输注进行治疗。每天一次，5天为一个疗程，每次输注CIK细胞为1×10⁹细胞。第一疗程完成后的第三个月进行第二疗程治疗，每患者接受两个疗程治疗。

3、疗效评估：

1)影象学指标(CT指标)

CIK细胞治疗疗效评定采用WHO通用实体瘤疗效评定标准。完全缓解(CR)：可测量的病灶完全消失，维持4周以上；部分缓解(PR)：可测量的病灶最大直径及最大垂直横径的乘积缩小一半及以上，无新病灶出现；好转(MR)：可测量的病灶两径乘积缩小25～50％，无新病灶出现；稳定(SD)：可测量的病灶两径乘积缩小<25％或增大<25％，无新病灶出现；进展(PD)：可测量的病灶两径乘积增大>25％，或出现新的病灶。有效率＝{(CR+PR)/治疗病人总数}×100％。

2)血清动态肿瘤标志物(甲胎蛋白)检测：

治疗前、治疗后每月进行一次检测，甲胎蛋白不再升高、稳定或持续下降为有效。

3)生命质量评分：

按照国际通行标准KPS评分方法，对患者治疗前、后动态生命质量进行评分，分数增加为有效。

4)免疫功能检测：对患者治疗前、后动态T淋巴细胞亚群进行检测，观察T淋巴细胞亚群变化情况，反映患者免疫功能恢复情况。

5、结果：

治疗后影象学指标：CR 0例、PR 3例，MR 4例，SD 2例，PD 2例。

有效率＝3/11×100％＝27.2％。

甲胎蛋白检测结果：下降6例，稳定3例，升高2例。甲胎蛋白呈动态下降，其中3例患者在第二疗程治疗后，甲胎蛋白降到正常植。结果表明80％患者对治疗有反应，病情不再进展或好转。

生命质量评分：7例升高，2例稳定，2例降低。

T细胞亚群检测：治疗前，11例患者中有8例T细胞亚群异常，治疗后有5例患者恢复正常，占72％。

Claims

1、一种制备CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将分离好的单个核细胞置于含有植物血凝素的培养液中，培养24～72小时后，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28单抗的培养瓶中，同时加入含IL-1α和IL-2的培养液，继续培养5～15天，其中每隔2～3天分瓶培养一次。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物血凝素的终浓度为1U/ml。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养液是GT-T503或1640培养基。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗CD3单抗和抗CD28单抗的包被密度是采用两种单抗的浓度各为1～2μg/ml的包被液包被。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IL-1α的终浓度为20U/ml，所述的IL-2的终浓度为300U/ml。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞密度达到3～5×10⁸细胞/ml时，就分瓶培养。

7、一种如权利要求1～6任一项所述的方法所制备的CIK细胞。

8、一种CIK细胞制剂，包括CIK细胞和IL-2，其特征在于，所述的CIK细胞为如权利要求7所述的CIK细胞。