CN102321577B - 抗肿瘤过继免疫细胞制备方法及制得的免疫细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤过继免疫活性细胞的制备方法，所述方法包括采集分离外周血单个核细胞，添加细胞因子诱导培养得到杀伤细胞CIK，所述细胞因子包括CD28。在本发明的CIK诱导体系中，通过引入细胞因子CD28，提高诱导效果，同时还提高细胞增殖倍数。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤过继免疫活性细胞的制备方法及制备得到的免疫活性细胞。
背景技术：
肿瘤虽然是一种古老的疾病，但近半个世纪以来，肿瘤已渐渐成为多发病、常见病，为居民死亡原因的第一、二位，严重威胁人类健康。
肿瘤的生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四大治疗方法。由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多的目光投到肿瘤的生物治疗上。近10年来，肿瘤的生物治疗得到长足的发展，在改善患者生存质量，降低复发率方面的重要作用已得到越来越多的认可和重视。
在肿瘤国际免疫治疗中，先后经历了淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK细胞），抗CD3单克隆抗体诱导的杀伤性细胞及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞），由于一些细胞免疫治疗因其效应细胞来源困难(如TIL)或治疗副反应较大(如LAK)等原因，故目前研究和报道越来越少。
细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell,CIK）具有增殖能力强、较其他效应细胞更高的杀瘤活性、对骨髓及造血细胞无明显毒副反应等优点；树突状细胞（dendritie cell,DC）是目前所知的唯一能激活初始性T细胞且功能最强的专职抗原提呈细胞(APC)。DC可激活自然杀伤细胞(NK)及自然杀伤T细胞(NKT)，在诱导细胞免疫及体液免疫中起着重要作用；DC和CIK共培养的细胞DC-CIK即细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL，也称为CD8+T细胞），通过细胞裂解(cytolysis)及细胞凋亡(apoptosis)两种机制发挥特异性直接杀伤靶细胞作用，其在杀伤靶细胞的过程中自身不受损伤，可反复杀伤多个靶细胞。将DC与CIK及DC-CIK细胞在体外共同培养活化后回输可避免体内免疫抑制因素影响，解除免疫活性细胞的免疫无能，提高机体免疫功能，打破肿瘤细胞免疫耐受，从而发挥协同抗肿瘤作用并取得更为满意的效果。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种能够使效应细胞扩张倍数增强、杀伤性细胞毒活性增强的抗肿瘤过继免疫细胞的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的抗肿瘤过继免疫活性细胞。
本发明提供了一种抗肿瘤过继免疫细胞的制备方法，所述方法包括采集分离外周血单个核细胞，添加细胞因子诱导培养得到杀伤细胞CIK，所述细胞因子包括CD28McAb。
所述CD28McAb在诱导培养过程中的添加量优选为0.5～2μg/ml，更优选为0.8～1.2μg/ml，进一步优选为1μg/ml。
在本发明一个具体的实施方式中，所述免疫活性细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
将采集分离得到的外周血单个核细胞与培养基一起置于包被有Retronectin的培养瓶中，并加入细胞因子IFN-γ500～2000μg/ml，更优选为800～1200μg/ml，进一步优选为1000μg/ml；
培养至第2日，加入细胞因子CD3McAb 0.5～5μg/ml、CD28McAb0.5～2μg/ml，IL-2500～2000μg/ml，更优选为CD3McAb 1.8～2.2μg/ml、CD28McAb0.8～1.2μg/ml，IL-2800～1200μg/ml，进一步优选为CD3McAb 2μg/ml、CD28McAb 1μg/ml，IL-21000μg/ml；
之后每天添加培养基及细胞因子IL-2500～2000μg/ml，更优选为800～1200μg/ml，进一步优选为1000μg/ml，至细胞成熟。
所述步骤优选进一步包括，培养至5～6天时更换培养基，继续培养至第14天，细胞成熟。
所述培养优选在37℃，5%CO2的条件下进行，且培养过程中调整细胞密度为0.5×106～1.5×106/ml。
在本发明另一个具体的实施方式中，所述方法还包括将所述外周血单个核细胞，利用自体肿瘤抗原诱导培养得到树突状细胞DC，并在CIK细胞培养至第九天时加入成熟的DC细胞混合培养。
所述混合培养可进一步优选为，CIK细胞与成熟DC细胞按细胞数量100～500:1的比例混合培养，培养至第12天细胞成熟。
所述DC细胞诱导培养包括，将所述外周血单个核细胞添加细胞因子GM-CSF及IL-4进行诱导培养，至第7天添加自体肿瘤抗原及树突状细胞促成熟因子，培养至第9天DC细胞成熟。
所述DC细胞的诱导培养可进一步优选为，将所述外周血单个核细胞于37℃，5%CO2的条件培养，每天加入GM-CSF 500～2000μg/ml，IL-4500～2000μg/ml，更优选为GM-CSF 800～1200μg/ml，IL-4800～1200μg/ml，进一步优选为GM-CSF 1000μg/ml，IL-41000μg/ml，其中第7天添加含有自体肿瘤抗原的自体肿瘤组织裂解液及树突状细胞促成熟因子，使裂解液蛋白终浓度为40～100μg/ml，更优选为40～60μg/ml，进一步优选为50μg/ml，促成熟因子终浓度200～1000μg/ml，更优选为400～600μg/ml，进一步优选为500μg/ml，培养至第9天DC细胞成熟。
本发明同时还提供了通过以上制备方法得到的抗肿瘤过继免疫活性细胞。
由于采用了以上的技术方法，使本发明的有益效果在于：
本发明公开了一种抗肿瘤过继免疫活性细胞（杀伤细胞CIK）的制备方法，在本发明的CIK诱导体系中，通过引入细胞因子CD28McAb，提高诱导效果，同时还提高细胞增殖倍数。此外，在CIK培养环境中引入Retronectin因子，也提高诱导效果及细胞增殖倍数。同时，在细胞培养过程中，补充诱导所需的细胞因子由常规方法中的2-3天添加改为每天添加，使诱导体系中的细胞因子维持最佳浓度，进一步提高诱导效果和细胞增殖倍数。而将肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞共培养得到DC-CIK细胞。致敏DC和CIK的共同培养可以激活CIK细胞群体中的T细胞，使得到的DC-CIK成为肿瘤特异性细胞性杀伤性细胞，提高CIK群体的整体杀瘤效果。
附图说明：
图1为本发明实验例中DC-CIK细胞流式结果图。图1中A至D分别表示CD3、CD4、CD8、CD56在DC-DIK细胞中的比例。
图2为本发明实验例中DC-CIK细胞流式结果直方图。图1中A至C分别表示CD3+CD4+双阳细胞、CD3+CD56+双阳细胞、CD3+CD8+双阳细胞在DC-DIK细胞中的比例。
图3为本发明实验例中DC-CIK细胞增殖曲线对比图。
图4为本发明实验例中DC-CIK细胞对绿色荧光标记的A549细胞杀伤图。其中图4-A为靶细胞图像；图4-B为常规培养得到的CIK细胞对靶细胞的杀伤结果图像（效靶比为20:1）；图4-C为本发明实施例4培养得到的DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤结果图像（效靶比为20:1）
图5为本发明实验例中DC-CIK细胞对生物素标记的K562细胞杀伤图。图5-A为不同效靶比细胞杀伤率；图5-B显示不同效靶比，肿瘤细胞所剩数量的变化。
具体实施方式：
本发明提供的一种抗肿瘤过继免疫活性细胞的制备方法，包括采集分离外周血单个核细胞，添加细胞因子诱导培养得到杀伤细胞CIK，与常规CIK培养过程不同的是，除了常规诱导所选用细胞因子（例如CD3McAb）以外，本发明中还引入了新的细胞因子CD28McAb。通过在CIK诱导体系中引入了细胞因子CD28McAb，在其他细胞因子如CD3McAb的共刺激作用下，可以显著提高诱导效果，同时还可以提高细胞增殖倍数。所述CD28McAb在诱导培养过程中的添加量为0.5～2μg/ml，在本发明中的一个实施例中，CD28McAb的添加量进一步优选为1μg/ml。
为了取得更好的实验效果，在本发明的一个具体实施方式中，所述CIK诱导培养方法还包括以下步骤：
将采集分离得到的外周血单个核细胞与培养基一起置于包被有Retronectin的培养瓶中，并加入细胞因子IFN-γ500～2000μg/ml优选1000μg/ml。通过在CIK诱导培养环境中引入Retronectin因子，可以提高CIK的诱导效果及细胞增殖倍数。在本发明的实施例中Retronectin以包被在培养瓶中的方式引入培养体系中，本领域技术人员也可以通过本发明根据具体细胞培养的实际环境，采用包被或其他Retronectin因子引入方式，使细胞培养环境中存在适应的Retronectin条件；
培养至第2日，加入细胞因子CD3McAb 0.5～5μg/ml优选2μg/ml、CD28McAb 0.5～2μg/ml优选1μg/ml，IL-2 500～2000μg/ml优选1000μg/ml；
之后每天添加培养基及细胞因子IL-2 500～2000μg/ml优选1000μg/ml，至细胞成熟。在常规CIK培养中，补充诱导所需的细胞因子一般为2-3天添加一次，本发明中细胞因子采取每天添加的方式，目的在于维持诱导体系中细胞因子的最佳浓度，通过采取这种方式可以提高诱导效果，提高细胞增殖倍数。
所述方法还可进一步优化包括，培养至5～6天时更换培养基，继续培养至14天，细胞成熟，收集CIK。
上述制备方法中所述培养在37℃，5%CO2的条件下进行，且培养过程中调整细胞密度为0.5×106～1.5×106/ml。本领域技术人员可以通过本发明根据具体细胞培养的实际情况，对培养温度、CO2浓度、细胞培养密度等在上述范围内进行相应的调整以获取最佳培养效果。
本发明还进一步优化了上述免疫活性细胞制备方法，在诱导培养CIK的同时，利用自体肿瘤抗原诱导培养得到树突状细胞DC，并在CIK细胞培养至第九天时加入成熟的DC细胞混合培养。通过将肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞共培养，可以进一步激活CIK细胞群体中的T细胞，通过致敏DC细胞的作用，使DC-CIK成为肿瘤特异性细胞性杀伤性细胞，提高CIK群体的整体杀瘤效果。
为了获得更好的混合培养效果，在本发明的实施例中CIK细胞与成熟DC细胞按细胞数量100～500:1的比例混合培养，培养至12天细胞成熟，可收集DC-CIK，也可进一步培养扩增。优选在第12-16天收集DC-CIK。
同时，本发明还对DC细胞诱导培养过程进行相应的改良，将所述外周血单个核细胞添加细胞因子GM-CSF及IL-4进行诱导培养，至第7天添加自体肿瘤抗原及树突状细胞促成熟因子，培养至第9天DC细胞成熟。此种方法使得收获的DC成熟度更高。
本发明的一个实施例进一步公开了DC细胞诱导培养过程为，将所述外周血单个核细胞于37℃，5%CO2的条件培养，每天加入GM-CSF 500～2000μg/ml优选1000μg/ml，IL-4500～2000μg/ml优选1000μg/ml，其中第7天添加含有自体肿瘤抗原的自体肿瘤组织裂解液及树突状细胞促成熟因子，使裂解液蛋白终浓度为40～100μg/ml优选50μg/ml，促成熟因子终浓度200～1000μg/ml优选500μg/ml，培养至第9天DC细胞成熟。本领域技术人员可以根据本发明和实际具体实验情况，对培养温度、CO2浓度、细胞因子浓度等在上述范围内进行相应的调整。
通过上述制备方法可制备得到免疫活性细胞DC,CIK和DC-CIK。利用本发明的上述方法，能够增强对细胞的诱导作用，从而提高细胞增殖倍数，并增强所制备得到的免疫活性细胞的细胞毒活性。将其体外共同培养活化后回输可避免体内免疫抑制因素影响，解除免疫活性细胞的免疫无能，提高机体免疫功能，打破肿瘤细胞免疫耐受，从而发挥协同抗肿瘤作用并取得更为满意的效果。
下面通过具体的实施例结合附图对本发明做进一步详细的描述。
实施例1外周血单个核细胞（PBMC）的采集及分离：
无菌抽取外周血40-45ml，按血培养操作加入放有肝素盐水的50ml离心管，轻摇，充分抗凝。用生理盐水1:1稀释，放入2支50ml离心管。缓慢加在（预先放入25ml淋巴细胞分离液，50ml离心管4支）分离液的界面上。室温离心，2000rpm:；20分钟。吸出PBMC，移入4支新的50ml离心管中，加生理盐水至50ml，用吸管轻吹混合。离心20分钟，弃去上清。用生理盐水将4支离心管中的细胞重悬，合并至1支离心管中，加生理盐水至50ml，充分混合，取样20ul计数。将50ml细胞悬液离心洗涤2次，2300rpm，10分钟；弃去上清。加入AIM-V(GIBCO)培养液调节细胞密度3-5×106/ml。接种于10cm平皿中，每皿10ml。37℃,5%CO2，贴壁培养3小时。
实施例2DC诱导及扩增：
用吸管轻吹上述贴壁培养3小时的细胞，将未贴壁细胞及培养液吸出，移入50ml离心管中，离心，2300rpm,10分钟。将上清沿侧壁加回到平皿中。加入GM-CSF 1000μg/ml；IL-41000μg/ml，37℃,5%CO2，培养。之后，每天添加因子（GM-CSF、IL-4）及AIM-V培养基，将细胞密度调整到1*106/ml。培养至第7天，在培养皿中添加自体肿瘤组织裂解液，及树突状细胞促成熟因子，使裂解液蛋白终浓度50μg/ml，促成熟因子终浓度500μg/ml，第8天，加入GM-CSF1000μg/ml；IL-41000μg/ml，37℃,5%CO2，培养，第9天成熟，收集DC。
自体瘤细胞裂解液的制备方法：
用生理盐水吸取新鲜肿瘤组织的血液，用无菌手术剪剪碎后，匀浆器研磨，在液氮及37℃反复冻融5次，3000rpm离心10分钟，弃去沉淀，上清取样测蛋白浓度，其余冻存于-20℃备用。
实施例3CIK细胞的诱导和扩增：
预先将1支Retronectin2.5mg，溶于250ml生理盐水，以终浓度10μg/ml制成包被液。取10ml包被液放于T-75cm2的培养瓶中，静置过夜。第二天，吸弃包被液，用生理盐水洗涤培养瓶2次，即得到包被Retronectin因子的培养瓶。
将实施例1中贴壁培养3小时后未贴壁的细胞，用AIM-V培养基10ml重悬，移入包被有Retronectin的T-75cm2培养瓶中，加入IFN-r1000μg/ml，于37℃,5%CO2的培养环境中继续培养。第2日，在培养瓶中加入CD3McAb 2μg/ml、CD28McAb 1μg/ml、IL-2 1000μg/ml。之后，每天添加培养基及细胞因子IL-2，并调整培养瓶中的细胞密度为1*106/ml。培养至5-6天时更换培养基AIM-V。之后继续培养，期间每天添加培养基及细胞因子IL-2。至第14天，CIK细胞成熟，收集成熟的CIK细胞。
实施例4DC-CIK细胞的诱导及扩增：
按实施例3相同方法诱导及扩增CIK细胞，但培养至第9天时，改用以下步骤进行：将培养至第9天的CIK细胞和实施例2中第9天收集的成熟DC细胞，以CIK细胞与成熟DC细胞按细胞数量100-500:1的比例混合，于37℃,5%CO2的培养环境中继续培养。培养过程中，每日添加培养基AIM-V，细胞生长因子IL-2 1000μg/ml，培养至第12天，细胞成熟。
实验例
将采集的血液，经过上述方法，获得单个核细胞，将单个核细胞平均分成两份，分别按照常规方法及上述引入因子CD28McAb及DC-CIK共培养的方式（实施例4的方法）培养，培养过程中，每2-3天，进行细胞计数，绘制细胞增殖曲线（参见图3）。
并在DC-CIK共培养的第14天，用抗体CD3、CD4、CD8、CD56进行标记，做流式检测，检测结果参见图1和图2。
细胞体内杀伤实验，分别采用绿色荧光标记的肺癌A549细胞株及生物素标记的慢性粒细胞白血病K562细胞进行检测。首先将上述两种肿瘤细胞株按照3*105/ml分别接种于96孔板，待24h，细胞融合度达到80%左右，分别将常规方法得到的CIK细胞与本发明方法（如实施例4）得到的DC-CIK细胞按照20:1（效应细胞：靶细胞）的比例加入上述96孔板中。37℃，5%CO2培养箱孵育24h。分别用荧光显微镜及酶标仪进行杀伤检测。结果参见图4和图5。
通过以上制备技术得到的成熟DC-CIK细胞，其主要生物学特性有：
（1）细胞组成：DC-CIK细胞中，T淋巴细胞占95%以上（参见图1-A CD397%,图1-B CD4 20.3%，图1-C CD8 77.8%，图1-D CD56 38.3%）;
T淋巴细胞中各亚群所占比例具有个体差异，而且随着培养时间的延长，比例有所变化，一般来说在本发明中，CD3+CD4+细胞占20-30%，CD3+CD56+占20-60%，CD3+CD8+占60-80%（参见图2-A至C,其中图2-B CD3CD56双阳性细胞比例可达35.8%）。
（2）细胞增殖倍数高：
与常规培养方法比较，引入细胞因子CD28McAb得到的DC-CIK细胞体外扩增14-20天，增殖倍数能提高2-4倍，如图3所示。
（3）细胞毒活性高：
1.与常规培养方法相比较，引入细胞因子CD28McAb得到的DC-CIK细胞对特异性细胞的杀伤作用高出10-20%倍。如图4A至C，其中图4A为靶细胞图像；图4B为常规培养得到的CIK细胞按对靶细胞的杀伤结果图像（效应细胞：靶细胞的比例为20:1）；图4C为本发明实施例4培养得到的DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤结果图像（效应细胞：靶细胞的比例为20:1）。
2.在效靶比为20:1时，DC-CIK细胞对生物素标记的慢性粒细胞白血病细胞株K562杀伤率可达95.18%。如图5A\B所示，其中图5A为不同效靶比细胞杀伤，效靶比为20:1时，杀伤率可达95.18%；图5B显示不同效靶比，肿瘤细胞所剩数量不同，所以呈现的颜色不同。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种抗肿瘤过继免疫细胞制备方法，所述方法包括采集分离外周血单个核细胞，添加细胞因子诱导培养得到杀伤细胞CIK，其特征在于：所述细胞因子包括CD28McAb；所述CD28McAb在诱导培养过程中的添加量为0.5～2μg/ml；所述方法包括以下步骤，
将采集分离得到的外周血单个核细胞与培养基一起置于包被有Retronectin的培养瓶中，并加入细胞因子IFN-γ500～2000μg/ml；
培养至第2日，加入细胞因子CD3McAb0.5～5μg/ml、CD28McAb0.5～2μg/ml，IL-2500～2000μg/ml；
之后每天添加培养基及细胞因子IL-2500～2000μg/ml，培养至5～6天时更换培养基，继续培养至14天，细胞成熟。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述培养在37℃，5%CO2的条件下进行，且培养过程中调整细胞密度为0.5×106～1.5×106/ml。
3.根据权利要求1或2中任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括将所述外周血单个核细胞，利用自体肿瘤抗原诱导培养得到树突状细胞DC，并在CIK细胞培养至第九天时加入成熟的DC细胞混合培养。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：CIK细胞与成熟DC细胞按细胞数量100～500:1的比例混合培养，培养至12天细胞成熟。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述DC细胞诱导培养过程包括，将所述外周血单个核细胞添加细胞因子GM-CSF及IL-4进行诱导培养，至第7天添加自体肿瘤抗原及树突状细胞促成熟因子，培养至第9天DC细胞成熟。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：将所述外周血单个核细胞于37℃，5%CO2的条件培养，每天加入GM-CSF500～2000μg/ml，IL-4500～2000μg/ml，其中第7天添加含有自体肿瘤抗原的自体肿瘤组织裂解液及树突状细胞促成熟因子，使裂解液蛋白终浓度为40～100μg/ml，促成熟因子终浓度200～1000μg/ml，培养至第9天DC细胞成熟。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的制备方法制备得到的抗肿瘤过继免疫细胞。
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