CN105039254B - 一种免疫细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种免疫细胞及其制备方法。该制备方法包括：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。本发明同时利用肿瘤细胞核苷酸和蛋白致敏源，强化刺激DC细胞，发挥更强的抗原致敏作用，达到与肿瘤细胞更高的亲和性，且不存在肿瘤细胞的危险因素。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种免疫细胞及其制备方法。
背景技术
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。
恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的第一病害，在继切除手术、放疗、化疗之后，肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。在现有的免疫细胞治疗中有相继出现LAK细胞疗法、TIL细胞疗法、DC细胞疗法、CIK细胞疗法和DC-CIK联合疗法，在肿瘤治疗中发挥举足轻重的作用。
CIK细胞杀伤肿瘤细胞主要通过以下途径：①CIK细胞能以不同的机制识别肿瘤细胞，通过直接的细胞质颗粒穿透封闭的肿瘤细胞膜，实现对肿瘤细胞的裂解；②通过诱导肿瘤细胞凋亡杀伤肿瘤细胞；③CIK细胞分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子；④CIK细胞回输后可激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能。
DC-CIK细胞疗法联合应用将取得“1+1>2”的疗效，可以显著地抑制肿瘤细胞的生长、增殖，明显改善患者的生活质量，提高肿瘤患者的生存期，是继肿瘤手术、放疗、化疗后又一种更加有效的新手段。该疗法既可单独使用，也可以作为手术、化疗和放疗后的有力辅助手段，效果显著。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗，可清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内散存的瘤细胞，在延缓或阻止肿瘤的转移或复发方面有重要作用；对于部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的肿瘤患者，也可以先进行DC+CIK细胞治疗，提高身体机能状况，改善生活质量，争取其它治疗机会。
目前，自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备简要流程包括：①外周血离心提取血清，加亮抑蛋白酶抑制蛋白降解，-20℃冷冻后，0-4℃复温；②灭活处理，过滤，加到DC细胞培养液刺激DC细胞；③共培养DC-CIK，达到DC细胞高度呈递肿瘤抗原信息，发挥CIK杀伤效果。
在各种免疫细胞治疗方案中，细胞与靶向细胞的亲和能力以及免疫细胞的杀伤能力是免疫细胞治疗的关键。而目前的DC-CIK细胞制备方法中，离心获得的血浆中含有的肿瘤抗原物质含量很低，经低温处理再复温除去上清的方法进行抗原成分浓缩，效果不明显，再经灭活处理，肿瘤抗原特性极低，所以加入DC细胞培养液中刺激DC发育，效果不佳。因此急需提供一种能够得到和肿瘤细胞具有高亲和反应的免疫细胞培养方案。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种免疫细胞及其制备方法。本发明同时利用肿瘤细胞核苷酸和蛋白致敏源，强化刺激DC细胞，发挥更强的抗原致敏作用，达到与肿瘤细胞更高的亲和性，且不存在肿瘤细胞的危险因素。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；
取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；
步骤2：贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；
步骤3：悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；
步骤4：将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。
在本发明提供的一些实施例中，杀伤性免疫细胞为CIK细胞或NKT细胞。但本发明所述杀伤性免疫细胞并非限定于此，本领域技术人员认为可行的杀伤性免疫细胞均在本发明的保护范围之内。
作为优选，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5％～20％的制剂1、10～20ng/mL的GM-CSF和5～10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
在本发明提供的一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5％的制剂1、15ng/mL的GM-CSF和10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加10％的制剂1、20ng/mL的GM-CSF和5ng/mL的IL-4的无血清培养基。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加20％的制剂1、10ng/mL的GM-CSF和8ng/mL的IL-4的无血清培养基。
作为优选，步骤2中培养6天后添加TNF-α培养1～3天。
作为优选，步骤3中诱导培养采用的培养基包括100～200U/mL IL-2、10～20ng/mLIL-15、8～20ng/mL IL-21和40～60ng/mL OKT-3，4天后补液。
作为优选，4天后补液按总体积添加100～200U/mL IL-2、10～20ng/mL IL-15、8～20ng/mL IL-21和40～60ng/mL OKT-3。
在本发明提供的一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括100U/mL IL-2、15ng/mL IL-15、20ng/mL IL-21和40ng/mL OKT-3，4天后补液。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括150U/mLIL-2、20ng/mL IL-15、8ng/mL IL-21和50ng/mL OKT-3，4天后补液。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括200U/mLIL-2、10ng/mL IL-15、15ng/mL IL-21和60ng/mL OKT-3，4天后补液。
作为优选，共培养采用的培养基中添加100～200U/mL IL-2、10～20ng/mL IL-15，每3天补液一次。
作为优选，在共培养中，补液的密度为(1～2)×106cell/mL。
作为优选，共培养的时间至少为14天。
作为优选，步骤1中PBMC的培养条件为：选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为(0.5～1)×106cell/mL，37℃，5％CO2条件下培养2～4h。
在本发明提供的一些实施例中，肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞。
作为优选，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质量比为1:5～5:1混合。
在本发明提供的一些实施例中，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质量比为1:1混合。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质量比为1:5混合。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤1中肿瘤细胞核苷酸与上清液按干重的质量比为5:1混合。
本发明还提供了一种免疫细胞，其制备方法包括如下步骤：
步骤1：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；
取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；
步骤2：贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；
步骤3：悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；
步骤4：将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。
作为优选，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5％～20％的制剂1、10～20ng/mL的GM-CSF和5～10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
在本发明提供的一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加5％的制剂1、15ng/mL的GM-CSF和10ng/mL的IL-4的无血清培养基。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加10％的制剂1、20ng/mL的GM-CSF和5ng/mL的IL-4的无血清培养基。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤2中包含制剂1的培养基的配方为添加20％的制剂1、10ng/mL的GM-CSF和8ng/mL的IL-4的无血清培养基。
作为优选，步骤2中培养6天后添加TNF-α培养1～3天。
作为优选，步骤3中诱导培养采用的培养基包括100～200U/mL IL-2、10～20ng/mLIL-15、8～20ng/mL IL-21和40～60ng/mL OKT-3，4天后补液。
作为优选，4天后补液按总体积添加100～200U/mL IL-2、10～20ng/mL IL-15、8～20ng/mL IL-21和40～60ng/mL OKT-3。
在本发明提供的一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括100U/mL IL-2、15ng/mL IL-15、20ng/mL IL-21和40ng/mL OKT-3，4天后补液。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括150U/mLIL-2、20ng/mL IL-15、8ng/mL IL-21和50ng/mL OKT-3，4天后补液。
在本发明提供的另一些实施例中，步骤3中诱导培养采用的培养基包括200U/mLIL-2、10ng/mL IL-15、15ng/mL IL-21和60ng/mL OKT-3，4天后补液。
作为优选，共培养采用的培养基中添加100～200U/mL IL-2、10～20ng/mL IL-15，每3天补液一次。
作为优选，在共培养中，补液的密度为(1～2)×106cell/mL。
作为优选，共培养的时间至少为14天。
作为优选，步骤1中PBMC的培养条件为：选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为(0.5～1)×106cell/mL，37℃，5％CO2条件下培养2～4h。
在本发明提供的一些实施例中，肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞。
在本发明提供的一些实施例中，悬浮生长类肿瘤细胞为血癌类细胞，如HL60、CTC(循环肿瘤细胞)。
在本发明提供的一些实施例中，贴壁生长类肿瘤细胞为K562(人骨髓慢性粒细胞性白血病)、A431(人表皮癌细胞)。
本发明提供了一种免疫细胞及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：
步骤1：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；
取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；
步骤2：贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；
步骤3：悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；
步骤4：将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。
本发明至少具有如下优势之一：
1、本发明免疫细胞的肿瘤抗原致敏性强。本发明同时利用肿瘤细胞核苷酸和蛋白致敏源，强化刺激DC细胞，发挥更强的抗原致敏作用，达到与肿瘤细胞更高的亲和性；
2、本发明制得的免疫细胞不存在肿瘤细胞的危险因素。
附图说明
图1示本发明免疫细胞制备方法的简要技术流程。
具体实施方式
本发明公开了一种免疫细胞及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
DC细胞：DC细胞是一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞(dendritic cells，DCs)。它是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
CIK细胞：CIK细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
DC-CIK生物免疫疗法(或DC+CIK)：是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers，CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞(dendritic cell，DC)是有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。
GM-CSF：粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种调节造血细胞增殖和分化的细胞因子，GM-CSF可以作用于造血干细胞，促进其分化增殖，而所形成的细胞不限于中性粒细胞和单核－吞噬细胞系统。DM-CSF和IL-4组合培养DC细胞，能有效促进DC细胞的增殖。
TNF-α：肿瘤坏死因子是血清中一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，其在消耗症中起了重要作用，又称恶液质素。TNF主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生。1985年Shalaby把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)命名为TNF-β。虽然TNF-α与TNF-β仅有约30％的同源性，但它们却拥有共同的受体。TNFα的生物学活性占TNF总活性的70％～95％，因此目前常说的TNF多指TNF-α。
IL-2、IL-15、OKT3和IL-21：白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，IL-2、IL-15、IL-21属于白细胞介素家族中的两种。OKT3是抗人成熟T细胞共同分化抗原CD3的单克隆抗体，主要用于防治急性移植排斥反应，是免疫细胞培养中不可缺少的重要因子。
本发明提供的免疫细胞及其制备方法中所用免疫细胞，细胞因子、试剂、仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1免疫细胞的制备
(一)肿瘤细胞的培养及制剂1的制备
a、肿瘤组织分离肿瘤细胞A431(贴壁生长类肿瘤细胞)，1640培养基+5％血清培养，接种密度5-10×105cell/mL接种于T75培养瓶。
b、第二天半量换液，具体操作步骤如下：
贴壁生长类肿瘤细胞待80％铺满后，0.25％胰酶消化1-2min，血清终止消化，400g离心5min沉淀细胞，1:2传代培养。根据细胞生长状况换液(2-3天换液一次)，并收集上清液。培养4天后，收集所有上清液，0.25％胰酶消化1-2min，血清终止消化，400g离心5min沉淀收集细胞。
c、上清液采用超滤系统浓缩，仪器采用赛多利斯Slice200切向流器，步骤：
1)培养液经0.45μm孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；
2)再经0.22μm孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；
3)得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤3h去除小分子物质，得到浓缩液。
d、下层细胞裂解：
1)下层细胞加HClO4裂解、离心，取上清液；
2)上清液加KOH中和，离心，取上清液；
3)加活性炭吸附白细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加NaCl溶液获得肿瘤细胞核苷酸成分。
e、按干重的质量比为1:1混合步骤d所得肿瘤细胞核苷酸成分和步骤c所得浓缩液获得制剂1，0-4℃保存备用。
(二)免疫细胞分离培养
a、患者外周血30-40mL，700g离心10min，除去上层血浆，按下层血液：生理盐水＝1:2的比例稀释。
b、稀释的血液缓慢加入淋巴细胞分离液上层，使分层清晰，600-800g离心20-30min，升降速调为0，吸取中间白膜层PBMC。
c、PBMC接种，选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为0.5×106cell/mL，37℃，5％CO2培养箱培养4h。
d、上清悬浮细胞重新接种一新的培养瓶诱导CIK细胞培养，下层贴壁细胞诱导DC细胞培养。
DC细胞培养：X-VIVO15培养基添加5％的制剂1、15ng/mL的GM-CSF和10ng/mL的IL-4培养；2-3天换液一次，培养6天后添加TNF-α培养1天，再与杀伤性免疫细胞共培养。
杀伤性免疫细胞培养：悬浮细胞接种于新培养瓶，同时添加100U/mL IL-2、15ng/mL IL-15、20ng/mL IL-21和40ng/mL OKT-3；第4天后第一次补液，并按总体积添加100U/mLIL-2、15ng/mL IL-15、20ng/mL IL-21和40ng/mL OKT-3。
e、共培养：第6-7天，共培养DC细胞和杀伤性免疫细胞，并根据总体积添加150U/mLIL-2、20ng/mL IL-15。每3天补液一次，补液密度1×106cell/mL，培养至14天得到免疫细胞。
上述免疫细胞制备方法的简要技术流程见图1。
实施例2免疫细胞的制备
(一)肿瘤细胞的培养及制剂1的制备
a、肿瘤组织分离肿瘤细胞HL60(悬浮生长类肿瘤细胞)，1640培养基+5％血清培养，接种密度5-10×105cell/mL接种于T75培养瓶。
b、第二天半量换液，具体操作步骤如下：
2-3天补液一次，维持细胞密度在1-1.5×106cell/mL，4-8天后，收集细胞悬液，200-400g离心5min，分别收集上清液和细胞。
c、上清液采用超滤系统浓缩，仪器采用赛多利斯Slice200切向流器，步骤：
1)培养液经0.45μm孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；
2)再经0.22μm孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；
3)得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤3h去除小分子物质，得到浓缩液。
d、下层细胞裂解：
1)下层细胞加HClO4裂解、离心，取上清液；
2)上清液加KOH中和，离心，取上清液；
3)加活性炭吸附白细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加NaCl溶液获得肿瘤细胞核苷酸成分。
e、按干重的质量比为1:5混合步骤d所得肿瘤细胞核苷酸成分和步骤c所得浓缩液获得制剂1，0-4℃保存备用。
(二)免疫细胞分离培养
a、患者外周血30-40mL，700g离心10min，除去上层血浆，按下层血液：生理盐水＝1:2的比例稀释。
b、稀释的血液缓慢加入淋巴细胞分离液上层，使分层清晰，600-800g离心20-30min，升降速调为0，吸取中间白膜层PBMC。
c、PBMC接种，选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为0.8×106cell/mL，37℃，5％CO2培养箱培养3h。
d、上清悬浮细胞重新接种一新的培养瓶诱导NKT细胞培养，下层贴壁细胞诱导DC细胞培养。
DC细胞培养：X-VIVO15培养基添加10％的制剂1、20ng/mL的GM-CSF和5ng/mL的IL-4培养；2-3天换液一次，培养6天后添加TNF-α培养2天，再与杀伤性免疫细胞共培养。
杀伤性免疫细胞培养：悬浮细胞接种于新培养瓶，同时添加150U/mL IL-2、20ng/mL IL-15、8ng/mL IL-21和50ng/mL OKT-3；第4天后第一次补液，并按总体积添加150U/mLIL-2、20ng/mL IL-15、8ng/mL IL-21和50ng/mL OKT-3。
e、共培养：第6-7天，共培养DC细胞和杀伤性免疫细胞，并根据总体积添加200U/mLIL-2、10ng/mL IL-15。每3天补液一次，补液密度1.5×106cell/mL，培养至14天得到免疫细胞。
实施例3免疫细胞的制备
(一)肿瘤细胞的培养及制剂1的制备
a、肿瘤组织分离肿瘤细胞K562(贴壁生长类肿瘤细胞)，1640培养基+5％血清培养，接种密度5-10×105cell/mL接种于T75培养瓶。
b、第二天半量换液，具体操作步骤如下：
贴壁生长类肿瘤细胞待90％铺满后，0.25％胰酶消化1-2min，血清终止消化，400g离心5min沉淀细胞，1:2传代培养。根据细胞生长状况换液(2-3天换液一次)，并收集上清液。培养8天后，收集所有上清液，0.25％胰酶消化1-2min，血清终止消化，200g离心5min沉淀收集细胞。
c、上清液采用超滤系统浓缩，仪器采用赛多利斯Slice200切向流器，步骤：
1)培养液经0.45μm孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；
2)再经0.22μm孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；
3)得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤3h去除小分子物质，得到浓缩液。
d、下层细胞裂解：
1)下层细胞加HClO4裂解、离心，取上清液；
2)上清液加KOH中和，离心，取上清液；
3)加活性炭吸附白细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加NaCl溶液获得肿瘤细胞核苷酸成分。
e、按干重的质量比为5:1混合步骤d所得肿瘤细胞核苷酸成分和步骤c所得浓缩液获得制剂1，0-4℃保存备用。
(二)免疫细胞分离培养
a、患者外周血30-40mL，700g离心10min，除去上层血浆，按下层血液：生理盐水＝1:2的比例稀释。
b、稀释的血液缓慢加入淋巴细胞分离液上层，使分层清晰，600-800g离心20-30min，升降速调为0，吸取中间白膜层PBMC。
c、PBMC接种，选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为1×106cell/mL，37℃，5％CO2培养箱培养2h。
d、上清悬浮细胞重新接种一新的培养瓶诱导CIK细胞培养，下层贴壁细胞诱导DC细胞培养。
DC细胞培养：X-VIVO15培养基添加20％的制剂1、10ng/mL的GM-CSF和8ng/mL的IL-4培养；2-3天换液一次，培养6天后添加TNF-α培养3天，再与杀伤性免疫细胞共培养。
杀伤性免疫细胞培养：悬浮细胞接种于新培养瓶，同时添加200U/mL IL-2、10ng/mL IL-15、15ng/mL IL-21和60ng/mL OKT-3；第4天后第一次补液，并按总体积添加200U/mLIL-2、10ng/mL IL-15、15ng/mL IL-21和60ng/mL OKT-3。
e、共培养：第6-7天，共培养DC细胞和杀伤性免疫细胞，并根据总体积添加100U/mLIL-2、15ng/mL IL-15。每3天补液一次，补液密度2×106cell/mL，培养至14天得到免疫细胞。
实施例4肿瘤高亲和性验证试验
分别取CIK细胞、市售的DC-CIK细胞和实施例1至3获得的免疫细胞对K562(贴壁生长类肿瘤细胞)和HL60(悬浮类肿瘤细胞)进行3组杀伤实验，杀伤试验流程具体如下：
分别取杀伤性细胞(效应细胞)和肿瘤细胞(靶细胞)，分别按效应细胞：靶细胞为10:1、20:1、50:1进行3组，每组3个平行实验的试验，并做1组靶细胞自然凋亡。一般取靶细胞1×105，效应细胞分别取1×106，2×106，5×106。共培养4h。
通过酶标仪检测靶细胞死亡后分泌的蛋白成分鉴定，确定靶细胞自然凋亡量和各组杀伤后靶细胞死亡量，计算：杀伤组死亡的靶细胞量减去自然凋亡的细胞量，再除以靶细胞总量，得到杀伤效率值(效靶比)。
结果如下：
表1 K562杀伤结果
| 效靶比 | 10:1 | 20:1 | 50:1 |
| CIK-1 | 0.125 | 0.150 | 0.350 |
| CIK-2 | 0.108 | 0.128 | 0.334 |
| CIK-3 | 0.118 | 0.168 | 0.347 |
| DC-CIK-1 | 0.280 | 0.450 | 0.650 |
| DC-CIK-2 | 0.332 | 0.425 | 0.605 |
| DC-CIK-3 | 0.265 | 0.452 | 0.676 |
| 实施例1细胞-1 | 0.356 | 0.565 | 0.775 |
| 实施例1细胞-2 | 0.295 | 0.525 | 0.737 |
| 实施例1细胞-3 | 0.365 | 0.636 | 0.792 |
| 实施例2细胞-1 | 0.256 | 0.535 | 0.715 |
| 实施例2细胞-2 | 0.299 | 0.575 | 0.727 |
| 实施例2细胞-3 | 0.315 | 0.556 | 0.782 |
| 实施例3细胞-1 | 0.303 | 0.605 | 0.724 |
| 实施例3细胞-2 | 0.298 | 0.575 | 0.717 |
| 实施例3细胞-3 | 0.324 | 0.586 | 0.747 |
表2 HL60杀伤结果
| 效靶比 | 10:1 | 20:1 | 50:1 |
| CIK-1 | 0.085 | 0.102 | 0.122 |
| CIK-2 | 0.105 | 0.102 | 0.112 |
| CIK-3 | 0.095 | 0.098 | 0.118 |
| DC-CIK-1 | 0.122 | 0.135 | 0.190 |
| DC-CIK-2 | 0.122 | 0.144 | 0.189 |
| DC-CIK-3 | 0.125 | 0.147 | 0.205 |
| 实施例1细胞-1 | 0.366 | 0.582 | 0.656 |
| 实施例1细胞-2 | 0.358 | 0.545 | 0.668 |
| 实施例1细胞-3 | 0.322 | 0.557 | 0.708 |
| 实施例2细胞-1 | 0.292 | 0.562 | 0.759 |
| 实施例2细胞-2 | 0.295 | 0.568 | 0.743 |
| 实施例2细胞-3 | 0.323 | 0.572 | 0.702 |
| 实施例3细胞-1 | 0.316 | 0.613 | 0.815 |
| 实施例3细胞-2 | 0.305 | 0.675 | 0.793 |
| 实施例3细胞-3 | 0.292 | 0.678 | 0.802 |
从两种肿瘤细胞的杀伤结果可知：CIK和市售的DC-CIK对不同肿瘤细胞的杀伤能力出现很大的差异性，而本发明制得的免疫细胞对不同类型的肿瘤细胞保持稳定的高杀伤活性，对肿瘤细胞有更高的亲和反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；
取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；
步骤2：所述贴壁细胞采用包含所述制剂1的培养基培养，培养6天后添加TNF-α培养1~3天，获得DC细胞；所述包含制剂1的培养基的配方为添加5%~20%的制剂1、10~20ng/mL的GM-CSF和5~10ng/mL的IL-4的无血清培养基；
步骤3：所述悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；所述诱导培养采用的培养基包括100~200U/mL IL-2、10~20 ng/mL IL-15、8~20 ng/mL IL-21和40~60ng/mL OKT-3，4天后补液；
步骤4：将所述DC细胞与所述杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞；共培养采用的培养基中添加100~200U/mL IL-2、10~20 ng/mL IL-15，每3天补液一次；
所述制剂1的制备方法为：
a、肿瘤组织分离肿瘤细胞，所述肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞，1640培养基+5%血清培养，接种密度（5-10）×105cell/mL接种于T75培养瓶；
b、第二天半量换液，具体操作步骤如下：
贴壁生长类肿瘤细胞：贴壁生长类肿瘤细胞待80%~90%铺满后，0.25%胰酶消化1-2min，血清终止消化，400g离心5min沉淀细胞，1:2传代培养；根据细胞生长状况换液，并收集上清液；培养4天或8天后，收集所有上清液，0.25%胰酶消化1-2min，血清终止消化，200~400g离心5min沉淀收集细胞；
悬浮生长类肿瘤细胞：2-3天补液一次，维持细胞密度在1-1.5×106cell/mL，4-8天后，收集细胞悬液，200-400g离心5min，分别收集上清液和细胞；
c、上清液采用超滤系统浓缩，步骤：
培养液经0.45μm孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；
再经0.22μm孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；
得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤3h去除小分子物质，得到浓缩液；
d、下层细胞裂解：
下层细胞加HClO4裂解、离心，取上清液；
上清液加KOH中和，离心，取上清液；
加活性炭吸附白细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加NaCl溶液获得肿瘤细胞核苷酸成分；
e、按干重的质量比为1:1、1:5或5:1混合步骤d所得肿瘤细胞核苷酸成分和步骤c所得浓缩液获得制剂1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在共培养中，补液的密度为（1~2）×106cell/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，共培养的时间至少为14天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中PBMC的培养条件为：选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为（0.5~1）×106 cell/mL，37℃，5%CO2条件下培养2~4h。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞。
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