CN109536453B - 一种免疫细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种免疫细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109536453B
CN109536453B CN201811431529.3A CN201811431529A CN109536453B CN 109536453 B CN109536453 B CN 109536453B CN 201811431529 A CN201811431529 A CN 201811431529A CN 109536453 B CN109536453 B CN 109536453B
Authority
CN
China
Prior art keywords
numb
cell
immunocyte
albumen
numblike
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811431529.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109536453A (zh
Inventor
李兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Taidong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Taidong Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Taidong Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Taidong Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811431529.3A priority Critical patent/CN109536453B/zh
Publication of CN109536453A publication Critical patent/CN109536453A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109536453B publication Critical patent/CN109536453B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种免疫细胞及其制备方法和应用。一种免疫细胞，所述免疫细胞中Numb蛋白和/或Numb‑like蛋白不表达或低表达。Numb和Numblike是同源基因，这两个基因在肿瘤里面有比较多的研究，目前研究表明它们在癌细胞中是癌基因或抑癌基因，但其在免疫细胞里的作用目前研究非常少。本发明人发现，Numb和Numblike基因在免疫细胞中缺失，会增强免疫细胞的功能，特别是对于树突状细胞，增强抗肿瘤的免疫反应。

Description

一种免疫细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种免疫细胞及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤一直以来都是困扰全世界的重大疾病，严重危害人类健康。因此，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。目前，传统的三大主要治疗手段即手术治疗、化疗、放疗，这三大主要治疗手段虽然是全球肿瘤治疗的基本手段，但是其治疗效果非常有限。最近肿瘤的免疫疗法正在全世界兴起，为肿瘤患者带来了曙光。目前肿瘤免疫疗法所用的细胞主要是单核细胞、T细胞或树突状细胞或者是免疫细胞抑制分子阻断剂，如淋巴因子IL-2激活的T细胞或单核细胞；用肿瘤抗原(蛋白或多肽)处理激活的树突状细胞以及嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)；用于激活免疫细胞的免疫检查点抑制剂，如PD1/PD-L1、CTLA4抗体等。
这些方法存在的问题也正在被研究者发现，例如CAR-T治疗引起的细胞因子释放综合征、免疫细胞在肿瘤微环境中的耗竭、免疫检查点抑制剂在较大比例患者中无效等。而通过调节肿瘤微环境中免疫细胞的状态激活其抗肿瘤功能的研究是抗肿瘤免疫研究的一个全新领域，相关的研究报道非常少并集中在肿瘤微环境中的树突状细胞和T细胞。这些报道表明通过调节肿瘤微环境中免疫细胞的可以充分激活其抗肿瘤功能，寻找肿瘤微环境中免疫细胞新的特征，并进行靶向调节对肿瘤治疗具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了克服传统方法治疗恶性肿瘤的低效以及最近兴起免疫检查点抑制剂疗法有效比例较低的缺陷，提供一种具有治疗恶性实体瘤功能的免疫细胞及其应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种免疫细胞，所述免疫细胞中Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达。
Numb和Numblike是同源基因，这两个基因在肿瘤里面有比较多的研究，目前研究表明它们在癌细胞中是癌基因或抑癌基因，但其在免疫细胞里的作用目前研究非常少。
本发明人发现，Numb和Numblike基因在免疫细胞中缺失，会增强免疫细胞的功能，特别是对于树突状细胞，增强抗肿瘤的免疫反应。
本发明中的Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达的免疫细胞通过现有常规方法即可获得。
进一步地，所述免疫细胞中含有载体；
所述载体含有抑制以下蛋白表达的基因：
a)Numb蛋白；
b)Numb-like蛋白；
c)Numb蛋白和Numb-like蛋白；
或，
敲除以下基因的全部或部分：
a)Numb基因；
b)Numb-like基因；
c)Numb基因和Numb-like基因。
免疫细胞中Numb和Numblike基因缺失或抑制其表达通过基因工程手段进行处理。
进一步地，所述载体为慢病毒载体。一般慢病毒载体通过携带上述的序列，然后通过与免疫细胞共培养，然后将免疫细胞中相应的基因抑制表达或敲除，然后进行筛选，即可得到Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达的免疫细胞。
携带的序列根据手段的不同而不同，对Numb和Numblike基因的抑制表达或敲除可选用不同的手段，如，RNAi技术，CRISPR/Cas9技术等等。
进一步地，所述免疫细胞为分离的细胞和/或基因工程化的细胞。
本发明还提供了上述的免疫细胞的制备方法，通过基因敲除或基因干扰的方式使免疫细胞中的Numb蛋白和/或Numb-like蛋白低表达或不表达。
进一步地，将上述的载体转入所述免疫细胞中，筛选得到Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达的免疫细胞。
本发明还提供了上述的免疫细胞或Numb蛋白和/或Numb-like蛋白表达抑制剂或Numb蛋白和/或Numb-like蛋白与其他蛋白相互作用的抑制剂在提升宿主免疫活性中的应用。
进一步地，所述宿主为哺乳动物。
进一步地，所述宿主为灵长类动物。
进一步地，所述宿主为人类。
本发明还提供了上述的免疫细胞或Numb蛋白和/或Numb-like蛋白表达抑制剂或Numb蛋白和/或Numb-like蛋白与其他蛋白相互作用的抑制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤为恶性肿瘤。
进一步地，所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、恶性淋巴瘤。
本发明还提供了一种药物组合物，含有上述的免疫细胞；
和/或
含有抑制Numb蛋白和/或Numb-like蛋白表达的基因的载体；
和/或
阻止Numb蛋白和/或Numb-like蛋白与其他蛋白相互作用的阻断剂。
进一步地，所述阻断剂为抗体阻断剂。
进一步地，所述载体为纳米颗粒包裹的载体；
进一步地，所述载体被包裹于具有生物活性的病毒颗粒中。
进一步地，本发明提供的免疫细胞应用于治疗肿瘤，特别是恶性肿瘤。
肿瘤的治疗方法，包括给予受试者有效量的Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达的免疫细胞。
给药方式可以为口服、静脉注射或者是透皮渗透方式，施加于需要治疗的患者，具体可根据病人的病情、年龄等，由医师决定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明人发现，Numb和Numblike基因在免疫细胞中缺失，会增强免疫细胞的功能，增强抗肿瘤的免疫反应，达到更强的抗肿瘤效果。
(2)本发明提供了Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达的免疫细胞，克服传统方法治疗恶性肿瘤的低效以及最近兴起免疫检查点抑制剂疗法有效比例较低的缺陷。
(3)本发明提供了Numb蛋白和/或Numb-like蛋白不表达或低表达的免疫细胞的应用，为肿瘤的治疗提供新的手段以及理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中Numb和Numblike在树突状细胞中特异性敲除策略的示意图；
图2为本发明实施例1中共聚焦显微镜观察亚细胞定位图；
图3为本发明实施例1中流式设门圈出CD11c高表达且MHCⅡ阳性的成熟DC细胞图；
图4为本发明实施例1中Numb在非DC细胞膜表面表达情况图；
图5为本发明实施例1中Numb在DC细胞膜表面表达情况图；
图6为本发明实施例1中Numblike在非DC细胞膜表面表达情况图；
图7为本发明实施例1中Numblike在DC细胞膜表面表达情况图；
图8为本发明实施例1中不同细胞的表达蛋白的结果图；
图9为本发明实施例1中流式检测CD11c、MHC II、CD86表达水平结果图；
图10为本发明实施例1中luminex检测上清细胞因子含量的柱形图；
图11为本发明实施例2中Numb/Numblike敲除后DC诱导的CTL细胞对黑色素瘤细胞杀伤率的柱形图；
图12为本发明实施例2中Numb/Numblike敲除后DC诱导的CTL细胞吞噬抗原能力的流式检测图；
图13为本发明实施例2中Numb/Numblike敲除后DC刺激T细胞能力的结果图；
图14为本发明实施例3中携带不同基因的DC细胞对肿瘤重量的效果图；
图15为本发明实施例3中携带不同基因的DC细胞对肿瘤浸润淋巴细胞的含量结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、小鼠和细胞系
C57BL/6J(H-2Kb)小鼠购自上海实验动物中心，Numbf/f、Numblikef/f、Numb&Numblikef/f小鼠由同济大学医学院李华顺教授惠赠，CD11c-cre小鼠购自上海南方模式公司。将Numbf/f、Numblikef/f、Numb&Numblikef/f小鼠分别与CD11c-cre小鼠杂交传代获得NumbKO、NumblikeKO、Numb&NumblikeKO DC小鼠及各自同窝对照小鼠Numbf/f、Numblikef/f、Numb&Numblikef/f。示意图如图1所示。
1.1激光共聚焦观察Numb分子亚细胞定位
分离培养小鼠脾脏树突状细胞，加入LPS(1μl/ml)刺激，指定时间点收集细胞，离心后取细胞沉淀，重悬于100μl PBS中用抗小鼠FITC-CD11c荧光抗体标记15min，PBS洗3遍。2％多聚甲醛4℃固定30min,再用含5％BSA的打孔液封闭10min，再用抗Numb一抗4℃标记过夜，用打孔液洗3遍，接着用Alexa Fluor594荧光二抗标记1h，用打孔液洗3遍，再用水洗1遍，避光晾干，用90％中性甘油封片，用共聚焦显微镜观察亚细胞定位。结果如图2所示。
结果显示，Numb分布在成熟的DC细胞膜表面。
1.2流式细胞术检测细胞膜Numb和Numblike蛋白表达
收集脾脏单细胞悬液，用预冷的PBS溶液洗一遍后重悬于100μl PBS中，加入抗小鼠CD16/CD32抗体(1μg/ml)以消除非特异性结合，加入荧光素标记的抗体及相应的同型对照抗体至终浓度为1μg/ml，4℃标记30min，加入1ml预冷PBS洗两遍，重悬于200μl的PBS中，上机检测并分析。
以CD11c强阳性、MHCⅡ阳性设门圈出成熟的DC细胞，CD11c阴性设门圈出非DC细胞(图3)。流式设门圈出CD11c高表达且MHCⅡ阳性的成熟DC细胞。
进一步分析Numb和Numblike在DC细胞膜表面表达情况(图4-图7)。
图4-图5中，红色：脾脏细胞来源于Numb&Numblikef/f小鼠；蓝色：脾脏细胞来源于Numb&Numblikef/f CD11c-cre小鼠；虚线：阴性对照。
结果显示Numb蛋白定位于小鼠DC细胞膜表面，Numb&Numblikef/f CD11c-cre小鼠，膜表面的Numb蛋白可以有效敲除。
图6-图7中，红色：脾脏细胞来源于Numb&Numblikef/f小鼠；蓝色：脾脏细胞来源于Numb&Numblikef/f CD11c-cre小鼠；虚线：阴性对照。
结果显示，Numblike蛋白定位于小鼠DC细胞膜表面，Numb&Numblikef/f CD11c-cre小鼠，膜表面的Numblike蛋白可以有效敲除。
2、取6-8周杂交小鼠进行以下实验。
2.1DC细胞分离
无菌获取脾细胞悬液，经40μm细胞滤网过滤，红细胞裂解液破除红细胞后用1640培养液洗两遍获得脾脏细胞单细胞悬液。将获得的脾脏单细胞悬液利用美天旎MACS分选柱和CD11c细胞分选磁珠分选CD11c+DC细胞。流式细胞仪检测细胞分选纯度大于90％。脾脏细胞1×106cells/ml的细胞密度培养于1640完全培养液中，用1μg/ml脂多糖(LPS)刺激48小时。收取细胞培养上清检测细胞因子分泌，收集细胞进行Westernblot和流式检测。
关于脂多糖(LPS)刺激，进行以下说明：在研究早期，发明人首先观察到DC在没有被LPS刺激的情况下有过早活化的现象，所以，用LPS刺激来确认一下这个现象。对于未敲除基因的情况，如未敲除Numb基因，加入LPS后，DC开始活化，然后Numb表达增加，抑制DC过度活化；而Numb基因敲除后，由于没有Numb蛋白来进行抑制调控，DC活化的更强烈。
2.2骨髓来源DC诱导分化
颈椎脱臼法处死小鼠，75％乙醇浸泡10min，无菌取小鼠股骨及胫骨，以1ml注射器吸取1640培养基反复冲洗骨髓腔，40μm滤网过滤、裂解红细胞后收集骨髓单细胞悬液。将小鼠骨髓细胞重悬于含10ng/ml重组小鼠GM-CSF、1ng/ml重组小鼠IL-4以及10％FBS的1640培养液中，接种于6孔板，培养第2天换液，加入等量细胞因子继续培养。培养至第5天再用抗小鼠CD11c磁珠进行MACS分选，阳性细胞即为未成熟BMDC，进行下一步实验。
3、检测
3.1Western Blot检测胞内蛋白
收集脾脏DC细胞和骨髓诱导的DC细胞，用PBS洗一遍，加入适量含蛋白酶抑制剂的全细胞裂解液，冰浴30min后，以15000g 4℃离心10min，取上清。以BCA蛋白定量试剂盒测定以调整各样品蛋白浓度。于蛋白样品中加入6×上样缓95℃煮5min，将制备好的蛋白样品于-20℃冻存备用。Western Blot检测时，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的SDS-PAGE胶，取50μg蛋白进行电泳分离，然后将蛋白电转到硝酸纤维素膜上。用含5％BSA的TBST封闭2h，加入相应一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜三次，每次10min，后加入HRP一标记的相应二抗室温孵育1h,TBST洗膜三次，每次10min，最后用ECL法显影。结果如图8所示。
图8中，Numb&Numblikef/f为未敲除目的基因的样本，而Numb&Numblikef/f CD11c为已敲除目的基因的样本。从图8中可以看出，对于未敲除目的基因的样本，加入LPS刺激后，DC开始活化，然后Numb表达增加，以抑制DC过度活化。而对于已敲除目的基因的样本，则没有Numb表达。
从图8可以看出，DC中Numb蛋白得到有效敲除。
3.2LPS刺激DC细胞
体外诱导的DC给予LPS刺激(1μg/ml)，24小时后收取细胞及培养上清，流式检测CD11c、MHC II、CD86表达水平，结果如图9所示。MHC II和CD86的表达水平均明显增强。
luminex检测上清中GM-CSF、IFN-g、IL-1b、IL-12p70、IL-13、IL-18、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-a、ENA-78、G-CSF、IFN-a、IL-1a、IL-15/IL-15R、IL-28、IL-3、IL-31、LIF、M-CSF、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23、IL-27、IL-9、Eotaxin、GRO-a、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIP-1a、MIP-1b、MIP-2、RANTES水平。部分结果如图10所示。图10中，黑色柱形是未敲除Numb/Numblike的检测结果，而灰色柱形是敲除Numb/Numblike的检测结果。
可以看出，Numb/Numblike敲除后DC分泌更高水平的细胞因子。
实施例2
1、抗原负载的DC-CTL细胞
1.1黑色素瘤细胞培养及抗原制备
黑色素瘤细胞B16F10用DMEM培养基(含10％FBS)培养于37℃，5％CO2培养箱中，每2-3天传代，收集处于对数生长期的B16F10细胞，使用无菌生理盐水调整细胞浓度为2×107/ml，使用液氮反复冻融3次，0.45μm过滤，得到全肿瘤抗原备用。
1.2DC抗原负载
将上述Numb/Numblike敲除后的DC细胞调整细胞密度为1×106/ml，加入肿瘤细胞抗原(DC:肿瘤细胞＝1:10，个数比)，对照组仅加培养基。于37℃，5％CO2条件下孵育48h，加入10μg/ml的TNF-α，继续培养48h，收集细胞和上清待用。
1.3抗原负载的DC诱导CTL细胞
无菌获取脾细胞悬液，经40μm细胞滤网过滤，红细胞裂解液破除红细胞后用1640培养液洗两遍获得脾脏细胞单细胞悬液。将获得的脾脏单细胞悬液利用小鼠淋巴细胞分离液分离脾脏单核细胞，以上述负载抗原的DC以DC：单核细胞＝1：10的比例共培养于6孔板中，3天后收集细胞。
2、实验检测
2.1肿瘤细胞杀伤实验
取对数生长期的黑色素瘤细胞B16F10，经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为1×106个/mL，接种于96孔板中。按照实验分组分别取实验组和对照组，以5:1，10:1，20:1和50:1的效靶比接种效应细胞和靶细胞，同时设置空白对照组，在每一效靶比下均设置3个复孔。于37℃，5％CO2条件下孵育48h。利用CCK8试剂盒检测杀伤效果。使用以下公式分算细胞杀伤率：杀伤率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。
结果如图11所示。Numb/Numblike敲除后DC诱导的CTL细胞更有效杀伤黑色素瘤细胞。
2.2DC抗原吞噬实验
将上述DC细胞调整细胞密度为1×105/ml，加入96孔板中，每孔200μL，加入OVA-FITC至浓度1μg/ml。实验组于37℃，5％CO2条件下孵育1h，阴性对照于冰上孵育1h，收集细胞用流式细胞仪检测。
结果如图12所示。Numb/Numblike敲除后DC吞噬抗原能力增强。
2.3混合淋巴细胞实验(MLR)
用磁珠分选法anti-CD3microbeads(Miltenyi Biotech)从小鼠脾脏中分选CD3+T细胞。经磁珠分选纯化的CD3+T细胞以3×107/ml的细胞浓度重悬于PBS中，加入CFSE至2.5μM置于37℃孵育10min，加入含10％FBS的1640培养液终止反应洗两遍。在同种异体DC和T细胞共培养实验中，96孔板每孔加入T细胞(1×10)，然后按照10:1(T：DC)的比例加入同种异体的经过相应处理的DC细胞。7天后用流式检测CFSE荧光强度从而反映T细胞的增殖情况，从而反映DC对T细胞的活化作用。
结果如图13所示。Numb/Numblike敲除后DC刺激T细胞能力增强。
实施例3
小鼠皮下黑色素瘤模型构建及细胞治疗
收集对数生长期的B16F10细胞，用适量PBS重悬，使其密度为1×107cells/mL。
取100μL细胞悬液接种于C57小鼠。在接种B16F10细胞之后第5天，给荷瘤小鼠尾静脉注射1×106个脾脏来源的DC或骨髓来源的DC以及对照DC，同时也设置了一组注射PBS的阴性对照组。接种过B16F10后的第27天处死小鼠，进行后续实验分析，包括肿瘤重量测量以及肿瘤浸润淋巴细胞含量检测。结果如图14和15所示。
图14中，敲除Numb和Numblike蛋白的树突状细胞可以有效抑制肿瘤的生长。
图15中，敲除Numb和Numblike蛋白的树突状细胞治疗后的小鼠肿瘤浸润淋巴细胞含量明细增加。
另外，DC细胞替换为NKT细胞、DC细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、T细胞中的任一种仍能达到与DC细胞效果一致的结果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (4)

1.免疫细胞在制备治疗抗黑色素瘤药物中的应用；所述免疫细胞为DC细胞，且所述免疫细胞中Numb蛋白和Numb-like蛋白不表达或低表达。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞中含有载体；
所述载体含有抑制Numb蛋白和Numb-like蛋白表达的基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为分离的细胞和/或基因工程化的细胞。
CN201811431529.3A 2018-11-23 2018-11-23 一种免疫细胞及其制备方法和应用 Active CN109536453B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811431529.3A CN109536453B (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种免疫细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811431529.3A CN109536453B (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种免疫细胞及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109536453A CN109536453A (zh) 2019-03-29
CN109536453B true CN109536453B (zh) 2019-10-25

Family

ID=65850582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811431529.3A Active CN109536453B (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种免疫细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109536453B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898053A (zh) * 2012-12-27 2014-07-02 深圳先进技术研究院 稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Normal hemopoiesis and lymphopoiesis in the combined absence of numb and numblike;Wilson, A等;《JOURNAL OF IMMUNOLOGY》;20070601;第178卷(第11期) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109536453A (zh) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103756963B (zh) 一种体外扩增nk细胞的方法
CN105238754B (zh) 一种高增殖力和高杀伤力nk细胞的体外培养方法
CN105087488A (zh) 一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用
CN114507640B (zh) 一种高增殖能力和高细胞毒性cik细胞的培养方法及其应用
JP3619853B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の増殖方法
CN106222141A (zh) Nk细胞培养液和细胞培养方法
CN105018427B (zh) 一种增强ctl免疫反应的dc细胞培养方法
CN105524884A (zh) Hla-a0201限制性抗afp抗原特异性ctl的制备方法
CN109486758A (zh) 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明
CN104480069A (zh) 一种利用外周血分离培养免疫细胞的方法
CN104491857B (zh) 一种用于免疫治疗ebv相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法
CN107532146A (zh) 通过使用ifn的非贴壁培养制备树突状细胞的方法
CN105505871A (zh) 一种有效扩增cik且提高其特异性杀瘤能力的方法
CN105219713A (zh) 用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力nk细胞
CN102353794A (zh) 筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法
CN109536453B (zh) 一种免疫细胞及其制备方法和应用
CN106565828B (zh) 诱导dc-cik细胞的多肽及其在肿瘤细胞治疗中的应用
CN104651313A (zh) 级联激活的免疫细胞、制备方法以及应用
CN105132372B (zh) 一种诱导dc-cik细胞的化合物在肿瘤细胞免疫治疗中的应用
CN105219727A (zh) 一种用于激活结直肠癌特异性免疫反应的试剂盒
CN105219723A (zh) 一种用于激活胃癌特异性免疫反应的试剂盒
CN105219728A (zh) 一种用于激活乳腺癌特异性免疫反应的试剂盒
CN107779435A (zh) 一种含有自体cik细胞的共培养上清液及其应用
CN106119192B (zh) 组合物及其在cik细胞培养中的应用
Tian et al. A novel methodology of the myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) generation with splenic stroma feeder cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant