CN107779435A - 一种含有自体cik细胞的共培养上清液及其应用 - Google Patents

一种含有自体cik细胞的共培养上清液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有自体CIK细胞的共培养上清液及其应用，其中，所述含有自体CIK细胞的共培养上清液由以下方法制备得到，所述具体方法为：(1)自体CIK细胞培养至第十四天，自体CIK细胞浓度达到1‑5×106个/ml，离心，分别得上清液1和底层细胞1；(2)所述底层细胞1加生理盐水洗涤离心，得底层细胞2；(3)将步骤(1)所得的上清液1再经过离心，弃底层絮状沉淀，得上清液2；(4)向步骤(3)所述上清液2和步骤(2)所述底层细胞2混合，加入生理盐水，人血白蛋白，硫酸庆大霉素，制成细胞混悬液，即得所述含有自体CIK细胞的共培养上清液。自体CIK细胞合成分泌的天然细胞因子对于增强免疫功能、解除骨髓抑制和免疫抑制及提高自体CIK细胞抗肿瘤作用更显著。

Description

一种含有自体CIK细胞的共培养上清液及其应用
技术领域
本发明属于生物领域，特别涉及一种含有自体CIK细胞的共培养上清液及其应用。
背景技术
免疫细胞生物学和免疫分子生物学的进展，推进了免疫学在肿瘤治疗中的应用。现今，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的基本手段之一，其中细胞介导的过继免疫治疗为当前研究的热点之一。通过给肿瘤患者输入特异性的或非特异性的具有抑制肿瘤细胞生长的免疫效应细胞，可直接杀伤肿瘤细胞，或在患者体内诱发机体免疫反应，达到抑制和治疗肿瘤的目的。目前有关肿瘤免疫效应细胞的研究和临床的初步资料提示，细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,自体CIK)细胞是一种新型、高效的具有广谱杀瘤活力的MHC非限制性的免疫效应细胞，具有增殖速度快、杀伤活性高、临床应用副作用小等优点，是目前发现的杀瘤活性最强的免疫效应细胞之一，在肿瘤免疫治疗中显露巨大应用价值。
自体CIK细胞在培养过程中，产生一系列的因子并分泌于培养上清液中，这些细胞因子通过直接或间接的方式作用于肿瘤细胞，产生抗肿瘤活性。IL-6是迄今为止发现的功能最为广泛的细胞因子之一，参与调节免疫反应、血细胞的生成及多种细胞的增殖和分化。IFN-γ具有较强的免疫调节和抗细胞增强作用，对常规药物治疗无效的疾病或体质较弱、免疫功能低下的病人，用本品治疗或进行辅助治疗，往往可收到较好的效果。TNF-α是肿瘤坏死因子，它可以促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症反应的发生。GM-CSF是集落刺激因子中最重要的一种造血因子，对多系造血祖细胞如红系、巨噬系、粒单系、嗜酸系等造血前体细胞都有刺激增殖和分化的作用，并能影响成熟髓系细胞的功能。在临床上主要用于各种因素引起的白细胞减少症、骨髓移植、再障、艾滋病等治疗。
自体CIK细胞的培养上清液能够有效地阻断SARS病毒感染非洲绿猴肾源E6细胞，推测自体CIK细胞可能是在诱导和培养过程中表达了某些重要的细胞因子而抑制病毒的增殖和感染性，这为治疗SARS疾病提示了一种可能途径。自体CIK细胞的高效肿瘤抑制活性在临床试验中已经得到广泛认可，但有关其细胞因子类别和表达水平的研究还未有系统报道。
自体CIK细胞在培养过程中，产生一系列的因子并分泌于培养上清液中，这些细胞因子通过直接或间接的方式作用于肿瘤细胞，产生抗肿瘤活性。至今多数研究仅关注一种或少数几种细胞因子的临床作用，但已开始出现混合细胞因子的临床应用报导，他们采用PHA刺激人外周血单核细胞的方式来培养收获上清液用于抗肿瘤应用，该混合细胞因子可改变肿瘤细胞的细胞周期，从而提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。
专利CN 101333515A公开了用D自体CIK细胞培养的上清液及其应用，该技术方案通过下列方法制备得到的，该方法的具体步骤为：DC与自体CIK细胞混合诱导第9天后，D自体CIK细胞进入大量扩增制备的阶段；当培养液中的D自体CIK细胞浓度达到1～5×106个/ml时，将混合均匀的D自体CIK细胞连同培养上清液一分为二，并另加入等体积的新鲜培养基，继续培养；如此反复至第12-26天时，收集D自体CIK细胞培养的上清液，该上清液提高抗肿瘤作用。
目前，将含有自体CIK细胞的共培养上清液制成细胞混悬液用于抗肿瘤作用还未见报道。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的问题，本发明的目的提供了含有自体CIK细胞的共培养上清液及其应用，提高自体CIK细胞抗肿瘤作用更显著。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种含有自体CIK细胞的共培养上清液，其中，所述含有自体CIK细胞的共培养上清液由以下方法制备得到，所述具体方法为：(1)自体CIK细胞培养至第十四天，自体CIK细胞浓度达到1-5×106个/ml，离心，分别得上清液1和底层细胞1；(2)所述底层细胞1加生理盐水洗涤离心，得底层细胞2；(3)将步骤(1)所得的上清液1再经过离心，弃底层絮状沉淀，得上清液2；(4)向步骤(3)所述上清液2和步骤(2)所述底层细胞2混合，加入生理盐水，人血白蛋白，硫酸庆大霉素，制成细胞混悬液，即得所述含有自体CIK细胞的共培养上清液。
上述的一种含有自体CIK细胞的共培养上清液，其中，所述方法还包括(1)包被抗人CD3单克隆抗体的培养瓶的预处理；(2)外周血单个核细胞的分离提取与初培养；(3)自体CIK细胞的扩增培养。
上述的一种含有自体CIK细胞的共培养上清液，其中，步骤(3)自体CIK细胞的扩增培养采用含有IL-2 1000U/ml，20％灭活血浆的RPMI-1640。
上述的含有自体CIK细胞的共培养上清液在制备抗肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明所提供的含有自体CIK细胞的共培养上清液，达到了如下技术效果：(1)含有自体CIK细胞的共培养上清液具有很高的生物学活性，提高自体CIK细胞抗肿瘤作用；(2)激活后的自体CIK细胞分泌的天然细胞因子相比较基因工程重组得到的同类细胞因子，理论上，具有生物活性更强、生物学功能更完整等优点；(3)自体CIK细胞合成分泌的天然细胞因子对于增强免疫功能、解除骨髓抑制和免疫抑制及提高自体CIK细胞抗肿瘤作用更显著；(4)现有技术中自体CIK细胞培养过程中因为添加了一些激素类培养基来刺激细胞生长，这样细胞长得很快数量多，但是上清液中就残留了这些培养基，所以不能用于人体；而本发明采用了含有IL-2 1000U/ml，20％灭活血浆的RPMI-1640的培养基，所用细胞因子属于药用级别，血浆来源自体，所以可以用于人体；(5)含有自体CIK细胞的共培养上清液中分泌的细胞因子对于维持自体CIK细胞的快速增殖和保持自体CIK细胞的抗肿瘤活性具有特别重要的意义。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例一含有自体CIK细胞的共培养上清液的制备方法
1、包被抗人CD3单克隆抗体的培养瓶的预处理
包被抗人CD3单克隆抗体的培养瓶，倒去培养瓶中的包被缓冲液，用无菌的0.9％生理盐水洗涤一次，再用RPMI-1640培养基洗涤一次备用。
2、外周血单个核细胞的分离提取与初培养
采取肝素抗凝的外周血50ml，缓慢均匀加入已加入淋巴分离液的离心管中，低速水平离心机转速1500r/min，离心20min。分离后收集血浆56度水浴灭活，提取单个核细胞层，用生理盐水洗涤2次。收集外周血单个核细胞于离心管中，用RPMI-1640培养基悬浮并调整细胞密度为3-5×106cell/ml，接种到固相包被抗人CD3单克隆抗体的25cm2的细胞培养瓶中。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、自体CIK细胞的扩增培养
3.1配制自体CIK细胞培养液：在RPMI-1640培养基中添加1000U/ml的重组人IL-2，20％灭活自体血浆，刺激自体CIK细胞的生长和增殖；
3.2每2d根据细胞计数结果加入自体CIK细胞培养液或扩瓶一次；
3.3在培养的第14d收获自体CIK细胞。
4、制备含有自体CIK细胞的共培养上清液：
4.1自体CIK细胞培养至第十四天，自体CIK细胞浓度达到1-5×106个/ml，1200rpm离心7min，分别得上清液1和底层细胞1；
4.2底层细胞1加0.9％生理盐水45ml洗涤，1000rpm离心7min，得底层细胞2；
4.3将上清液1经过高速离心，即15000rpm离心25min，弃底层絮状沉淀，得上清液2；
4.4将上清液2和底层细胞2混合，取0.9％生理盐水60ml，加入4ml人血白蛋白(10g/50ml)，2ml硫酸庆大霉素(8万单位)，制成细胞混悬液100ml，即含有自体CIK细胞的共培养上清液。
实施例二含有自体CIK细胞的共培养上清液的质量控制
细菌检测
自体CIK细胞培养全程跟踪无菌监控，分别在第0天、第7天、第9天、第11天、第14天取样接种于羊血琼脂平板培养基，作细菌检测，每天观察菌落情况，结果如表1。
表1含有自体CIK细胞的共培养上清液细菌检测表
样品 A A A A A
接种时间 第0天 第7天 第9天 第11天 第14天
接种一天菌落数 0 0 0 0 0
接种二天菌落数 0 0 0 0 0
霉菌检测
自体CIK细胞培养至第七天，取6个样品，分别接种于琥红平板培养基，检测培养的含有自体CIK细胞的共培养上清液有没有霉菌感染，每天观察霉斑情况，结果见表2。
表2含有自体CIK细胞的共培养上清液霉菌检测表
样品编号 1 2 3 4 5 6
接种时间 第7天 第7天 第7天 第7天 第7天 第7天
接种第四天霉斑 0 0 0 0 0 0
接种第七天霉斑 0 0 0 0 0 0
支原体检测
自体CIK细胞培养至第十二天，需对培养含有自体CIK细胞的共培养上清液进行支原体检测，避免含有自体CIK细胞的共培养上清液含有致病微生物。检测方法用支原体培养检测试剂盒，检测结果见表3。
表3含有自体CIK细胞的共培养上清液支原体检测表
样品编号 阴性对照 样品
加样时间 第12天 第12天
24小时观察 无变化 无变化
48小时观察 无变化 无变化
结果判断 阴性 阴性
衣原体检测
自体CIK细胞培养至第十二天，需对培养含有自体CIK细胞的共培养上清液进行衣原体检测，避免含有自体CIK细胞的共培养上清液含有致病微生物。检测方法用衣原体检测试剂盒，检测结果见表4。
表4含有自体CIK细胞的共培养上清液衣原体检测表
样品编号 1 质控
加样时间 第12天 第12天
观察结果 无变化 无变化
结果判断 阴性 阴性
内毒素检测
自体CIK细胞培养至第十二天，需对培养含有自体CIK细胞的共培养上清液进行内毒素检测，避免含有自体CIK细胞的共培养上清液含有致病物质。检测方法用鲎试剂，检测结果见表5。
表5含有自体CIK细胞的共培养上清液内毒素检测表
样品编号 1 2 3 4 5 6
加样时间 第12天 第12天 第12天 第12天 第12天 第12天
观察结果 不凝固 不凝固 不凝固 不凝固 不凝固 不凝固
结果判断 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
由表1-表5结果显示，含有自体CIK细胞的共培养上清液培养过程质量稳定，未受到感染，符合后续试验的进行。
实施例三含有自体CIK细胞的共培养上清液分泌的细胞因子检测
分别对培养过程中第0天，第4天，第6天，第8天，第10天，第12天，第14天的自体CIK细胞培养上清液用ELISA试剂盒检测细胞因子，检测结果见表6。
表6含有自体CIK细胞的共培养上清液不同时间分泌的细胞因子检测表
天数 IL-6 IFN-γ TNF-α GM-CSF
0天 9.8 4.6 5.8 7.8
2天 643.2 1365.7 108.3 231.6
4天 6924.3 38413.3 406.3 968.1
6天 15045.9 123328.9 1093.1 2092.7
8天 21306.5 176032.5 2499.5 3923.6
10天 20234.6 195320.3 2205.2 4032.9
12天 18345.1 182003.2 1973.3 3503.6
14天 14553.2 163846.3 1608.8 3073.5
本发明分别对培养过程中第0天，第4天，第6天，第8天，第10天，第12天，第14天的含有自体CIK细胞的共培养上清液中的细胞因子分析检测，表6结果显示诱导激活后的自体CIK细胞主要可大量合成分泌GM-CSF，IL-6，TNF-α，IFN-γ等细胞因子，这些由激活后自体CIK细胞分泌的天然细胞因子相比较基因工程重组得到的同类细胞因子，具有生物活性更强、生物学功能更完整等优点。
实施例四含有自体CIK细胞的共培养上清液对动物体内抗肿瘤活性实验
肿瘤模型：取18只6周龄体重18-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹部注射接种前列腺癌PC-3细胞1×106个，接种后均见肿瘤块生长，即肿瘤模型成功。
将肿瘤BALB/c小鼠随机分成三组，分别为空白组、对照组、含有自体CIK细胞的共培养上清液组；空白组：0.9％生理盐水、对照组：自体CIK细胞溶于0.9％生理盐水、自体CIK细胞的共培养上清液组：自体CIK细胞溶于共培养上清液；每组各6只小鼠，三组均在接种前列腺癌PC-3细胞后于第4天、第6天、第8天、第10天、第12天分别静脉注射空白、对照、含有自体CIK细胞的共培养上清液0.1ml，其中对照组与含有自体CIK细胞的共培养上清液组中的自体CIK细胞为5×106个/0.1ml。于治疗后第42天解剖各组小鼠，取瘤块、称重、测量瘤块体积大小。(实验结果见表7、表8、表9)
表7治疗肿瘤BALB/c小鼠前瘤体大小(mm2)
表8治疗肿瘤BALB/c小鼠6W后瘤体大小(mm2)
表9治疗肿瘤BALB/c小鼠6W后瘤体重量(g)
表7结果显示，治疗前列腺癌PC-3BALB/c小鼠前，空白组、对照组、含有自体CIK细胞的培养上清液组的瘤体大小分布均匀；表8、表9结果显示，在治疗第42天即6W后，空白组的瘤体增大，瘤体重量大，而对照组和含有自体CIK细胞的培养上清液组的瘤体大小及重量没有显著的变化，说明自体CIK细胞、含有自体CIK细胞的共培养上清液均对荷瘤小鼠体内的PC-3肿瘤细胞具有强烈的杀伤和抑制作用，但是含有自体CIK细胞的共培养上清液对PC-3肿瘤细胞的杀伤和抑制作用更强，相比于自体CIK细胞的抗肿瘤活性有显著性差异(P<0.05)。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种含有自体CIK细胞的共培养上清液，其特征在于，所述含有自体CIK细胞的共培养上清液主要由以下方法制备得到，所述方法包括：(1)自体CIK细胞培养至第十四天，自体CIK细胞浓度达到1-5×106个/ml，离心，分别得上清液1和底层细胞1；(2)所述底层细胞1加生理盐水洗涤离心，得底层细胞2；(3)将步骤(1)所得的上清液1再经过离心，弃底层絮状沉淀，得上清液2；(4)向步骤(3)所述上清液2和步骤(2)所述底层细胞2混合，加入生理盐水，人血白蛋白，硫酸庆大霉素，制成细胞混悬液，即得所述含有自体CIK细胞的共培养上清液。
2.根据权利要求1所述的一种含有自体CIK细胞的共培养上清液，其特征在于，所述方法还包括(1)包被抗人CD3单克隆抗体的培养瓶的预处理；(2)外周血单个核细胞的分离提取与初培养；(3)自体CIK细胞的扩增培养。
3.根据权利要求2所述的一种含有自体CIK细胞的共培养上清液，其特征在于，步骤(3)自体CIK细胞的扩增培养采用含有IL-2 1000U/ml，20％灭活血浆的RPMI-1640。
4.一种根据权利要求1-3任意一项所述的含有自体CIK细胞的共培养上清液在制备抗肿瘤治疗药物中的应用。
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