CN114807029A - Cik细胞的分离制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CIK细胞的分离制备方法，涉及生物制药领域，针对现有CIK细胞分离效率缓慢、研发成本高等问题，现提出如下方案，抽取少量人体血液收集存放正常室温环境中，将血液吸取分别装入盛有淋巴分离液的离心管中，随后离心，吸除血浆得到淋巴细胞层细胞，并装入试剂管中。本发明中培养的CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞能够大量扩增繁殖，且细胞活性也有所增强增强，并且本发明中的CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用，同时本发明中采用的材料，化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分离效率高，且分离方式能够为生物制药等相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。

Description

CIK细胞的分离制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及CIK细胞的分离制备方法。
背景技术
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性，由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力。
由于CIK细胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长或白发变黑等“年轻化”表现，及精神状态或体力明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量，延长生存期，同时在现有的CIK细胞分离制备手段中，大多数的分离制备方法复杂且成本高，同时培养出来的CIK细胞强度以及培养过程中的扩增细胞数量较少，无法满足医用大批量的生产，为解决以上的技术性问题，现提出CIK细胞的分离制备方法。
发明内容
（一）发明目的
CIK细胞的分离制备方法，具备培养的CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞能够大量扩增繁殖，且细胞活性也有所增强增强，并且本发明中的CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用，同时本发明中采用的材料，化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分离效率高，且分离方式能够为生物制药等相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。
（二）技术方案
本发明提供了，CIK细胞的分离制备方法，具有如下的步骤：
抽取少量人体血液收集存放正常室温环境中，将血液吸取分别装入盛有淋巴分离液的离心管中，随后离心，吸除血浆得到淋巴细胞层细胞，并装入试剂管中，将生理盐水溶液加入到试剂管中混合均匀后离心并洗涤，弃上清后转入培养瓶中培养，培养瓶中导入CIK细胞混合因子继续培养，培养完成后进行内毒素检测，收集CIK细胞至离心杯中离心，结束后弃上清，将细胞收集配合生理盐水清洗收集，将收集的细胞置于生理盐水中，抽取人血蛋白加入到细胞悬液中，获得分离后的CIK细胞。
作为本发明一种优选的方案，所述少量人体血液为外周血且通过肝素瓶收集存放在35~37℃区间的室内；
具体的，外周血抽取在55~70ml。
作为本发明一种优选的方案，所述人体血液需要放在淋巴分离液的上层，且淋巴分离液采用15ml~20ml。
作为本发明一种优选的方案，所述生理盐水溶液为庆大霉素生理盐水溶液，且庆大霉素生理盐水溶液保持在145IU/ml~165IU/ml。
作为本发明一种优选的方案，所述CIK细胞混合因子为1ml~1.5ml，且最终浓度为50～100ng/ml。
作为本发明一种优选的方案，所述离心管中盛有50ml~60ml区间的0.9%生理盐水。
本发明还提供了：CIK细胞的分离制备过程中的具体培养方法：
Ⅰ将盛有CIK细胞的培养瓶放置在饱和湿度37℃、5.0%二氧化碳环境中培养；
Ⅱ将CIK细胞培养到第三至第五天时，利用光学显微镜观察CIK细胞的生长状态，将扩增的CIK细胞装入到另一个培养瓶中，并保持培养瓶中的培养环境为恒温且正常的湿度和二氧化碳含量；
Ⅲ培养至第五到第八天时，利用光学显微镜观察细胞生长状态，将传代扩增的CIK细胞装入到3~6个培养瓶中继续培养；
Ⅳ培养至第九到第十天时，观察CIK细胞生长状态继续传代培养扩增为10瓶以上；
Ⅴ培养至第十一到第十二天时，观察CIK细胞生长状态，随即取样抽取1ml细胞培养液置于离心管中送检，然后继续传代扩增至更多的培养瓶中，记录信息后做细菌检测；
Ⅵ培养至第十四到第十五天时，观察细胞生长状态后，取样培养液做细胞活数统计并进行内毒素检测，如检测符合标准收集10~12瓶CIK细胞至离心杯中，在正常室温情况下离心5~10分钟。
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
本发明中培养的CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞能够大量扩增繁殖，且细胞活性也有所增强增强，并且本发明中的CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用，同时本发明中采用的材料，化学成分稳定，生物研发成本低，安全性高，分离效率高，且分离方式能够为生物制药等相关领域提供质量稳定良好的细胞，具有较高的商用和药用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提出的CIK细胞的分离制备方法中实施例一细胞扩增示意图；
图2为本发明提出的CIK细胞的分离制备方法中实施例二细胞扩增示意图；
图3为本发明提出的CIK细胞的分离制备方法中实施例三细胞扩增示意图。
具体实施方式
下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。在本发明中，术语“分化”描述了非特化细胞通过其而获得特化细胞（例如皮肤、心脏、肌肉、造血细胞）的特征的过程，“定向分化”指操作干细胞培养条件来诱导分化成特定的细胞类型。
在本发明中，术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的。
在本发明中，术语“治疗”是指在伤害或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症状。
在本发明中，术语“患者”或“对象”是指用药物组合物或根据本文所述的方法治疗的动物，包括哺乳动物，例如，鼠、犬、马、牛、猿或人类，特别是人类。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：CIK细胞的分离制备方法：
抽取55~70ml人体外周血且通过肝素瓶收集存放在35~37℃区间的室内，将血液吸取分别装入盛有淋巴分离液的离心管中，人体血液需要放在淋巴分离液的上层，且淋巴分离液采用15ml~20ml，随后离心，吸除血浆得到淋巴细胞层细胞，并装入试剂管中，将145IU/ml~165IU/ml的庆大霉素生理盐水溶液加入到试剂管中混合均匀后离心并洗涤，弃上清后转入培养瓶中培养，培养瓶中导入1ml~1.5ml且最终浓度为50～100ng/ml的CIK细胞混合因子继续培养，培养完成后进行内毒素检测，收集CIK细胞至离心杯中并将离心杯中离心管中盛有50ml~60ml区间的0.9%生理盐水离心，结束后弃上清，将细胞收集配合生理盐水清洗收集，将收集的细胞置于生理盐水中，抽取人血蛋白加入到细胞悬液中；
将盛有CIK细胞的培养瓶放置在饱和湿度37℃、5.0%二氧化碳环境中培养，将CIK细胞培养到第三至第五天时，利用光学显微镜观察CIK细胞的生长状态，将扩增的CIK细胞装入到另一个培养瓶中，并保持培养瓶中的培养环境为恒温且正常的湿度和二氧化碳含量，培养至第五到第八天时，利用光学显微镜观察细胞生长状态，将传代扩增的CIK细胞装入到3~6个培养瓶中继续培养，培养至第九到第十天时，观察CIK细胞生长状态继续传代培养扩增为10瓶以上，培养至第十一到第十二天时，观察CIK细胞生长状态，随即取样抽取1ml细胞培养液置于离心管中送检，然后继续传代扩增至更多的培养瓶中，记录信息后做细菌检测，培养至第十四到第十五天时，观察细胞生长状态后，取样培养液做细胞活数统计并进行内毒素检测，如检测符合标准收集10~12瓶CIK细胞至离心杯中，在正常室温情况下离心5~10分钟得到分离后制备的CIK细胞。
实施例二：其在实施例一的基础上，外周血变动为骨髓血液。
具体的，抽取70~90ml人体骨髓血液经过溶血剂反复清洗后，利用吸管抽取骨髓且通过盛有生理盐水的肝素瓶收集得到骨髓悬浊液，将骨髓悬浊液吸取装入离心管中，随后离心，并装入试剂管中，将145IU/ml~165IU/ml的庆大霉素生理盐水溶液加入到试剂管中混合均匀后离心并洗涤，弃上清后转入培养瓶中培养，培养瓶中导入1ml~1.5ml且最终浓度为50～100ng/ml的CIK细胞混合因子继续培养，培养完成后进行内毒素检测，收集CIK细胞至离心杯中并将离心杯中离心管中盛有50ml~60ml区间的0.9%生理盐水离心，结束后弃上清，将细胞收集配合生理盐水清洗收集，将收集的细胞置于生理盐水中，抽取人血蛋白加入到细胞悬液中；
将盛有CIK细胞的培养瓶放置在饱和湿度37℃、5.0%二氧化碳环境中培养，将CIK细胞培养到第三至第五天时，利用光学显微镜观察CIK细胞的生长状态，将扩增的CIK细胞装入到另一个培养瓶中，并保持培养瓶中的培养环境为恒温且正常的湿度和二氧化碳含量，培养至第五到第八天时，利用光学显微镜观察细胞生长状态，将传代扩增的CIK细胞装入到3~6个培养瓶中继续培养，培养至第九到第十天时，观察CIK细胞生长状态继续传代培养扩增为10瓶以上，培养至第十一到第十二天时，观察CIK细胞生长状态，随即取样抽取1ml细胞培养液置于离心管中送检，然后继续传代扩增至更多的培养瓶中，记录信息后做细菌检测，培养至第十四到第十五天时，观察细胞生长状态后，取样培养液做细胞活数统计并进行内毒素检测，如检测符合标准收集10~12瓶CIK细胞至离心杯中，在正常室温情况下离心5~10分钟得到分离后制备的CIK细胞。
实施例三：其在实施例一的基础上，外周血变动为脐带血；
具体的，无菌采集正常足月产新生儿脐带血置于血液保存液中，6~8小时内进行分离，按4:1体积比加入羟乙基淀粉，静置40～60分钟，去除沉淀的红细胞，收集富含有核细胞的血浆，PBS洗涤2次，利用IMDM培养液洗涤两次后，将细胞接种于培养板，并导入1ml~1.5ml且最终浓度为50～100ng/ml的CIK细胞混合因子继续培养，装入培养箱中培养；
将细胞培养到第三至第五天时，利用光学显微镜观察细胞的生长状态，将扩增的细胞装入到另一个培养瓶中，并保持培养瓶中的培养环境为恒温且正常的湿度和二氧化碳含量，培养至第五到第八天时，利用光学显微镜观察细胞生长状态，将传代扩增的细胞装入到3~6个培养瓶中继续培养，培养至第九到第十天时，观察细胞生长状态继续传代培养扩增为10瓶以上，培养至第十一到第十二天时，观察细胞生长状态，随即取样抽取1ml细胞培养液置于离心管中送检，然后继续传代扩增至更多的培养瓶中，记录信息后做细菌检测，培养至第十四到第十五天时，观察细胞生长状态后，取样培养液做细胞活数统计并进行内毒素检测，如检测符合标准收集10~12瓶细胞至离心杯中，在正常室温情况下离心5~10分钟得到分离后制备的CIK细胞。
实验例：对比实施例1~3，结合CIK细胞的扩增生长率以及细胞强度进行实验得出以下的直观表现。（见图1~图3）。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.CIK细胞的分离制备方法，具有如下的步骤：
S1：抽取少量人体血液收集存放正常室温环境中；
S2：将血液吸取分别装入盛有淋巴分离液的离心管中，随后离心，吸除血浆得到淋巴细胞层细胞，并装入试剂管中；
S4：将生理盐水溶液加入到试剂管中混合均匀后离心并洗涤，弃上清后转入培养瓶中培养；
S5：培养瓶中导入CIK细胞混合因子继续培养；
S6：培养完成后进行内毒素检测，收集CIK细胞至离心杯中离心，结束后弃上清，将细胞收集配合生理盐水清洗收集；
S7：将收集的细胞置于生理盐水中，抽取人血蛋白加入到细胞悬液中，置于培养瓶中培养数日后获得分离后的CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的CIK细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的少量人体血液为外周血且通过肝素瓶收集存放在35~37℃区间的室内；
优选的方案，外周血抽取在55~70ml。
3.根据权利要求1所述的CIK细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的人体血液需要放在淋巴分离液的上层，且淋巴分离液采用15ml~20ml。
4.根据权利要求1所述的CIK细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的生理盐水溶液为庆大霉素生理盐水溶液，且庆大霉素生理盐水溶液保持在145IU/ml~165IU/ml。
5.根据权利要求1所述的CIK细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S5中的CIK细胞混合因子为1ml~1.5ml，且最终浓度为50～100ng/ml。
6.根据权利要求1所述的CIK细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S6中的离心管中盛有50ml~60ml区间的0.9%生理盐水。
7.根据权利要求1-6任一项所述的CIK细胞的分离制备方法，其特征在于，还包括CIK细胞的培养步骤：
步骤1：将盛有CIK细胞的培养瓶放置培养；
步骤2：将CIK细胞培养到第三至第五天时，利用光学显微镜观察CIK细胞的生长状态，将扩增的CIK细胞装入到另一个培养瓶中继续培养；
步骤3：培养至第五到第八天时，利用光学显微镜观察细胞生长状态，将传代扩增的CIK细胞装入到3~6个培养瓶中继续培养；
步骤4：培养至第九到第十天时，观察CIK细胞生长状态继续传代培养扩增为10瓶以上；
步骤5：培养至第十一到第十二天时，观察CIK细胞生长状态，随即取样送检，记录信息后做细菌检测；
步骤6：培养至第十四到第十五天时，观察细胞生长状态后，取样培养液做细胞活数统计并进行内毒素检测，如检测符合标准收集离心。
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