CN103800898B - 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法，本发明的特异性杀伤细胞为DC疫苗，CIK，CTL细胞的混合物，所述制剂含有胸腺五肽，将其和杀伤细胞混合具有明显提高治疗效果的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗新技术，特别涉及一种初始T细胞来源的新型肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）制剂及其制备方法。
背景技术
中国专利2012101271586描述了一种效应细胞制备方法，即应用CD4+和CD8+混合的初始T细胞，制备DC-CIK-CTL效应细胞，同时提供一种应用复合制剂对肿瘤微环境进行干扰，从而打破肿瘤免疫耐受，在此基础上进行效应细胞回输治疗的新技术。其中DC-CIK-CTL效应细胞的制备方法是：外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞则进一步分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1：1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增至第7天制备CIK。半数细胞移瓶后加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml0.9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是：环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
但实验发现使用该方法，临床有效率虽然有所提高，但还未达到理想程度，为此本发明人对上述方法进行了改进，取得了意想不到的技术效果。
发明内容
本发明的主要目的在于：解决目前DC-CIK-CTL方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。
为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞制剂及其制备方法。
本发明的制剂包括肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）和胸腺五肽。
本发明提供一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞以及胸腺五肽，其中胸腺五肽加入量为5mg。
本发明的制剂，所述肿瘤特异性杀伤细胞，制备方法采：
外周血单状核细胞采集：
应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，
DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞，
DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗，
初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1）、应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD4+TcellisolationkitII,human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用，
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD8+Tcellisolationkit,human试剂盒说明书分两步进行分选，第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二部，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用，
2）、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的Plus进行分选，Plus细胞分选系统包括CliniMACSPlus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除，使用Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗，
将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1：1混合备用，
CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50%的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养，
CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL，
高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次去除细胞碎片，得到肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）。
因此本发明的制剂，含有肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）和胸腺五肽，根据需要还可以加入1%的2.0g人血白蛋白，使用时将其溶解在250ml0.9%氯化钠输液中，输入到患者体内。
本发明的另一个内容是，用本发明的细胞制剂治疗肿瘤病人，其方法是将本发明制备的制剂回输到肿瘤病人体内。
本发明还包括制备一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用环磷酰胺CTX，注射用CTX，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的，该制剂的制备方法依据制剂学常规技术制备即可，如制备成水针或粉针，也可直接制备成输液剂。以上制剂的剂量范围分别为可一次性用于病人的剂量，如静脉注射用CTX一次用量为400-600mg/m2，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9%氯化钠或5%-10%的葡萄糖注射液中给病人输注。
本发明的细胞制剂和干扰微环境制剂的使用方法如下：
环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
本发明的制剂的制备方法是将：肿瘤特异性杀伤细胞和胸腺五肽，人血白蛋白，以及0.9%氯化钠输液混合而成。
本发明将肿瘤特异性杀伤细胞和胸腺五肽联合使用，回输给患者，两者作用互补，起到协同增效作用，对肿瘤的杀伤效率大大提高。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果：
采用不同方法进行B16黑色素瘤的荷瘤小鼠抗肿瘤体内实验。
| 肿瘤体积mm3 | |
| 不加胸腺五肽的制剂 | 700 |
| 本发明制剂 | 400 |
另外还进行了以下实验：
B16小鼠恶黑细胞株造模后2天，分别应用PBS、DC疫苗、总T-CTL、不加胸腺五肽的制剂，本发明制剂腹腔注射治疗，7天重复治疗，本发明制剂组抑瘤效果显著高于其他组。
抑瘤效果比较表
实验结果显示，本发明的疗效优于现有技术。
以上内容可以证明，本发明具有更加优良的治疗效果。
胸腺五肽(TP-5)是人工合成的五肽(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr),对应胸腺生成素的32至36位氨基酸序列,具有天然胸腺生成素的全部生物活性。作为一种免疫调节药物在临床上已有多年应用历史，可以用作肿瘤的辅助治疗，本发明通过在肿瘤特异性杀伤细胞DC-CIK-CTL的制剂配制过程中加入胸腺五肽意外的发现其具有增加肿瘤杀伤功效的作用，其效果远优于不加胸腺五肽组。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1、采血前注意事项：
因为放化疗会在较大程度上影响外周血和骨髓初始T细胞的含量和功能，所以，根治手术后或晚期肿瘤病人放化疗结束后1个月采集外周血单状核细胞较为适宜。外周血白细胞数量较低时，可应用注射用重组人粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）皮下注射进行骨髓动员。多发骨髓转移或骨髓造血功能低下的肿瘤病人，外周血初始T细胞含量和功能较差，不宜实施外周血单状核细胞采集。
2、外周血单状核细胞采集：
应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清（方法：加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清），4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层（单状核细胞）。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）。
3、DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞（待初始T细胞分选），剩余贴壁细胞即为DC细胞。
4、DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml（含GM-CSF50ug/500ml，IL-430ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天。第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml（自体肿瘤相关抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备细胞裂解物，过网后蛋白定量），次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗。
5、初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1）、应用美国BD（Becton，Dickinson）、美国R&D（ResearchandDevelopmentSystem）、或德国美天旎（MiltenyiBiotec）等公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选。建议采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响。
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD4+TcellisolationkitII,human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗（包括anti-CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD45RO、CD56、CD123、TCRγ/δ、HLA-DR及CD235a）作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用。
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD8+Tcellisolationkit,human试剂盒说明书分两步进行分选。第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗（包括anti-CD45RO、CD56、CD57及CD244）作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞。第二部，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用。
2）、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的Plus进行分选。Plus细胞分选系统包括CliniMACSPlus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除。使用Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选。分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗。
按说明书步骤，将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体。然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选。总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞。将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1：1混合备用。
6、CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml（含IFN-γ1000U/ml；庆大霉素2万单位/500ml），将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。次日，补充50%的CIK培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位）。第5天补充IL-2培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含IL-215ug，庆大霉素2万单位）。以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
5、CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL。
6、高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次去除细胞碎片，加入1%人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成DC-CIK-CTL细胞制剂，静脉回输。
Claims (1)
1.一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞DC-CIK-CTL以及胸腺五肽；其中肿瘤特异性杀伤细胞总数量控制为1-2×109，加入1%人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成肿瘤特异性杀伤细胞制剂。
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