CN107475186A - 一种间充质干细胞制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞制备方法，其包括：1)将血液样本和细胞分离液加入分离培养罐中进行细胞分离；2)对细胞进行分选以获得间充质干细胞；3)将间充质干细胞转移至分离培养罐，向分离培养罐中加入微载体以使间充质干细胞贴附微载体生长；4)向分离培养罐中加入培养基，排出分离培养罐中的废液，并向分离培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；5)收集获得的间充质干细胞终产品，进行细胞洗涤后包装。该间充质干细胞制备方法利用能够增大贴壁面积的微载体培养间充质干细胞，有效降低制备间充质干细胞时所需的空间，利于间充质干细胞实现大规模生产。

Description

一种间充质干细胞制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种间充质干细胞制备方法。

背景技术

间充质干细胞是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。

目前，间充质干细胞体外培养采用培养瓶或培养皿进行培养，为了培养大量的细胞，需要很大的表面积，因此需要大量的培养瓶和培养空间。但是，实际生产中受场地等因素限制，导致难以实现大规模生产。

综上，如何使间充质干细胞能够大规模生产，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种间充质干细胞制备方法，其利用能够增大贴壁面积的微载体培养间充质干细胞，能过有效降低制备间充质干细胞时所需的空间，利于间充质干细胞实现大规模生产。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种间充质干细胞制备方法，用于全封闭的间充质干细胞制备设备，包括：

1)将血液样本和细胞分离液加入分离培养罐中进行细胞分离；

2)对细胞进行分选以获得间充质干细胞；

3)将间充质干细胞转移至所述分离培养罐，向所述分离培养罐中加入微载体以使所述间充质干细胞贴附所述微载体生长；

4)向所述分离培养罐中加入培养基，排出所述分离培养罐中的废液，并向所述分离培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；

5)收集获得的间充质干细胞终产品，进行细胞洗涤后包装。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，所述步骤2)包括：

21)将分离产生的单个核细胞于所述分离培养罐中进行细胞洗涤；

22)向所述分离培养罐中加入带有间充质干细胞对应标志物抗体的磁珠孵育预设时间；

23)使所述磁珠排出所述分离培养罐再进行磁分选以获得间充质干细胞。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，所述步骤3)中“将间充质干细胞转移至所述分离培养罐”和“向所述分离培养罐中加入微载体以使所述间充质干细胞贴附所述微载体生长”之间还包括：

采集所述分离培养罐内的间充质干细胞样品进行计数和质量监测。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，进行所述步骤3)时需向所述分离培养罐中加入所述间充质干细胞制备培养所需的培养基和细胞因子。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，所述微载体是先经过水化处理后于培养基内浸泡充分的微载体。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，所述步骤4)为：每间隔预设时间采集分离培养罐中间充质干细胞进行质量检测和计数，按照细胞计数结果和间充质干细胞最适生长密度，排出分离培养罐中的废液，补充加入新鲜培养基和微载体，以维持间充质干细胞扩增所需新鲜营养物质和贴附空间。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，进行所述步骤3)以及所述步骤4)时需要控制所述分离培养罐的温度为37℃，使用氮气/二氧化碳比例为95％/5％的混合气体调整分离培养罐气体供应条件为低氧环境，所述低氧环境为：N₂浓度为90％至93％，CO₂浓度为5％，O₂浓度为2％至5％；进行所述步骤3)和所述步骤4)时需利用与所述分离培养罐连通的气体浓度传感器来分别监测分离培养罐中N₂、CO₂、O₂的浓度。

优选的，上述间充质干细胞制备方法中，所述步骤5)包括：

51)提取间充质干细胞样品进行计数和质量监测，并在监测结果为合格时进入步骤52)；

52)将所述分离培养罐中的培养基排出；

53)向所述分离培养罐内加入生理盐水进行洗涤，再将形成的上清液排出；加入消化酶以使间充质干细胞与所述微载体脱离；

54)收集间充质干细胞终产品并进行洗涤和包装，使所述微载体排至废液袋，

本发明提供一种间充质干细胞制备方法，用于全封闭的间充质干细胞制备设备，其包括：1)将血液样本和细胞分离液加入分离培养罐中进行细胞分离；2)对细胞进行分选以获得间充质干细胞；3)将间充质干细胞转移至分离培养罐，向分离培养罐中加入微载体以使间充质干细胞贴附微载体生长；4)向分离培养罐中加入培养基，排出分离培养罐中的废液，并向分离培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；5)收集获得的间充质干细胞终产品，进行洗涤后包装。

本发明提供的间充质干细胞制备方法利用能够增大贴壁面积的微载体培养间充质干细胞，有效降低制备间充质干细胞时所需的空间，利于间充质干细胞实现大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的间充质干细胞制备方法的流程图；

图2为本发明实施例提供的间充质干细胞制备设备的结构示意图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种间充质干细胞制备方法，其利用能够增大贴壁面积的微载体培养间充质干细胞，能过有效降低制备间充质干细胞时所需的空间，利于间充质干细胞实现大规模生产。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-图2，本发明实施例提供一种间充质干细胞制备方法，用于全封闭的间充质干细胞制备设备，其包括如下步骤：

1、将血液样本和细胞分离液加入分离培养罐中进行细胞分离。

进行该步骤时需要将血液样本以及细胞分离液加入分离培养罐中，并使分离培养罐以800G离心力离心15-30分钟，从而进行物理学密度梯度离心分离。

具体的，将样品通过管路加入分离培养罐中，然后利用生理盐水将残留在管路中的样品冲进分离培养罐；再启动分离培养罐，使其以800G离心力离心15min-30min，之后抽取分层界面上的部分通过管路转至中转袋，再将该管路中残留的细胞用生理盐水冲至中转袋；

2、对细胞进行分选以获得间充质干细胞。

该步骤具体包括：

21)将分离产生的单个核细胞于分离培养罐中进行1-2次细胞洗涤；

进行该步骤前需先将分离培养罐中经上述细胞分离步骤产生的废液转移至废液袋，再将中间转袋中的细胞转移至分离培养罐中；上述细胞洗涤是向分离培养罐中加入生理盐水进行洗涤；优选的，进行细胞洗涤的过程中可抽取细胞样品进行计数和质量监测；

22)向分离培养罐中加入带有间充质干细胞对应标志物抗体的磁珠孵育预设时间；上述预设时间设置为10min-20min；

该步骤22)和后续步骤23)之间还包括步骤223)向分离培养管中加入生理盐水，使分离培养罐以500G离心力转动10min，以洗涤细胞；然后将分离培养罐中的废弃上清液抽至废液袋，以除去未结合的磁珠；

23)使磁珠排出分离培养罐再进行磁分选以获得间充质干细胞；

上述磁分选由间充质干细胞制备设备上的磁分选部件和管路中的分选柱结合进行免疫学磁珠分选；进行磁分选过程中需将使蠕动泵(蠕动泵用于将分离培养罐中的带细胞的液体输送至上述磁分选部件)速度慢，以确保目的细胞(即间充质干细胞)因磁场作用留在分选柱中而不是被液体带走至非目的细胞袋中。

3、将间充质干细胞转移至分离培养罐，向分离培养罐中加入微载体以使间充质干细胞贴附微载体生长。

进行该步骤前需先除去磁分选部件处的磁场；上述将间充质干细胞转移至分离培养罐具体指向磁分选部件处加入生理盐水以洗脱目的细胞并携带目的细胞转至分离培养罐；具体的，目的细胞转移至分离培养罐后先采集间充质干细胞样品进行计数和质量监测，再向分离培养罐中加入微载体；

该步骤3中除加入微载体外还需同时向分离培养罐中加入间充质干细胞制备培养所需的培养基和细胞因子；另外该步骤中微载体的接种密度为10mg微载体/2×10⁵个细胞/1ml培养基；使间充质干细胞贴附微载体生长过程中需控制分离培养罐的转速在预设范围(40转/分钟-60转/分钟)内，以将间充质干细胞黏附贴壁过程中剪切力的影响降至最低，也确保细胞在微载体上得到充分贴附。

4、向分离培养罐中加入培养基，排出分离培养罐中的废液，并向分离培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增。

步骤4)具体为：每间隔预设时间(24小时)采集分离培养罐中间充质干细胞样品进行质量检测和计数，按照细胞计数结果和间充质干细胞最适生长密度，排出分离培养罐中的废液，补充加入新鲜培养基和微载体，以维持间充质干细胞扩增所需新鲜营养物质和贴附空间。

上述“按照细胞计数结果和间充质干细胞最适生长密度，排出分离培养罐中的废液，补充加入新鲜培养基和微载体，以维持间充质干细胞扩增所需新鲜营养物质和贴附空间”为：按照每次计数结果绘制出目前细胞的生长曲线，将该生产曲线与间充质干细胞标准生长曲线比对，若间充质干细胞实际生长增殖速度较慢，则立即离心去除分离培养罐中现有培养基，再按照间充质干细胞最适生长密度加入新鲜的培养基；若细胞生长增殖速度快，则补充新鲜的细胞培养基。

具体的，去除分离培养罐中现有的培养基需先使分离培养罐暂停转动3-5分钟，以使贴附细胞的微载体沉降，防止上述微载体随培养基排出分离培养罐外。

上述微载体是先经过水化处理后于培养基内浸泡充分的微载体。

5、收集获得的间充质干细胞终产品，进行细胞洗涤后包装。

该步骤5)包括：

51)提取间充质干细胞样品进行计数和质量监测，并在监测结果为合格时进入步骤52)；

52)将分离培养罐中的培养基排出，具体排至废液袋；

53)向分离培养罐内加入生理盐水进行洗涤，洗涤时分离培养罐以500G离心力转动10min；再将形成的上清液排出分离培养罐至废液袋；加入消化酶以使间充质干细胞与微载体脱离；

步骤53)中洗涤是为了去除大部分培养基；上述加入消化酶后需使分离培养罐快速搅拌(80转/分钟-130转/分钟)20-30分钟，以让贴壁的间充质干细胞充分脱落下来，避免消化时间过长对细胞的影响；结束后先使分离培养罐离心(400G离心力离心5分钟)排尽带消化酶的生理盐水，再向分离培养罐中加入新的生理盐水进行洗涤(500G离心力离心5分钟)，缓慢转动分离培养罐(40转/分钟-60转/分钟)，让微载体沉淀，细胞体积小沉淀速度相对较慢。

54)收集间充质干细胞终产品并进行包装，使微载体排至废液袋。

上述间充质干细胞终产品为步骤53)中与微载体脱离的细胞；该步骤54具体为：将分离培养罐中上清液内细胞(即间充质干细胞终产品)排至中转袋，再次洗涤分离培养罐以及分离培养罐与中转袋之间的管路，确保细胞极大部分收集，然后将微载体排出分离培养罐至废液袋，用生理盐水冲洗分离培养罐，再将中转袋中的细胞转至分离培养罐洗涤，使分离培养罐以500G离心力转动5分钟，最后将分离培养罐中的细胞收集到终产品袋中进行包装，具体是应用热合封管机封管，获得间充质干细胞终产品。

具体的，进行上述步骤3)以及步骤4)时需要控制分离培养罐的温度为37℃，CO₂浓度为5％，使用氮气/二氧化碳比例为95％/5％的混合气体调整分离培养罐气体供应条件为低氧环境，所述低氧环境为：N₂浓度为90％至93％，CO₂浓度为5％，O₂浓度为2％至5％；进行所述步骤3)和所述步骤4)时需利用与所述分离培养罐连通的气体浓度传感器来分别监测分离培养罐中N₂、CO₂、O₂的浓度。

如上间充质干细胞制备方法具体由间充质干细胞制备设备实施，该间充质干细胞制备设备包括生理盐水袋、中转袋，以及用于连接各袋的管路等，管路上设有管压阀1-21，如图2所示，该间充质干细胞制备设备实施上述间充质干细胞制备方法时通过控制各个管压阀的开闭进行各个步骤，本实施例不再赘述。由于采用充质干细胞制备设备实施上述方法，所以步骤1前还包括步骤0：预冲间充质干细胞制备设备的管路。

另外，上述间充质干细胞制备方法中，细胞的质量监测由间充质干细胞制备设备的中央数据处理器自动完成，中央数据处理器预置专家数据库系统，质量监测时拍摄细胞的图片并针对每一次采集到的图像进行比对和判断。

本发明实施例提供的间充质干细胞制备方法利用能够增大贴壁面积的微载体培养间充质干细胞，有效降低制备间充质干细胞时所需的空间，利于间充质干细胞制备实现大规模生产。

并且，上述细胞制备方法中具有多个对细胞进行质量监测的步骤，能够在各个环节保证细胞质量，利于提高间充质干细胞终产品的品质；并且上述质量监测的步骤以过程检验的方式实现间充质干细胞制备质量的各个环节监控，分环节获取细胞制备流程中的细胞图像信息(包括细胞形态、灰度、密度、荧光染色情况等)，既可用于各类外源因子的检测、细胞形态学的检查，也可用于细胞数量、细胞活性等质量数据的分析，以联机方式实现细胞制备质量监测的数据共享，远程高效完成间充质干细胞制备过程的质量监控。

再者，上述间充质干细胞制备方法中所有操作由间充质干细胞制备设备的中央数据处理器精确控制，该设备的六个内部控制分系统协助完成，提升了制备的自动智能化的同时，大大降低了人工干预操作，实现细胞制备过程的自动标准化操作，消除了人工因素的干扰，能够提高间充质干细胞终产品的质量。

如上制备方法用于全封闭的间充质干细胞制备设备，大大减少了培养瓶的使用数量，也降低了被微生物污染的风险。进一步的，上述制备方法具体应用于全封闭且全自动处理的间充质干细胞制备设备，该具有全自动处理功能的间充质干细胞制备设备将复杂的细胞制备实验室工作整合到一个平台中，采用六工位方式独立同时进行细胞制备培养，集合细胞分离，细胞分选，细胞诱导激活，细胞培养扩增，细胞质量检测，细胞洗涤收集包装等多功能于一体，所有操作全部由中央数据处理器精确控制，六个内部控制分系统协助完成，针对间充质干细胞等贴壁细胞的体外大规模制备，通过利用微载体进行培养，共享某些重要功能部件如细胞质量检测功能部件、气体供应功能部件等，确保每一批细胞都是在同等标准条件下制备，相对于现有的细胞制备自动化设备而言，提升了数倍细胞制备效率，实现间充质干细胞的体外大规模制备。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种间充质干细胞制备方法，其特征在于，用于全封闭的间充质干细胞制备设备，包括：

1)将血液样本和细胞分离液加入分离培养罐中进行细胞分离；

2)对细胞进行分选以获得间充质干细胞；

3)将间充质干细胞转移至所述分离培养罐，向所述分离培养罐中加入微载体以使所述间充质干细胞贴附所述微载体生长；

4)向所述分离培养罐中加入培养基，排出所述分离培养罐中的废液，并向所述分离培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；

5)收集获得的间充质干细胞终产品，进行细胞洗涤后包装。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括：

21)将分离产生的单个核细胞于所述分离培养罐中进行细胞洗涤；

22)向所述分离培养罐中加入带有间充质干细胞对应标志物抗体的磁珠孵育预设时间；

23)使所述磁珠排出所述分离培养罐再进行磁分选以获得间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3)中“将间充质干细胞转移至所述分离培养罐”和“向所述分离培养罐中加入微载体以使所述间充质干细胞贴附所述微载体生长”之间还包括：

采集所述分离培养罐内的间充质干细胞样品进行计数和质量监测。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，进行所述步骤3)时需向所述分离培养罐中加入所述间充质干细胞制备培养所需的培养基和细胞因子。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述微载体是先经过水化处理后于培养基内浸泡充分的微载体。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤4)为：每间隔预设时间采集分离培养罐中间充质干细胞进行质量检测和计数，按照细胞计数结果和间充质干细胞最适生长密度，排出分离培养罐中的废液，补充加入新鲜培养基和微载体，以维持间充质干细胞扩增所需新鲜营养物质和贴附空间。

7.根据权利要求1所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，进行所述步骤3)以及所述步骤4)时需要控制所述分离培养罐的温度为37℃，使用氮气/二氧化碳比例为95％/5％的混合气体调整分离培养罐气体供应条件为低氧环境，所述低氧环境为：N₂浓度为90％至93％，CO₂浓度为5％，O₂浓度为2％至5％；进行所述步骤3)和所述步骤4)时需利用与所述分离培养罐连通的气体浓度传感器来分别监测分离培养罐中N₂、CO₂、O₂的浓度。

8.根据权利要求1所述的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤5)包括：

51)提取间充质干细胞样品进行计数和质量监测，并在监测结果为合格时进入步骤52)；

52)将所述分离培养罐中的培养基排出；

53)向所述分离培养罐内加入生理盐水进行洗涤，再将形成的上清液排出；加入消化酶以使间充质干细胞与所述微载体脱离；

54)收集间充质干细胞终产品并进行洗涤和包装，使所述微载体排至废液袋。