CN107267456A - 一种nk细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NK细胞的制备方法，其包括：1)将血液样本和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞；2)对上述单个核细胞进行分选以纯化NK细胞；3)在分离培养罐中对NK细胞进行诱导培养；4)于分离培养罐内对NK细胞进行扩增培养；5)获得NK细胞终产品，进行洗涤和包装。该NK细胞的制备方法中，利用分离培养罐制备NK细胞，相比于现有技术中利用培养皿体外培养NK细胞的方式，其步骤规范，更便于实现NK细胞的大规模生产。

Description

一种NK细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种NK细胞的制备方法。

背景技术

NK(natural killer，自然杀伤)细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

目前，NK细胞的体外培养仅是采用培养皿盛装培养基进行培养，培养过程过无规范流程，难以实现NK细胞的大规模培养。

综上所述，如何提供一种适用于NK细胞的制备方法，以便于实现NK细胞的大规模生产，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种NK细胞的制备方法，其利用分离培养罐制备NK细胞，步骤规范，便于实现NK细胞的大规模生产。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种NK细胞的制备方法，用于全封闭的NK细胞制备设备，包括：

1)将血液样本和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞；

2)对所述单个核细胞进行分选以纯化NK细胞；

3)在所述分离培养罐中对所述NK细胞进行诱导培养；

4)于所述分离培养罐内对所述NK细胞进行扩增培养；

5)获得NK细胞终产品，进行洗涤和包装。

优选的，上述制备方法中，所述步骤1)中分离培养罐以800G离心力转动15min-30min。

优选的，上述制备方法中，所述步骤2)包括：

21)对离心分离获得的单个核细胞进行洗涤；

22)加入带有NK细胞对应标志物抗体的磁珠以对所述分离培养罐中的单个核细胞进行孵育；

23)使所述磁珠排出所述分离培养罐再进行磁分选以纯化NK细胞。

优选的，上述制备方法中，所述步骤3)为：向所述分离培养罐中加入所述NK细胞所需的诱导培养基和细胞因子。

优选的，上述制备方法中，进行所述步骤3)时需维持所述分离培养罐中温度为37℃，CO₂浓度为5％。

优选的，上述制备方法中，所述步骤4)为：排出所述分离培养罐中的废液，向所述分离培养罐中加入培养基。

优选的，上述制备方法中，进行所述步骤4)时需每间隔预设时间采集所述分离培养罐内的NK细胞进行样品进行计数和质量监测，并根据计数结果先排出废液，再按细胞最适生长密度添加培养基。

优选的，上述制备方法中，所述步骤5)包括：

51)提取分离培养罐中的NK细胞样品进行计数和质量监测，并在监测结果为合格时进入步骤52)；

52)使所述分离培养罐离心转动以收集NK细胞，排出所述分离培养罐中的培养基排出；

53)向所述分离培养罐内加入生理盐水并使所述分离培养罐离心转动进行细胞洗涤，排出洗涤用的生理盐水上清液；

54)收集NK细胞终产品，进行包装。

本发明提供一种NK细胞的制备方法，用于全封闭的NK细胞制备设备，其包括：1)将血液样本和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞；2)对上述单个核细胞进行分选以纯化NK细胞；3)在分离培养罐中对NK细胞进行诱导培养；4)于分离培养罐内对NK细胞进行扩增培养；5)获得NK细胞终产品，进行洗涤和包装。

上述NK细胞的制备方法中，利用分离培养罐制备NK细胞，相比于现有技术中利用培养皿体外培养NK细胞的方式，其步骤规范，更便于实现NK细胞的大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的NK细胞的制备方法的流程图；

图2为本发明实施例提供的NK细胞的制备设备的结构示意图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种NK细胞的制备方法，其利用分离培养罐制备NK细胞，步骤规范，便于实现NK细胞的大规模生产。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-图2，本发明实施例提供一种NK细胞的制备方法，用于全封闭的NK细胞制备设备，其包括：

1、将血液样本和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞。

该步骤中分离培养罐以800G离心力转动15min-30min进行物理学密度梯度分离。分离结束后需将废液袋转移至废液袋。

2、对上述单个核细胞进行分选以纯化NK细胞。该步骤包括：

21)对离心分离获得的单个核细胞进行洗涤；

洗涤是向分离培养罐中加入生理盐水，然后使分离培养罐以预设离心力转动预设时间，结束后将上清液抽至废液袋中；具体操作时该洗涤步骤需进行1-2次；

22)加入带有NK细胞对应标志物抗体的磁珠以对分离培养罐中的单个核细胞进行孵育；孵育需进行10min-20min，孵育结束后需向分离培养罐中加入生理盐水进行洗涤以去除未结合的磁珠；

23)使所述磁珠(指已结合的磁珠)排出分离培养罐再进行磁分选以纯化NK细胞；

上述磁分选于带有分选柱的磁分选部件处进行，上述已结合的磁珠缓慢通过磁分选部件，并且结合有NK细胞的磁珠停留于分选柱，未结合NK细胞的磁珠排至非目的细胞袋内。

以上步骤23)之后还包括：24)移去磁分选部件处的磁场以获得高纯度的NK细胞，将NK细胞转移至分离培养罐中，并在转移完成后采集分离培养罐中NK细胞样品进行计数和质量监测。

3、在分离培养罐中对NK细胞进行诱导培养。

该步骤具体为向分离培养罐中加入NK细胞所需的诱导培养基和细胞因子，并维持分离培养罐中环境温度为37℃，CO₂浓度为5％。

4、于分离培养罐内对NK细胞进行扩增培养。

该步骤为向分离培养罐中加入培养基，排出分离培养罐中的废液。具体操作时，需在分离培养罐中NK细胞接种细胞因子后每间隔预设时间(具体为24小时)采集分离培养罐内NK细胞样品进行计数和质量监测，并根据计数结果先排出废液，再按细胞最适生长密度添加培养基，如：若监测结果为NK细胞生长过慢，则先使分离培养罐以500G离心力离心5min-10min后抽取分离培养罐中的培养基至废液袋，再向分离培养罐中加入新鲜的培养基和细胞因子；若监测结果为NK细胞生长较快，则向分离培养罐中加入新鲜的培养基和细胞因子。

在体外培养细胞中，细胞接种数对细胞的生长有影响，适宜的接种密度，可以促使细胞增殖，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖；如果培养液与细胞的容积比例大于2000:1，生长物质弥散到细胞外的比例将是细胞内达到低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养液中的pH变碱，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等；如果接种密度太高，每个细胞周围培养液的容积降至0.007mm³以下，由于弥散率的降低，细胞内生物质的浓度增加，容易使排除物或其他代谢产物达到饱和，能量来源也很快耗尽，因此也会妨碍细胞的增殖；

上述NK细胞的最适生长密度根据其代谢和生长繁殖速度以及工作的需要而确定。具体进行步骤4)的过程中需使分离培养罐维持温度为37℃，CO₂浓度为5％。

5、获得NK细胞终产品，进行洗涤和包装。该步骤包括：

51)提取分离培养罐中的NK细胞样品进行计数和质量监测，并在监测结果为合格时进入步骤52)；

52)将分离培养罐中的培养基排出；

具体先使分离培养罐以500G离心力离心5min-10min，然后排尽培养液至废液袋中；

53)向分离培养罐内加入生理盐水对NK细胞进行洗涤，再将形成的上清液排出；

该步骤中洗涤时分离培养罐以500G离心力离心5min-10min，且洗涤需进行1-2次；

54)收集NK细胞终产品，进行包装。包装具体使对用于盛装NK细胞终产品的包装袋采用热合封管机封管。

如上NK细胞的制备方法由专门的NK细胞生产设备自动实施，该NK细胞生产设备包括生理盐水袋、废液袋和分离培养罐，以及用于连接个各部件的管路，管路上设有管压阀1-21，NK细胞制备过程中通过控制各个管压阀的开闭即可实现液体于不同的部件之间流转，避免人为因素的干扰，大大降低细胞的污染风险，能够确保NK细胞的质量，且无需提供GMP(生产质量管理规范)环境，减小环境投入，利于降低成本。由于采用NK细胞制备设备实施上述制备方法，故步骤1之前还包括步骤0：对NK细胞制备设备的管路进行预冲洗。

另外，上述细胞制备方法中，细胞的质量监测由NK细胞制备设备的中央数据处理器自动完成，其上述中央数据处理器预置专家数据库系统，质量检测时拍摄细胞的图片并针对每一次采集到的图像进行比对和判断。

显然，本发明实施例提供的NK细胞制备方法利用分离培养罐制备NK细胞，相比于现有技术中人工利用培养皿体外培养NK细胞的方式，其步骤规范，更便于实现NK细胞的大规模生产。

并且，上述细胞制备方法中具有多个对细胞进行质量监测的步骤，能够在各个环节保证细胞质量，利于提高NK细胞终产品的合格率；再者，上述质量检测的步骤以过程检验的方式实现NK细胞制备质量的各个环节监控，分环节获取细胞制备流程中的细胞图像信息(包括细胞形态、灰度、密度、荧光染色情况等)，既可用于各类外源因子的检测、细胞形态学的检查，也可用于细胞数量、细胞活性等质量数据的分析，以联机方式实现细胞制备质量检测的数据共享，远程高效完成NK细胞制备过程的质量监控。

上述NK细胞制备方法中所有操作由NK细胞制备设备的中央数据处理器精确控制，该设备的六个内部控制分系统协助完成，提升了制备的自动智能化的同时，大大降低了人工干预操作，实现细胞制备过程的自动标准化操作，消除了人工因素的干扰，能够提高NK终产品的质量，提高生产效率。

如上制备方法用于全封闭的NK细胞制备设备，大大减少了培养瓶的使用数量，也降低了被微生物污染的风险。进一步的，上述制备方法具体应用于全封闭且全自动处理的NK细胞制备设备，该具有全自动处理功能的NK细胞制备设备将复杂的细胞制备实验室工作整合到一个平台中，采用六工位方式独立同时进行细胞制备培养，集合细胞分离，细胞分选，细胞诱导培养，细胞扩增培养，细胞质量检测，细胞洗涤收集包装等多功能于一体，所有操作全部由中央数据处理器精确控制，六个内部控制分系统协助完成，针对NK细胞的体外大规模制备，共享某些重要功能部件如细胞质量检测功能部件、气体供应功能部件等，确保每一批细胞都是在同等标准条件下制备，相对于现有的细胞制备自动化设备而言，提升了数倍细胞制备效率，实现间NK细胞的体外大规模制备。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，用于全封闭的NK细胞制备设备，包括：

1)将血液样本和等体积的淋巴细胞分离液加入分离培养罐中进行离心分离以获得单个核细胞；

2)对所述单个核细胞进行分选以纯化NK细胞；

3)在所述分离培养罐中对所述NK细胞进行诱导培养；

4)于所述分离培养罐内对所述NK细胞进行扩增培养；

5)获得NK细胞终产品，进行洗涤和包装。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中分离培养罐以800G离心力转动15min-30min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括：

21)对离心分离获得的单个核细胞进行洗涤；

22)加入带有NK细胞对应标志物抗体的磁珠以对所述分离培养罐中的单个核细胞进行孵育；

23)使所述磁珠排出所述分离培养罐再进行磁分选以纯化NK细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)为：向所述分离培养罐中加入所述NK细胞所需的诱导培养基和细胞因子。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，进行所述步骤3)时需维持所述分离培养罐中温度为37℃，CO₂浓度为5％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)为：排出所述分离培养罐中的废液，向所述分离培养罐中加入培养基。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，进行所述步骤4)时需每间隔预设时间采集所述分离培养罐内的NK细胞样品进行计数和质量监测，并根据计数结果先排出废液，再按细胞最适生长密度添加培养基。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)包括：

51)提取分离培养罐中的NK细胞样品进行计数和质量监测，并在监测结果为合格时进入步骤52)；

52)使所述分离培养罐离心转动以收集NK细胞，排出所述分离培养罐中的培养基排出；

53)向所述分离培养罐内加入生理盐水并使所述分离培养罐离心转动进行细胞洗涤，排出洗涤用的生理盐水上清液；

54)收集NK细胞终产品，进行包装。