CN103800898A - 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103800898A CN103800898A CN201410092414.1A CN201410092414A CN103800898A CN 103800898 A CN103800898 A CN 103800898A CN 201410092414 A CN201410092414 A CN 201410092414A CN 103800898 A CN103800898 A CN 103800898A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- preparation
- initial
- sorting
- cik
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- PSWFFKRAVBDQEG-YGQNSOCVSA-N thymopentin Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PSWFFKRAVBDQEG-YGQNSOCVSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 102400000160 Thymopentin Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 101800001703 Thymopentin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229960004517 thymopentin Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 107
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 31
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 21
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 20
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 4
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 claims description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 abstract 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 7
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 3
- -1 CD45RO Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023981 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Human genes 0.000 description 2
- 101710163560 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Proteins 0.000 description 2
- 101710189385 Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000000898 Thymopoietin Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000884270 Homo sapiens Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 1
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229940093181 glucose injection Drugs 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000021603 oncosis Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法，本发明的特异性杀伤细胞为DC疫苗，CIK，CTL细胞的混合物，所述制剂含有胸腺五肽，将其和杀伤细胞混合具有明显提高治疗效果的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗新技术，特别涉及一种初始T细胞来源的新型肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）制剂及其制备方法。
背景技术
中国专利2012101271586描述了一种效应细胞制备方法，即应用CD4+和CD8+混合的初始T细胞，制备DC-CIK-CTL效应细胞，同时提供一种应用复合制剂对肿瘤微环境进行干扰，从而打破肿瘤免疫耐受，在此基础上进行效应细胞回输治疗的新技术。其中DC-CIK-CTL效应细胞的制备方法是：外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞则进一步分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1：1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增至第7天制备CIK。半数细胞移瓶后加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml0.9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是：环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
但实验发现使用该方法，临床有效率虽然有所提高，但还未达到理想程度，为此本发明人对上述方法进行了改进，取得了意想不到的技术效果。
发明内容
本发明的主要目的在于：解决目前DC-CIK-CTL方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。
为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞制剂及其制备方法。
本发明的制剂包括肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）和胸腺五肽。
本发明提供一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞以及胸腺五肽，其中胸腺五肽加入量为5mg。
本发明的制剂，所述肿瘤特异性杀伤细胞，制备方法采：
外周血单状核细胞采集：
应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，
DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞，
DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗，
初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1）、应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD4+TcellisolationkitII,human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用，
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD8+Tcellisolationkit,human试剂盒说明书分两步进行分选，第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二部，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用，
2）、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的Plus进行分选，
Plus细胞分选系统包括CliniMACSPlus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除，使用
Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗，
将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1：1混合备用，
CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50%的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养，
CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL，
高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次去除细胞碎片，得到肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）。
因此本发明的制剂，含有肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）和胸腺五肽，根据需要还可以加入1%的2.0g人血白蛋白，使用时将其溶解在250ml0.9%氯化钠输液中，输入到患者体内。
本发明的另一个内容是，用本发明的细胞制剂治疗肿瘤病人，其方法是将本发明制备的制剂回输到肿瘤病人体内。
本发明还包括制备一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用环磷酰胺CTX，注射用CTX，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的，该制剂的制备方法依据制剂学常规技术制备即可，如制备成水针或粉针，也可直接制备成输液剂。以上制剂的剂量范围分别为可一次性用于病人的剂量，如静脉注射用CTX一次用量为400-600mg/m2，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9%氯化钠或5%-10%的葡萄糖注射液中给病人输注。
本发明的细胞制剂和干扰微环境制剂的使用方法如下：
环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
本发明的制剂的制备方法是将：肿瘤特异性杀伤细胞和胸腺五肽，人血白蛋白，以及0.9%氯化钠输液混合而成。
本发明将肿瘤特异性杀伤细胞和胸腺五肽联合使用，回输给患者，两者作用互补，起到协同增效作用，对肿瘤的杀伤效率大大提高。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果：
采用不同方法进行B16黑色素瘤的荷瘤小鼠抗肿瘤体内实验。
| 肿瘤体积mm3 | |
| 不加胸腺五肽的制剂 | 700 |
| 本发明制剂 | 400 |
另外还进行了以下实验：
B16小鼠恶黑细胞株造模后2天，分别应用PBS、DC疫苗、总T-CTL、不加胸腺五肽的制剂，本发明制剂腹腔注射治疗，7天重复治疗，本发明制剂组抑瘤效果显著高于其他组。
抑瘤效果比较表
实验结果显示，本发明的疗效优于现有技术。
以上内容可以证明，本发明具有更加优良的治疗效果。
胸腺五肽(TP-5)是人工合成的五肽(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr),对应胸腺生成素的32至36位氨基酸序列,具有天然胸腺生成素的全部生物活性。作为一种免疫调节药物在临床上已有多年应用历史，可以用作肿瘤的辅助治疗，本发明通过在肿瘤特异性杀伤细胞DC-CIK-CTL的制剂配制过程中加入胸腺五肽意外的发现其具有增加肿瘤杀伤功效的作用，其效果远优于不加胸腺五肽组。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1、采血前注意事项：
因为放化疗会在较大程度上影响外周血和骨髓初始T细胞的含量和功能，所以，根治手术后或晚期肿瘤病人放化疗结束后1个月采集外周血单状核细胞较为适宜。外周血白细胞数量较低时，可应用注射用重组人粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）皮下注射进行骨髓动员。多发骨髓转移或骨髓造血功能低下的肿瘤病人，外周血初始T细胞含量和功能较差，不宜实施外周血单状核细胞采集。
2、外周血单状核细胞采集：
应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清（方法：加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清），4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层（单状核细胞）。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）。
3、DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞（待初始T细胞分选），剩余贴壁细胞即为DC细胞。
4、DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml（含GM-CSF50ug/500ml，IL-430ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天。第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml（自体肿瘤相关抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备细胞裂解物，过网后蛋白定量），次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗。
5、初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1）、应用美国BD（Becton，Dickinson）、美国R&D（ResearchandDevelopmentSystem）、或德国美天旎（MiltenyiBiotec）等公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选。建议采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响。
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD4+TcellisolationkitII,human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗（包括anti-CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD45RO、CD56、CD123、TCRγ/δ、HLA-DR及CD235a）作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用。
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD8+Tcellisolationkit,human试剂盒说明书分两步进行分选。第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗（包括anti-CD45RO、CD56、CD57及CD244）作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞。第二部，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用。
2）、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的
Plus进行分选。
Plus细胞分选系统包括CliniMACSPlus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除。使用
Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选。分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗。
按说明书步骤，将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACS Plus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体。然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选。总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞。将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1：1混合备用。
6、CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml（含IFN-γ1000U/ml；庆大霉素2万单位/500ml），将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。次日，补充50%的CIK培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位）。第5天补充IL-2培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含IL-215ug，庆大霉素2万单位）。以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
5、CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL。
6、高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次去除细胞碎片，加入1%人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成DC-CIK-CTL细胞制剂，静脉回输。
Claims (5)
1.一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞以及胸腺五肽。
2.根据权利要求1的制剂，其中胸腺五肽加入量为5mg。
3.根据权利要求1的制剂，其中肿瘤特异性杀伤细胞总数量控制为1-2×109，加入1%人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成肿瘤特异性杀伤细胞细胞制剂。
4.根据权利要求1的制剂，其中肿瘤特异性杀伤细胞为DC-CIK-CTL。
5.一种权利要求1的制剂的制备方法，所述肿瘤特异性杀伤细胞制备方法如下：
外周血单状核细胞采集：
应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，
DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞，
DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗，
初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1）、应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD4+TcellisolationkitII,human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用，
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD8+Tcellisolationkit,human试剂盒说明书分两步进行分选，第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二部，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用，
2）、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的
Plus进行分选，
Plus细胞分选系统包括CliniMACSPlus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除，使用Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗，
将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1：1混合备用，
CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50%的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养，
CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL，
高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次去除细胞碎片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410092414.1A CN103800898B (zh) | 2014-03-13 | 2014-03-13 | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410092414.1A CN103800898B (zh) | 2014-03-13 | 2014-03-13 | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103800898A true CN103800898A (zh) | 2014-05-21 |
| CN103800898B CN103800898B (zh) | 2016-01-13 |
Family
ID=50698591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410092414.1A Active CN103800898B (zh) | 2014-03-13 | 2014-03-13 | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103800898B (zh) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104693276A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-10 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 一种肿瘤特异性靶标及其制备细胞免疫治疗制剂的应用 |
| CN104928243A (zh) * | 2015-07-13 | 2015-09-23 | 山西大医院 | 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法 |
| WO2016086861A1 (zh) * | 2014-12-05 | 2016-06-09 | 赛业（苏州）生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统、方法及用途 |
| CN105670993A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-06-15 | 福州创方医药科技有限公司 | 一种一体式t细胞培养提取方法 |
| CN105998069A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂 |
| CN106479975A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-03-08 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 多种免疫细胞混合培养方法 |
| CN106754698A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 刘晓明 | 一种用于人外周血t细胞的分离及激活的方法 |
| CN107011412A (zh) * | 2017-05-22 | 2017-08-04 | 南京佰泰克生物技术有限公司 | 一种蛋白制剂及在cik细胞培养方面的应用 |
| CN107267456A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-10-20 | 湖南开启时代生物科技有限责任公司 | 一种nk细胞的制备方法 |
| CN107287165A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-10-24 | 湖南开启时代生物科技有限责任公司 | 一种car‑t细胞的制备方法 |
| CN107475186A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-12-15 | 湖南开启时代生物科技有限责任公司 | 一种间充质干细胞制备方法 |
| CN109748974A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-14 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用 |
| CN109797189A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-05-24 | 深圳市双科生物科技有限公司 | 一种靶细胞的识别与杀伤方法 |
| WO2020143043A1 (zh) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 深圳市双科生物科技有限公司 | 一种靶细胞的识别与杀伤方法 |
| CN111548994A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-18 | 广东华夏健康生命科学有限公司 | 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 |
| WO2022061791A1 (zh) * | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 苏州大学 | 肿瘤特异性 t 细胞的检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102526716A (zh) * | 2011-12-07 | 2012-07-04 | 蔡颖 | 一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备 |
| CN102657853A (zh) * | 2012-04-27 | 2012-09-12 | 蔡建辉 | 初始t细胞来源的肿瘤特异性杀伤细胞的制备及其应用 |
-
2014
- 2014-03-13 CN CN201410092414.1A patent/CN103800898B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102526716A (zh) * | 2011-12-07 | 2012-07-04 | 蔡颖 | 一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备 |
| CN102657853A (zh) * | 2012-04-27 | 2012-09-12 | 蔡建辉 | 初始t细胞来源的肿瘤特异性杀伤细胞的制备及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 白燕等: "DC-CIK细胞治疗化疗后儿童急性白血病23例临床观察", 《第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编》, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 81 * |
| 马云龙: "胸腺肽α1作用于树突状细胞的抗肿瘤免疫机制的实验研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 12, 15 December 2008 (2008-12-15) * |
| 马云龙等: "树突状细胞疫苗联合胸腺肽α1对人源化免疫重建裸鼠结肠癌生长的抑制效应", 《中华实验外科杂志》, vol. 24, no. 11, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 1357 - 1359 * |
| 马云龙等: "胸腺肽α1联合DC疫苗对结肠癌体内外抗肿瘤的效应", 《细胞与分子免疫学杂志》, vol. 23, no. 11, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 1046 - 1049 * |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016086861A1 (zh) * | 2014-12-05 | 2016-06-09 | 赛业（苏州）生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统、方法及用途 |
| CN104693276A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-10 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 一种肿瘤特异性靶标及其制备细胞免疫治疗制剂的应用 |
| CN104928243B (zh) * | 2015-07-13 | 2019-01-18 | 山西大医院 | 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法 |
| CN104928243A (zh) * | 2015-07-13 | 2015-09-23 | 山西大医院 | 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法 |
| CN106479975A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-03-08 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 多种免疫细胞混合培养方法 |
| CN105670993A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-06-15 | 福州创方医药科技有限公司 | 一种一体式t细胞培养提取方法 |
| CN105670993B (zh) * | 2016-04-22 | 2022-04-01 | 福州创方医药科技有限公司 | 一种一体式t细胞培养提取方法 |
| CN105998069A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-10-12 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂 |
| CN106754698A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 刘晓明 | 一种用于人外周血t细胞的分离及激活的方法 |
| CN107011412A (zh) * | 2017-05-22 | 2017-08-04 | 南京佰泰克生物技术有限公司 | 一种蛋白制剂及在cik细胞培养方面的应用 |
| CN107011412B (zh) * | 2017-05-22 | 2020-07-14 | 苏桥生物(苏州)有限公司 | 一种蛋白制剂及在cik细胞培养方面的应用 |
| CN107475186A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-12-15 | 湖南开启时代生物科技有限责任公司 | 一种间充质干细胞制备方法 |
| CN107287165A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-10-24 | 湖南开启时代生物科技有限责任公司 | 一种car‑t细胞的制备方法 |
| CN107267456A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-10-20 | 湖南开启时代生物科技有限责任公司 | 一种nk细胞的制备方法 |
| CN109797189A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-05-24 | 深圳市双科生物科技有限公司 | 一种靶细胞的识别与杀伤方法 |
| WO2020143043A1 (zh) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 深圳市双科生物科技有限公司 | 一种靶细胞的识别与杀伤方法 |
| CN109748974A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-14 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用 |
| CN109748974B (zh) * | 2019-03-04 | 2022-07-08 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用 |
| CN111548994A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-18 | 广东华夏健康生命科学有限公司 | 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 |
| CN111548994B (zh) * | 2020-04-24 | 2021-05-25 | 广东华夏健康生命科学有限公司 | 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 |
| WO2022061791A1 (zh) * | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 苏州大学 | 肿瘤特异性 t 细胞的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103800898B (zh) | 2016-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103800898B (zh) | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 | |
| CN102526716B (zh) | 一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备 | |
| CN102657853A (zh) | 初始t细胞来源的肿瘤特异性杀伤细胞的制备及其应用 | |
| CN101519646B (zh) | 一种cik细胞及其制备方法和细胞制剂 | |
| CN101918544B (zh) | 提高免疫反应性的方法 | |
| CN102618498B (zh) | Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法 | |
| CN108220239A (zh) | 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 | |
| CN102268405A (zh) | 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基 | |
| CN102676453A (zh) | 一种nk和/或nkt细胞的培养方法 | |
| CN105154398A (zh) | Cik及其制备方法 | |
| CN108588022A (zh) | 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法 | |
| CN105316287A (zh) | 一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法 | |
| CN104955941A (zh) | 免疫抑制细胞及其制造和使用方法 | |
| CN106754704B (zh) | 免疫细胞体外诱导扩增的方法 | |
| CN104711224A (zh) | 一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用 | |
| CN108251369A (zh) | 一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途 | |
| CN110272871A (zh) | 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 | |
| CN103981144A (zh) | 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法 | |
| CN109957543A (zh) | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 | |
| CN108441481A (zh) | 一种嵌合抗原受体t细胞及其培养方法 | |
| CN104762261A (zh) | 一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法 | |
| CN105969731B (zh) | 一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法 | |
| CN115896016B (zh) | 培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用 | |
| CN109136182A (zh) | 一种极化和扩增cd4+t细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用 | |
| CN108690829A (zh) | 一种高效扩增nk细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Cai Jianhui Inventor after: Feng Ruicheng Inventor after: Cai Ying Inventor after: Cui Hongjuan Inventor before: Cai Jianhui Inventor before: Xu Jianqiang Inventor before: Yang Xiaogang Inventor before: Hu Lingling |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150922 Address after: 050035 No. 219, Qinshan street, hi tech Zone, Hebei, Shijiazhuang 1-206 Applicant after: HEBEI LITONGKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 050000 Heping West Road, Hebei, Shijiazhuang, No. 348 Applicant before: Cai Ying |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 050000 Floor 1, Building 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang High-tech Zone, Hebei Province Patentee after: HEBEI NONGFOYU BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 050035 Qinshan Street 219-206, Shijiazhuang High-tech Zone, Hebei Province Patentee before: HEBEI LITONGKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211209 Address after: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 floor 1, building 1, 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province Patentee before: HEBEI NONGFOYU BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231016 Address after: Room 2024, Hebei Publishing Media Creative Center, No. 19 Yuanboyuan Street, Zhengding District, China (Hebei) Free Trade Pilot Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province, 050899 Patentee after: Yuetenong biotechnology Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |