CN109748974A

CN109748974A - 一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用

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Publication number: CN109748974A
Application number: CN201910160899.6A
Authority: CN
Inventors: 李晨蔚; 李世强
Original assignee: Shanghai Still Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Still Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: CN109748974B

Abstract

本发明提供一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用。具体的，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所示的结构：Z1‑L1‑Z2‑L2‑Z3(I)其中，Z1为无或信号肽元件；L1为无或连接肽；Z2为TRAG‑3蛋白；L2为无或连接肽；Z3为LAMP‑1蛋白的跨膜区和胞内区。本发明的融合蛋白可将TRAG‑3抗原表位负载到树突状细胞中，促使树突状细胞能更好的将TRAG‑3抗原提呈，激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应，从而使得树突状细胞具有更好的肿瘤，尤其是TRAG‑3阳性肿瘤的杀伤活性。

Description

一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用。

背景技术

肿瘤是继心脑血管疾病成为人类健康的第二大杀手，传统的肿瘤治疗方法主要是手术治疗、放疗及化疗等。传统的治疗手段不能很好的解决肿瘤迁移及再次复发的难题，目前新型肿瘤治疗方法—免疫疗法是肿瘤治疗及预防最具潜力的一种方法。肿瘤免疫疗法包括很多种例如Car-T、TCR-T及树突状细胞疫苗等，在临床上取得了良好的疗效。其中Car-T等免疫疗法在实体瘤中治疗效果并不理想，还存在很强的毒副作用。基于树突状细胞疫苗进行的肿瘤免疫治疗临床上也取得了良好的疗效，例如：黑色素瘤、前列腺癌等。DC疫苗具有毒副作用小，安全性高，针对肿瘤靶向性良好的一种免疫疗法。树突状细胞(DC：dendritic cell)是一类专职性抗原提呈细胞，具有起始并调控固有免疫及适应性免疫反应的能力，能高效摄取、加工处理和提呈抗原。树突状细胞未受到抗原刺激时处于未成熟状态，接受抗原刺激后树突状细胞能够快速成熟活化并(将抗原提呈至T细胞)，经淋巴系统迁移至次级淋巴器官，将抗原提呈至T细胞，促使T细胞活化引起机体T细胞免疫应答。根据树突状细胞表面分子不同，人体内主要存在三类树突状细胞：CD303(pDC浆细胞样树突状细胞)、CD1c及CD141树突状细胞。其中CD1c和CD141树突状细胞能够分泌IL-12，促进Th1细胞的生成并刺激初始CD8⁺T细胞的活化。

虽然，树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗中取得一些进展，但树突状细胞疫苗治疗肿瘤仍具有很大的局限性。一方面是因为部分肿瘤抗原免疫原性较低，无法很好的激活机体内肿瘤特异性免疫反应。另一方面，由于机体内肿瘤微环境所产生的免疫抑制功能阻碍树突状细胞疫苗在机体内发挥正常功能。肿瘤抗原主要包括：肿瘤相关抗原、病毒相关抗原、癌睾抗原及新抗原等。其中癌睾抗原(Cancer-testis Antigen,CT)是表达在多种肿瘤组织中、睾丸、胎盘及卵巢中的一类蛋白分子，不表达在其他任何组织中的一类抗原。癌睾抗原也是目前相对于肿瘤相关抗原免疫原性较高的一类抗原，能够有希望作为靶点治疗肿瘤疾病。至今已经筛选出250多个CT抗原成员，其中临床应用较多的主要有：MAGE和NY-ESO-1等。TRAG-3也是癌睾抗原中的一种，最初是在卵巢癌细胞中发现，该蛋白可以抵抗紫杉醇对细胞的胁迫作用。研究发现TRAG-3高表达在多种实体瘤中，包括78％黑色素瘤、54％非小型细胞肺癌及60％乳腺癌中等。因此，该蛋白作为肿瘤细胞治疗的靶点具有重大的潜在研究价值。

目前，临床上制备树突状细胞疫苗主要是将人外周血单核细胞分离，体外利用GM-CSF及IL-4诱导单核细胞分化成树突状细胞。随后采用小分子抗原肽、腺病毒包装载体、慢病毒包装载体及肿瘤溶解物等致敏DC，制备成树突状细胞疫苗。由于不同的抗原其免疫原性强弱不同，临床上还可以通过加入不同的免疫佐剂来提高其活化程度。

因此，本领域迫切需要开发有效的TRAG-3阳性肿瘤的预防性和/或治疗性疫苗。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种有效的TRAG-3阳性肿瘤的预防性和/或治疗性疫苗。

本发明的另一目的在于提供一种靶向TRAG-3抗原修饰的树突状细胞疫苗，主要针对TRAG-3抗原阳性肿瘤的治疗。利用慢病毒感染树突状细胞的方法将TRAG-3抗原表位负载到树突状细胞中。

本发明的另一目的在于，促使树突状细胞能更好的将TRAG-3抗原提呈。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所示的结构：

Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)

其中，

Z1为无或信号肽元件；

L1为无或连接肽；

Z2为TRAG-3蛋白；

L2为无或连接肽；

Z3为LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区；

各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

在另一优选例中，所述Z1为含有SEQ ID NO.:4所示的核心序列的多肽。

在另一优选例中，所述Z1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白为TRAG-3全长蛋白、TRAG-3蛋白的活性片段、突变体、衍生物或类似物。

在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白活性片段、突变体、衍生物或类似物具有TRAG-3的功能或活性。

在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥85％，优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有TRAG-3蛋白的活性；

(C)将SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经过1-15个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有TRAG-3蛋白活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述的连接肽序列长度为1-20个氨基酸，较佳地1-10个氨基酸，更佳地，2-6个氨基酸。

在另一优选例中，所述连接肽为具有n个重复的如SEQ ID NO.:7(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)所示的序列，其中n为1-3，较佳地，n为1-2。

在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列。

在另一优选例中，所述的DNA序列选自下组：基因组序列、cDNA序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸具有式II所示的结构：

A1-S1-A2-S2-A3 (II)

其中，

A1为无或信号肽元件的编码序列；

S1为无或连接序列；

A2为TRAG-3蛋白的编码序列；

S2为无或连接序列；

A3为LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区的编码序列；

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

在另一优选例中，所述信号肽元件的编码序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白的编码序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:5所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥30％，较佳地，75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白的编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区的编码序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:8所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:8所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明第三方面提供了一种载体，包括本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为活化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括活化的树突状细胞。

本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和

分离所述的融合蛋白。

本发明第六方面提供了一种本发明第一方面所述融合蛋白的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗药物。

在另一优选例中，所述肿瘤包括TRAG-3阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、或其组合。

本发明第七方面提供了一种树突状细胞，所述树突状细胞为用本发明第一方面所述的融合蛋白活化的树突状细胞。

本发明第八方面提供了一种TRAG-3阳性肿瘤预防性或治疗性疫苗，含有安全有效量本发明第七方面所述的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞或本发明第一方面所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和赋形剂。

本发明第九方面提供了一种制备预防性和/或治疗性疫苗的方法，包括步骤：将有安全有效量本发明第七方面所述的树突状细胞或用所述树突状细胞诱导的T细胞或本发明第一方面所述的融合蛋白，与药学上可接受的载体或赋形剂进行混合，从而形成预防性和/或治疗性疫苗。

本发明第十方面提供了一种制备活化的树突状细胞的方法，包括步骤：将树突状细胞与本发明第一方面所述的融合蛋白接触，从而活化树突状细胞。

本发明第十一方面提供了一种制备免疫个体的方法，包括步骤：

将需要免疫的对象施用有安全有效量本发明第七方面所述的树突状细胞或用所述树突状细胞诱导的T细胞或苯酚那么第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。

本发明第十二方面提供了一种制备树突状细胞的方法，所述树突状细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白，其中所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体导入树突状细胞内，从而获得所述的树突状细胞。

在另一优选例中，所述导入包括同时、先后或依次导入。

在另一优选例中，所述树突状细胞为经活化的树突状细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的所述树突状细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第十三方面提供了一种细胞制剂，所述细胞制剂含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的树突状细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述细胞制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述细胞制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述宿主细胞包括经活化的树突状细胞。

在另一优选例中，所述细胞制剂中，所述细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述细胞制剂还含有佐剂。

另一优选例中，所述的佐剂包括细胞因子。

在另一优选例中，所述细胞因子选自下组：TNF-a、IL-1β、IL-6、PGE2、IFN-γ、或其组合。

本发明第十四方面提供了一种本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第七方面所述的树突状细胞、或本发明第十三方面所述的细胞制剂的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤细胞的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括TRAG-3阳性的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞来源于选自下组的肿瘤：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、或其组合。

本发明第十五方面提供了一种选择性杀伤肿瘤细胞的方法，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第七方面所述的树突状细胞、或本发明第十三方面所述的细胞制剂。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明第十六方面提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括：

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括TRAG-3阳性的肿瘤细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示TRAG-3慢病毒表达载体示意图。

图2显示利用慢病毒感染DC后，细胞表面标志物流式分析。

图3显示成熟树突状细胞分泌细胞因子水平。

图4显示肿瘤抗原特异性CTL对不同肿瘤细胞的杀伤率。

图5显示荷瘤小鼠存活曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，本发明人首次将信号肽、TRAG-3蛋白、LAMP-1的跨膜区和胞内区融合在一起，构建一种新的融合蛋白，该融合蛋白可将TRAG-3抗原表位负载到树突状细胞中，促使树突状细胞能更好的将TRAG-3抗原提呈，激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应，从而使得树突状细胞具有更好的肿瘤，尤其是TRAG-3阳性肿瘤的杀伤活性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

TRAG-3蛋白

TRAG-3是癌睾抗原中的一种，最初是在卵巢癌细胞中发现，只表达在肿瘤组织及睾丸中，不在正常组织中表达。该蛋白具有较高的肿瘤特异性，其主要功能是抵抗紫杉醇对细胞的胁迫作用。研究发现TRAG-3高表达在多种实体瘤中，包括黑色素瘤、非小型细胞肺癌，乳腺癌及胰腺癌及肠癌等。

在本发明中，TRAG-3蛋白的序列与天然的或变异的肿瘤抗原TRAG-3免疫原性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然肿瘤抗原TRAG-3基本相同的生物活性。

优选的TRAG-3蛋白是人肿瘤抗原TRAG-3的全长或其免疫原性片段(活性片段)。

TRAG-3阳性肿瘤

如本文所用，术语“TRAG-3阳性肿瘤”包括指在肿瘤细胞膜上高度表达TRAG-3抗原的肿瘤，代表性的例子包括(但并不限于)：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌、肝癌、睾丸癌、胰腺癌、或其组合。

连接肽

如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指分别位于任选的信号肽元件和TRAG-3蛋白之间、位于TRAG-3蛋白和LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区之间的起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸，较佳地为1-10个氨基酸，最佳地为2-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS 1998；95:5929-5934；ProteinEng，2000；13(5):309-312；Protein Eng，2003；15(11):871–879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响任选的信号肽元件和TRAG-3蛋白、以及TRAG-3蛋白与LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区形成正确的折叠和空间构象。

优选的连接肽例子包括(但并不限于)：为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用GGGGS序列作为连接臂是合适的；为了有利于蛋白酶把任选的信号肽元件/TRAG-3蛋白/LAMP-1跨膜区和胞内区切割成2个或3个独立的蛋白分子，可用活性Ⅹ因子的酶切位点(IEGR)作连接臂。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；为了有利于纯化，可把6His作为连接臂，以用金属亲和层析纯化任选的信号肽元件/TRAG-3蛋白/LAMP-1跨膜区和胞内区的融合蛋白；上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His的连接肽。

此外，另一种优选方式是将任选的信号肽元件、TRAG-3蛋白、LAMP-1跨膜区和胞内区直接连接，而不含任何连接肽。

融合蛋白及其制法

如本文所用，术语“本发明的融合蛋白”、“任选的信号肽元件/TRAG-3蛋白/LAMP-1跨膜区和胞内区的融合蛋白”可互换使用，都指由任选的信号肽元件、TRAG-3蛋白的氨基酸序列和LAMP-1跨膜区和胞内区的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在任意两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。

编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法获得本发明的融合蛋白的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。

在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是甲醇酵母细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估本发明的融合蛋白或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

药物组合物和给药方式

本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的(如疫苗)。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型融合蛋白、或用该融合蛋白致敏(或活化)的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。对于含细胞的组合物，优选形式为液态剂型。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、癌旁、或局部给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或相应的树突状细胞或T细胞施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克融合蛋白/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克融合蛋白/千克体重，较佳地该剂量是约1微克-1毫克融合蛋白/千克体重；或者，通常为10⁵-10¹⁴细胞/人/次，更佳地为10⁶-10¹²细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5-Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。

树突状细胞疫苗

在一优选实施方式中，本发明的树突状细胞疫苗的制法，包括以下几个步骤：

1.抗原相关慢病毒基因表达载体的构建、病毒包装和浓缩

2.人树突状细胞分离及分化

3.树突状细胞疫苗检测

在所述1步骤中包括如下步骤：

1a.体外合成人源TRAG-3基因序列、信号肽及LAMP-1跨膜和胞内序列；

1b.构建携带有目的基因序列、信号肽序列及LAMP-1跨膜和胞内序列的慢病毒表达载体；

1c.将步骤b所述慢病毒载体进行包装和病毒浓缩；

在所述步骤2中包括以下步骤：

2a.分离人来源的外周血中的单核细胞；

2b.加入GM-CSF和IL-4细胞因子，诱导单核细胞分化树突状细胞；

2c.诱导培养5天后，向细胞培养液中加入浓缩完好的病毒液及DC诱导成熟因子(LPS、IFN-γ)。

2d.诱导成熟20小时后收集成熟的树突状细胞。

在所述步骤3中包括以下步骤

3a.收集成熟树突状细胞，检测表面标志物、培养基上清中IL-12p70含量。

3b.人外周血来源的T淋巴细胞的分离；

3c.步骤2d成熟树突状细胞与步骤3a分离的T淋巴细胞共培养，获得具有TRAG-3特抗原异性的效应T细胞。

作为优选，步骤1b所使用是慢病毒表达载体；

作为优选，步骤1c所使用的包装载体为pLP1、pLP2、pLP/VSVG

作为优选，步骤2a采用Ficoll-paque密度梯度离心方法获得外周血单核细胞；

作为优选，步骤2b分化诱导树突状细胞采用含有2-10％自体血浆的RPMI-1640培养基，进一步优选采用5％的自体血清RPMI-1640培养基。

作为优选，步骤2b树突状细胞分化所使用的GM-CSF终浓度为50ng/ml，IL-4的终浓度为25ng/ml；

作为优选，继续培养细胞并进行隔天更换新鲜培养液，在6天后将单核细胞来源分化的DC细胞收集，使用含有5μg/ml poly(I：C)的培养基重悬DC细胞；

作为优选，步骤2c促使树突状细胞成熟所使用的细胞因子组合为LPS(100ng/ml)和IFN-γ(100ng/ml)。

作为优选，步骤3a采用流式细胞术分析DC表面标志物，用ELISA分析培养上清中IL-12p70含量。

作为优选，步骤3b采用免疫磁珠细胞分离法，分离外周血T细胞；

本发明采用上述技术手段，将TRAG-3肿瘤抗原负载到树突状细胞中，制备得到针对TRAG-3抗原表位的树突状细胞。对所获得的DC疫苗进行表面分子CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达水平检测、DC细胞因子分泌检测和体外肿瘤细胞杀伤效果检测。

本发明设计基因修饰的慢病毒致敏DC(活化DC)，可使肿瘤抗原得到有效的识别、加工、处理，并将抗原提呈至T细胞激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应。

本发明制备的树突状细胞疫苗是一种有效，无副作用，靶向性强的一类疫苗，该疫苗应用范围较广，可以用于TRAG-3表达量较高的肿瘤疾病治疗(但不局限于)包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌等。也可用于肿瘤辅助性治疗，联合化疗及其他肿瘤治疗手段对TRAG-3低表达的肿瘤疾病进行相关治疗。

本发明的主要优点包括：

(1)发明人首次将信号肽、TRAG-3蛋白、LAMP-1的跨膜区和胞内区融合在一起，构建一种新的融合蛋白，该融合蛋白可将TRAG-3抗原表位负载到树突状细胞中，促使树突状细胞能更好的将TRAG-3抗原提呈，激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应，从而使得树突状细胞具有更好的肿瘤，尤其是TRAG-3阳性肿瘤的杀伤活性。

(2)本发明设计的基因修饰的慢病毒致敏DC，可使肿瘤抗原得到有效的识别、加工、处理，并将抗原提呈至T细胞激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应。

(3)本发明制备的树突状细胞疫苗是一种有效，无副作用，靶向性强的一类疫苗，该疫苗应用范围较广，可以用于TRAG-3表达量较高的肿瘤疾病治疗(但不局限于)包括肺癌、乳腺癌及卵巢癌等。也可用于肿瘤辅助性治疗，联合化疗及其他肿瘤治疗手段对TRAG-3低表达的肿瘤疾病进行相关治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用的试剂或材料，如无特别说明，均为市售产品。

实施例1：携带有TRAG-3抗原重组载体构建及病毒包装

1.1 TRAG-3基因序列、信号肽及LAMP-1跨膜及胞内序列合成：

用常规方法合成携带有Asc I/Xba I双酶切位点的TRAG-3基因序列(SEQ ID NO:1)、信号肽(SEQ ID NO:2)及LAMP-1序列(SEQ ID NO:3)(图1)。

1.2含有TRAG-3基因序列、信号肽及LAMP-1序列的慢病毒表达载体构建：

首先，将合成好的目的基因序列片段以及慢病毒核心载体进行双酶切，将目的基因序列与慢病毒表达载体连接，获得重组DNA分子。随后，将基因表达载体转化E.coli感受态细胞。感受态细胞在冰上解冻，将目的基因产物与感受态细胞混匀，在冰上反应30min，42度热激45s，冰上孵育2min。加入500微升不含任何抗生素的LB培养基，37℃摇1h，涂平板。最后，重组质粒鉴定，挑取平板上任意2-3个单克隆菌落进行培养，提取质粒，进行目的基因序列检测。

1.3病毒包装：

通过钙转，将构建好的携带有目的基因序列慢病毒表达载体与包装载体pLP1、pLP2、pLP/VSVG一起转染到293FT细胞中进行慢病毒包装制备。在包装后48小时收集含有病毒的细胞培养液上清，随后采用20％蔗糖垫层超速离心法浓缩病毒。

实施例2：人单核细胞来源的DC细胞疫苗制备及检测

采集志愿者外周血100ml，离心收集志愿者血清待用。随后按照PBS:血细胞等于2:1的比例用PBS稀释血细胞，利用Ficoll-Paque分离方法将外周血单核细胞分离。将分离得到的单核细胞用RPMI-1640培养基重悬，铺在T75cm的培养瓶中，放置在37℃5％CO₂的培养箱中培养1小时。收集未贴壁细胞并用PBS清洗2-3遍，并将细胞收集到离心管中用来分离T淋巴细胞。细胞贴壁1小时后更换含有rhIL-4(25ng/ml)、rhGM-CSF(50ng/ml)及5％的自体血浆的RPMI-1640培养基。继续培养细胞并进行隔天更换新鲜培养液，在6天后将单核细胞来源分化的DC细胞收集，使用含有5μg/ml poly(I：C)的培养基重悬DC细胞。利用LPS(100ng/ml)和IFN-γ(100ng/ml)刺激细胞，并用浓缩后的慢病毒进行感染，慢病毒使用量根据预实验最优MOI值计算得出。作用树突状细胞24小时后，获得成熟的树突状细胞。

将所获得的成熟树突状细胞用流式细胞术进行DC表面活性标记物检测包括CD11c、CD80、CD86及HLA-DR(图2)。将细胞培养上清液用于ELISA检测IL-12p70(图3)。

实施例3：DC细胞体外诱导肿瘤抗原特异性T细胞反应

3.1树突状细胞与T细胞共培养

将上述未贴壁细胞利用免疫磁珠法分离人外周血T淋巴细胞，将得到的T淋巴细胞用培养基重悬，铺到T25cm培养瓶中。将负载有抗原的成熟的树突状细胞与T淋巴细胞按照1:10比例混合共培养。DC与T细胞共培养7天后收集T细胞并进行表面分子检测主要包括：CD8和CD4。

3.2抗原特异性的CTL杀伤实验

为进一步验证负载TRAG-3抗原的树突状细胞激活的T细胞对肿瘤的杀伤效果，分别进行三种不同肺癌细胞体外杀伤实验。

将肿瘤细胞消化、收集并用培养基重悬至浓度为1*10⁵/ml，将肿瘤细胞种在96孔板中(1*10⁴/孔)。将上述实验中与DC共培养的T细胞收集并计数，按照肿瘤细胞：T细胞等于1:5、1：10及1:20的比例进行混合。随后将细胞放入37度培养箱中培养16小时。肿瘤杀伤检测采用CCK8法：每孔加入10ul CCK8试剂37度反应1小时，随后在酶标仪上检测样品OD值，计算出杀伤率(图4)，从图4可以看出，杀伤率可高达到35％。

实施例4：TRAG-3修饰的DC体内诱导抗原特异性的抗肿瘤效应

4.1小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)分离及分化：

利用CO₂法处死HLA-A0201/K^b转基因小鼠(The Jackson Laboratory)，取小鼠大腿骨，用无菌PBS溶液冲洗出骨髓细胞。加入红细胞裂解液，将红细胞裂解，用10％FBS RPMI-1640培养基重悬骨髓细胞并计数。随后在培养基中加入10ng/ml mGM-CSF、2ng/ml mIL-4并将细胞铺在6孔板中(2×10⁶/孔)培养3天。更换含有mGM-CSF和mIL-4的新鲜培养液继续培养3天后收集树突状细胞(BMDC)。

4.2慢病毒致敏DC

将上述培养至第六天的BMDC中加入浓缩好的病毒液，设置一组未加病毒液的DC作为对照组，孵育20小时后收集细胞。

4.3病毒致敏DC免疫HLA-A0201/K^b转基因小鼠及免疫后小鼠脾脏细胞获取

用病毒体外致敏的BMDC细胞对同系小鼠进行免疫，同时用未经病毒致敏的BMDC作为对照。每只小鼠后肢腿部皮下注射1×10⁶个BMDC，每只小鼠共免疫三次，时间间隔为7天。最后一次免疫后7天，将小鼠利用CO₂安乐死方法处死小鼠，无菌取脾脏，裂除红细胞制备成单细胞悬液。

4.4构建PDX肿瘤模型及过继回输治疗效果的观察

取6-8周的裸鼠，在腹部皮下接种肿瘤模块，待瘤块生长至60-80mm³后进行回输治疗。将荷瘤小鼠分为三组通过尾静脉回输，一组注射PBS作为空白对照；一组注射未经病毒致敏的DC细胞免疫小鼠后的脾脏细胞作为对照；一组注射经病毒致敏DC细胞免疫小鼠后的脾脏细胞。随后每隔两天观察肿瘤瘤块生长状况并进行记录，测量瘤块直径，观察各组小鼠存活状况(图5)。结果显示，经DC疫苗治疗后的小鼠存活率可达40％。

对比例

方法同实施例3，区别在于，采用常规的DC活化方法，所得到的DC的肿瘤杀伤率为本发明的肿瘤杀伤率的20-50％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海尚泰生物技术有限公司

<120> 一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用

<130> P2019-0110

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 333

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atgtggatgg gcctcatcca attagttgaa ggtgttaaga gaaaagacca aggtttcctg 60

gaaaaggaat tctaccacaa gactaacata aaaatgcact gtgagtttca tgcctgctgg 120

cctgccttca ctgtcctggg ggaggcttgg agagaccagg tggactggag tatactgttg 180

agagacgctg gtctggtgaa gatgtccagg aaaccacgag cctccagccc attgtccaac 240

aaccacccac caacaccaaa gaggttccca agacaactcg gaagggaaaa gggacccatc 300

gaggaagttc caggaacaaa aggctctcca taa 333

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atggcggccc ccggcgcccg gcggcggctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60

ggcgcctcag cactctttga ggatcta 87

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

cttaacaaca tgttgatccc cattgctgtg ggcggtgccc tggcagggct ggtcctcatc 60

gtcctcattg cctacctcat tggcaggaag aggagtcacg ccggctatca gaccatctag 120

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Ala Ala Pro Gly Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Leu Ala His Gly Leu Ala Leu Ser Ala Leu Phe Glu Asp Leu

20 25 30

<210> 5

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Met Trp Met Gly Leu Ile Gln Leu Val Glu Gly Val Lys Arg Lys Asp

1 5 10 15

Gln Gly Phe Leu Glu Lys Glu Phe Tyr His Lys Thr Asn Ile Lys Met

20 25 30

His Cys Glu Phe His Ala Cys Trp Phe Ala Phe Thr Val Leu Gly Glu

35 40 45

Ala Trp Arg Asp Gln Val Asp Trp Ser Ile Leu Leu Arg Asp Ala Gly

50 55 60

Leu Val Lys Met Ser Arg Lys Pro Arg Ala Ser Ser Pro Leu Ser Asn

65 70 75 80

Asn His Pro Pro Thr Pro Lys Arg Phe Pro Arg Gln Leu Gly Arg Glu

85 90 95

Lys Gly Pro Ile Glu Glu Val Pro Gly Thr Lys Gly Ser Pro

100 105 110

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Leu Asn Asn Met Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly

1 5 10 15

Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Ile Gly Arg Lys Arg Ser

20 25 30

His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

35

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Met Ala Ala Pro Gly Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Leu Ala His Gly Leu Ala Leu Ser Ala Leu Phe Glu Asp Leu Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Met Trp Met Gly Leu Ile Gln Leu Val Glu Gly Val

35 40 45

Lys Arg Lys Asp Gln Gly Phe Leu Glu Lys Glu Phe Tyr His Lys Thr

50 55 60

Asn Ile Lys Met His Cys Glu Phe His Ala Cys Trp Phe Ala Phe Thr

65 70 75 80

Val Leu Gly Glu Ala Trp Arg Asp Gln Val Asp Trp Ser Ile Leu Leu

85 90 95

Arg Asp Ala Gly Leu Val Lys Met Ser Arg Lys Pro Arg Ala Ser Ser

100 105 110

Pro Leu Ser Asn Asn His Pro Pro Thr Pro Lys Arg Phe Pro Arg Gln

115 120 125

Leu Gly Arg Glu Lys Gly Pro Ile Glu Glu Val Pro Gly Thr Lys Gly

130 135 140

Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Leu Asn Asn Met Leu Ile Pro Ile Ala

145 150 155 160

Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr

165 170 175

Leu Ile Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

180 185 190

<210> 9

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

atggcggccc ccggcgcccg gcggcggctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60

ggcgcctcag cactctttga ggatctaggc ggcggcggct caatgtggat gggcctcatc 120

caattagttg aaggtgttaa gagaaaagac caaggtttcc tggaaaagga attctaccac 180

aagactaaca taaaaatgca ctgtgagttt catgcctgct ggcctgcctt cactgtcctg 240

ggggaggctt ggagagacca ggtggactgg agtatactgt tgagagacgc tggtctggtg 300

aagatgtcca ggaaaccacg agcctccagc ccattgtcca acaaccaccc accaacacca 360

aagaggttcc caagacaact cggaagggaa aagggaccca tcgaggaagt tccaggaaca 420

aaaggctctc cataaggcgg cggcggctca cttaacaaca tgttgatccc cattgctgtg 480

ggcggtgccc tggcagggct ggtcctcatc gtcctcattg cctacctcat tggcaggaag 540

aggagtcacg ccggctatca gaccatctag 570

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所示的结构：

Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)

其中，

Z1为无或信号肽元件；

L1为无或连接肽；

Z2为TRAG-3蛋白；

L2为无或连接肽；

Z3为LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区；

各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种载体，其特征在于，包括权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养本权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和

分离所述的融合蛋白。

6.一种权利要求1所述融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗药物。

7.一种树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为用权利要求1所述的融合蛋白活化的树突状细胞。

8.一种TRAG-3阳性肿瘤预防性或治疗性疫苗，其特征在于，含有安全有效量权利要求7所述的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞或权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和赋形剂。

9.一种制备预防性和/或治疗性疫苗的方法，其特征在于，包括步骤：将有安全有效量权利要求7所述的树突状细胞或用所述树突状细胞诱导的T细胞或权利要求1所述的融合蛋白，与药学上可接受的载体或赋形剂进行混合，从而形成预防性和/或治疗性疫苗。

10.一种制备树突状细胞的方法，其特征在于，所述树突状细胞表达权利要求1所述的融合蛋白，其中所述方法包括步骤：将权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体导入树突状细胞内，从而获得所述的树突状细胞。

11.一种细胞制剂，其特征在于，所述细胞制剂含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞、或权利要求7所述的树突状细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

12.一种权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞、权利要求7所述的树突状细胞、或权利要求13所述的细胞制剂的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤细胞的药物或制剂。