CN105670993B - 一种一体式t细胞培养提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种一体式T细胞培养提取方法，将血液标本输入至容器内，磁珠颗粒的抗体与血液标本中的T细胞发生反应，完成T细胞的分离；将血液标本中未与磁珠颗粒反应结合的细胞经容器流出至废液袋，同时往容器中输入生理盐水进行冲洗；冲洗结束后，将培养液输入至容器中，磁珠颗粒上吸附的T细胞在容器中进行培养；T细胞在容器中扩增，将病毒转染液输入至容器内，进行T细胞的转染；转染后的T细胞在容器中进行后续扩增至特定数量；然后将T细胞从磁珠颗粒表面洗脱，输入至一含有生理盐水的输液袋中供临床使用，使得病人与病人之间的细胞在同一个空间之内互相之间没有机会接触和产生可能的交叉污染。

Description

一种一体式T细胞培养提取方法
技术领域
本发明涉及医疗技术领域,特别针对外周血免疫T细胞分离、培养、扩增和转染，是一种一体式T细胞培养提取方法，尤其针对嵌和抗原受体T细胞（CART）培养、自然杀伤T细胞培养和肿瘤特异T细胞受体T细胞（TCRT）。
背景技术
外周血淋巴细胞培养是一种常见的体外细胞培养技术，其中涉及外周血淋巴细胞的分离，一般采用FICOLL梯度离心吸取淋巴细胞层到一个培养皿中，或者用吸附CD3或CD28抗体的磁珠特异性吸附T淋巴细胞在磁珠表面，然后用普通培养皿里培养，用吸管吸取淋巴细胞到一个培养皿中加入培养液进行培养，这种培养是在一个开放的细胞培养通风厨（洁净工作台）中完成，空间大转移过程容易受到空气中的细菌病毒等微生物的污染，放在37oC细胞培养箱中培养。在转染时，需要移出来放到通风厨里面换液加转染液，然后再放回到37oC细胞培养箱中培养，中间还需要反反复复从细胞培养箱里面拿出来到洁净工作台，又从洁净工作台到细胞培养箱中，一直到培养完成。临床上CART细胞培养做这样的操作程序只能一次一个病人，两个病人在同一个细胞培养房内是不允许的，因为无法保证两个病人的血细胞培养不互相交叉污染，因此目前临床级别的血淋巴细胞培养在这种开放培养方式下手续烦琐，效率低下，人力物力消耗很大，成本很高，无法大规模推广。
发明内容
本发明的目的是针对以上不足之处，提供了一体式T细胞培养提取方法，成本低，占用空间小，将细胞培养分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取融为一体，避免交叉感染。
本发明解决技术问题所采用的方案是：一种一体式T细胞培养提取方法，其特征在于，将血液标本输入至一密闭的容器中，所述容器容置于一密闭的37℃的保温箱内，在所述容器中依次完成T细胞的分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取，包括以下步骤：
步骤S1：将血液标本经容器顶部的入口输入至容器内，容器内容置有若干个磁珠颗粒，每个磁珠颗粒上附着有用于与血液标本中T细胞或自然杀伤T细胞结合的抗体，所述抗体与血液标本中的T细胞发生反应，进行充分结合，完成T细胞的分离；
步骤S2：通过一电磁铁将磁珠颗粒吸附聚集于容器内侧壁上，将血液标本中未与磁珠颗粒反应结合的细胞经容器底部的出口流出至废液袋，同时往容器中输入生理盐水进行冲洗；
步骤S3：冲洗结束后，关闭容器的出口，将培养液和含有空气和CO2的混合气体输入至容器中，同时电磁铁断电，磁珠颗粒上吸附的T细胞在容器中进行培养，计算此时T细胞的数量为N，N为正整数，且大于0；
步骤S4：在培养液的作用下，T细胞在容器中扩增，待T细胞的数量大于5N时，将病毒转染液输入至容器内，进行T细胞的转染；
步骤S5：转染后的T细胞在容器中进行后续扩增至特定数量；
步骤S6：打开容器的出口，容器中的培养液流出至一废液袋中；
步骤S7：将生理盐水输入至容器内水加力将T细胞从磁珠颗粒表面洗脱，将T细胞提取输入至一含有生理盐水的输液袋中供临床使用。
进一步的，所述容器的顶部入口处设有一呈Y型的单向双入口管，所述容器的底部出口处设有一用于排液的单向双出口管；所述电磁铁设置于容器的外侧壁且与一控制模块电连；所述容器的侧壁上还分别设有用于输入生理盐水的进液管、用于输入空气和CO2的混合气体的进气管和用于输入培养液的输液管，所述进液管、进气管和输液管上均设有一用于调节输入量的调节阀，每个调节阀均与所述控制模块电连；所述进液管、进气管和输液管均与所述容器内部相连通；所述保温箱上设有五个分别与所述单向双入口管、单向双出口管、进液管、进气管和输液管对应配合穿出的通孔。
进一步的，所述单向双入口管包括位于单向双入口管顶端的血液标本入口和包装病毒转染液入口，所述单向双出口管的底端设置有第一出口和第二出口，所述第一出口与废液袋相连通，所述第二出口与输液袋相连通；所述废液袋容置有少量防腐剂。
进一步的，所述单向双入口管的下端和单向双出口管的上端分别设有一第一单向阀和第二单向阀，所述第一单向阀和第二单向阀均与控制模块电连。
进一步的，所述容器的外形为椭圆形或者圆形，所述容器的底面呈水平。
进一步的，在步骤S1中，所述抗体为CD3单克隆抗体、CD3多克隆抗体、CD28抗体、CD4或CD8。
进一步的，在所述步骤S3中，通过LYTRO ILLUM照相机拍照计算每个磁珠颗粒上的吸附的T细胞数。
进一步的，在所述步骤S1中，通过摇晃容器，使得抗体与血液标本中的T细胞进行充分结合30min-40min，完成T细胞的分离。
进一步的，所述容器放置于一洁净室内，所述洁净室的入口处自外向内依次设有一更、二更、三更衣服通道以及货物通道，所述洁净室还设置有传递窗。
进一步的，还包括一用于支撑所述电磁铁的机械手，所述机械手设置于所述容器下方且经一电机驱动绕所述容器转动；所述机械手还经一纵向驱动机构上下移动。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：本发明通过将成T细胞的分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取在同一密闭的容器中完成，剔除了细胞培养过程中的烦琐用人工换液，细胞培养皿和洁净工作台之间的移动互换，不需要单独的细胞培养皿，不需要细胞培养洁净工作台，不需要细胞收集管，也不需要吸管和移液相关的辅助工具，避免了在细胞培养过程中的烦琐用人工换液，T细胞在所述容器之内可以完成所有的细胞分离、培养、转染和扩增的程序，不但节省空间，节省耗材，还节省人力和物力成本。
附图说明
下面结合附图对本发明专利进一步说明。
图1为本发明实施例的结构示意图。
图2为本发明实施例的是方法步骤图。
图3为发明实施例带有保温箱的结构示意图。
图中：1- 容器；2-磁珠颗粒；3-单向双入口管；4-单向双出口管；5-进气管；6-进液管；7-输液管；8-电磁铁；9-第一单向阀；10-第二单向阀；11-调节阀；12-保温箱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
如图1-3所示，本实施例的一种一体式T细胞培养提取方法，其特征在于，将血液标本输入至一密闭的容器1中，所述容器1容置于一密闭的37℃的保温箱12内，在所述容器1中依次完成T细胞的分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取，包括以下步骤：
步骤S1：将血液标本经容器1顶部的入口输入至容器1内，容器1内容置有若干个磁珠颗粒2，每个磁珠颗粒2上附着有用于与血液标本中T细胞或自然杀伤T细胞结合的抗体，所述抗体与血液标本中的T细胞发生反应，进行充分结合，完成T细胞的分离；
步骤S2：通过一电磁铁8将磁珠颗粒2吸附聚集于容器1内侧壁上，将血液标本中未与磁珠颗粒2反应结合的细胞经容器1底部的出口流出至废液袋，同时往容器1中输入生理盐水进行冲洗；
步骤S3：冲洗结束后，关闭容器1的出口，将培养液和含有空气和CO2的混合气体输入至容器1中，同时电磁铁8断电，磁珠颗粒2上吸附的T细胞在容器1中进行培养，计算此时T细胞的数量为N，N为正整数，且大于0；
步骤S4：在培养液的作用下，T细胞在容器1中扩增，待T细胞的数量大于5N时，将病毒转染液输入至容器1内，进行T细胞的转染；
步骤S5：转染后的T细胞在容器1中进行后续扩增至特定数量；
步骤S6：打开容器1的出口，容器1中的培养液流出至一废液袋中；
步骤S7：将生理盐水输入至容器1内水加力将T细胞从磁珠颗粒2表面洗脱，将T细胞提取输入至一含有生理盐水的输液袋中供临床使用。
从上述可知，本发明的有益效果在于：病人新抽取的血标本经过抗血凝处理缓缓地注入至容器1中，轻轻摇晃让血中淋巴细胞充分与磁珠颗粒2混合接触，T细胞包括自然杀伤T细胞由于表面有CD3抗原自然而然与磁珠表面的CD3抗体结合将T细胞吸引在磁珠球表面（T细胞分离），而血中的非T细胞成分则用生理盐水缓缓地冲走，T细胞就留在一体化的容器1里面，吸附在磁珠表面生长扩增，2-3天之后，T细胞扩增到5倍或者以上时即可以做下一步转染。通过密闭的容器1，完成一对一的T细胞培养，成本低，而且可以避免交叉感染。
在本实施例中，所述容器1的顶部入口处设有一呈Y型的单向双入口管3，所述容器1的底部出口处设有一用于排液的单向双出口管4；所述电磁铁8设置于容器1的外侧壁且与一控制模块电连；所述容器1的侧壁上还分别设有用于输入生理盐水的进液管6、用于输入空气和CO2的混合气体的进气管5和用于输入培养液的输液管7，所述进液管6、进气管5和输液管7上均设有一用于调节输入量的调节阀11，每个调节阀11均与所述控制模块电连；所述进液管6、进气管5和输液管7均与所述容器1内部相连通；所述保温箱12上设有五个分别与所述单向双入口管3、单向双出口管4、进液管6、进气管5和输液管7对应配合穿出的通孔。，每个调节阀11均与所述控制模块电连。空气和CO2的混合气体的比例95%：5%，所述进液管6、进气管5和输液管7的入接口均是无菌无毒容易入接且可以自动可以控制流入量的泵装置，通过调节阀11调节输入量，入接口只可出不可进以防止外面的东西吸入细胞培养液和生理盐水瓶里面去。
在本实施例中，所述单向双入口管3包括位于单向双入口管3顶端的血液标本入口和包装病毒转染液入口，所述单向双出口管4的底端设置有第一出口和第二出口，所述第一出口与废液袋相连通，所述第二出口与输液袋相连通；所述废液袋容置有少量防腐剂。废液袋里面加入少量防腐剂，以防止细菌和真菌生长，房间里面为洁净环境，空气要过滤，角落不能有死角，要易于消毒。
在本实施例中，所述单向双入口管3的下端和单向双出口管4的上端分别设有一第一单向阀9和第二单向阀10，所述第一单向阀9和第二单向阀10均与控制模块电连。第一单向阀9只进不出，在血标本输入时打开，其余时间关闭，防止外部空气进入；第二单向阀10只出不进，在排液的过程中打开，其他时间关闭，防止外部空气进入，更好的保证容器1的密闭性。
在本实施例中，所述容器1的外形为椭圆形或者圆形，所述容器1的底面呈水平。
在本实施例中，在步骤S1中，所述抗体为CD3单克隆抗体、CD3多克隆抗体、CD28抗体、CD4或CD8。CD28可以同时与CD3一起粘附在磁珠表面起着刺激T细胞生长作用，也可以将CD28融合蛋白加入到培养液中起到刺激细胞生长的作用。CD3也可以用CD4或者CD8抗体来取代，来分离T细胞里面的CD4阳性或CD8阳性细胞亚群。
在本实施例中，在所述步骤S3中，通过LYTRO ILLUM照相机拍照计算每个磁珠颗粒2上的吸附的T细胞数。T细胞转染之后培养10-14天，每一个病人的血细胞根据健康程度，是否经化疗药损伤，确定培养的天数，如果数量较少，增长缓慢，可以相应增加CD28磁珠和IL-2细胞生长因子，通过照相机照相计数，达到所需细胞数目之后用缓冲液洗脱下来，收集在生理盐水中，准备输回到病人身上。LYTRO ILLUM照下磁珠照片计数随机20个磁珠表面的吸附细胞数，乘以总磁珠数，计算出细胞数。而无需将容器1取出，放在用传统的细胞计数器计数。 LYTRO ILLUM照相机拍摄的景深很长的照片可以改变照片的焦距清楚读出不同层面磁珠的细胞数。
在本实施例中，在所述步骤S1中，通过摇晃容器1，使得抗体与血液标本中的T细胞进行充分结合30min-40min，完成T细胞的分离。
在本实施例中，所述容器1放置于一洁净室内，所述洁净室的入口处自外向内依次设有一更、二更、三更衣服通道以及货物通道，所述洁净室还设置有传递窗。
在本实施例中，还包括一用于支撑所述电磁铁8的机械手，所述机械手设置于所述容器1下方且经一电机驱动绕所述容器转动；所述机械手还经一纵向驱动机构上下移动。所述机械手可以设置于保温箱12的下方或周侧，用于摇晃容器1，便于T细胞充分分离。所述纵向驱动机构可以为纵向设置的丝杆机构。
综上所述，本发明提供的一体式T细胞培养提取方法，占用空间小，成本低，可以实现T细胞的一体式培养，避免交叉感染。
上列较佳实施例，对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种一体式T细胞培养提取方法，其特征在于，将血液标本输入至一密闭的容器中，所述容器容置于一密闭的37℃的保温箱内，在所述容器中依次完成T细胞的分离、培养、扩增、转染、后续扩增和提取，包括以下步骤：
步骤S1：将血液标本经容器顶部的入口输入至容器内，容器内容置有若干个磁珠颗粒，每个磁珠颗粒上附着有用于与血液标本中T细胞或自然杀伤T细胞结合的抗体，所述抗体与血液标本中的T细胞发生反应，进行充分结合，完成T细胞的分离；
步骤S2：通过一电磁铁将磁珠颗粒吸附聚集于容器内侧壁上，将血液标本中未与磁珠颗粒反应结合的细胞经容器底部的出口流出至废液袋，同时往容器中输入生理盐水进行冲洗；
步骤S3：冲洗结束后，关闭容器的出口，将培养液和含有空气和CO2的混合气体输入至容器中，同时电磁铁断电，磁珠颗粒上吸附的T细胞在容器中进行培养，计算此时T细胞的数量为N，N为正整数，且大于0；
步骤S4：在培养液的作用下，T细胞在容器中扩增，待T细胞的数量大于5N时，将病毒转染液输入至容器内，进行T细胞的转染；
步骤S5：转染后的T细胞在容器中进行后续扩增至特定数量；
步骤S6：打开容器的出口，容器中的培养液流出至一废液袋中；
步骤S7：将生理盐水输入至容器内水加力将T细胞从磁珠颗粒表面洗脱，将T细胞提取输入至一含有生理盐水的输液袋中供临床使用；
所述容器的顶部入口处设有一呈Y型的单向双入口管，所述容器的底部出口处设有一用于排液的单向双出口管；所述电磁铁设置于容器的外侧壁且与一控制模块电连；所述容器的侧壁上还分别设有用于输入生理盐水的进液管、用于输入空气和CO2的混合气体的进气管和用于输入培养液的输液管，所述进液管、进气管和输液管上均设有一用于调节输入量的调节阀，每个调节阀均与所述控制模块电连；所述进液管、进气管和输液管均与所述容器内部相连通；所述保温箱上设有五个分别与所述单向双入口管、单向双出口管、进液管、进气管和输液管对应配合穿出的通孔；
所述单向双入口管包括位于单向双入口管顶端的血液标本入口和包装病毒转染液入口，所述单向双出口管的底端设置有第一出口和第二出口，所述第一出口与废液袋相连通，所述第二出口与输液袋相连通；所述废液袋容置有少量防腐剂；
所述单向双入口管的下端和单向双出口管的上端分别设有一第一单向阀和第二单向阀，所述第一单向阀和第二单向阀均与控制模块电连。
2.根据权利要求1所述的体式T细胞培养提取方法，其特征在于：所述容器的外形为椭圆形或者圆形，所述容器的底面呈水平。
3.根据权利要求1所述的一体式T细胞培养提取方法，其特征在于：在步骤S1中，所述抗体为CD3单克隆抗体、CD3多克隆抗体、CD28抗体、CD4或CD8。
4.根据权利要求1所述的一体式T细胞培养提取方法，其特征在于：在所述步骤S3中，通过LYTRO ILLUM照相机拍照计算每个磁珠颗粒上的吸附的T细胞数。
5.根据权利要求1所述的一体式T细胞培养提取方法，其特征在于：在所述步骤S1中，通过摇晃容器，使得抗体与血液标本中的T细胞进行充分结合30min-40min，完成T细胞的分离。
6.根据权利要求1所述的一体式T细胞培养提取方法，其特征在于：所述容器放置于一洁净室内，所述洁净室的入口处自外向内依次设有一更、二更、三更衣服通道以及货物通道，所述洁净室还设置有传递窗。
7.根据权利要求1所述的一体式T细胞培养提取方法，其特征在于：还包括一用于支撑所述电磁铁的机械手，所述机械手设置于所述容器下方且经一电机驱动绕所述容器转动；所述机械手还经一纵向驱动机构上下移动。
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