CN103194389A - 体外高密度培养红细胞的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外高密度培养红细胞的装置，包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为：包括由相互平行的4～10根中空纤维管组成的圆柱形套管，圆柱形套管底部依次设有弹性瓣膜、活塞和真空泵，圆柱形套管上部通过连接管与搅拌式生物反应器连接。本发明还公开了一种体外高密度培养红细胞的方法，包括以下步骤：（一）单个核细胞的分离；（二）CD34+造血干细胞分离；（三）造血干细胞分化成红细胞。使用本发明的装置和方法，可以使不同来源的造血干细胞在体外分化成大量功能完善的红细胞，可实现红细胞的高密度培养，比常规细胞培养方法提高200倍左右。

Description

体外高密度培养红细胞的装置和方法

技术领域

本发明涉及一种体外高密度培养红细胞的装置和方法，属于再生医学领域。

背景技术

目前，依靠人工献血的输血系统需要解决的五大问题是：1）血液需求不断增长；2）老龄化社会进程导致献血人口的不断下降；3)血液偏型，如稀有血型较难找到匹配者；4）疑难配血，如抗红细胞多重免疫等现象；5）输血安全问题。

从造血干细胞中制造成熟的红细胞用于输血似乎为解决这个世界性的难题提供了一个可能的解决办法，法国巴黎第六大学Luc DOUAY教授领导的实验室已经从不同来源的造血干细胞（骨髓、外周血、胎肝、脐血）中成功在体外诱导出成熟红细胞，并且在小鼠实验中表明这些体外培养的红细胞能够发挥正常红细胞一样的功能，比如携带氧气。并且I期临床试验证明：把自体干细胞在体外扩增成熟的红细胞注入人体内，与人体内的红细胞在各项指标方面基本一致，包括膜弹性、血红蛋白含量以及红细胞体内携运输氧气功能等，完全可以替代人工献血来源的红细胞。

尽管体外诱导生成红细胞为解决临床输血问题提供了一个有力的武器，但是真正实现工业化、规模化体外造血仍然面临着很多技术难题需要克服，其中一个重要的问题是体外高密度培养技术问题，因为一个单位红细胞含量约为2x10¹²个红细胞，如果按常规细胞培养密度（1～2×10⁶cell/ml），则培养每个单位红细胞需要的体积非常大（如果培养瓶平铺那么面积约为4个网球场面积大），难以适应工业化生产需要，急切需要一种能够提高细胞培养密度、降低生产空间的装置和方法来适应规模化生产的需要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种体外从造血干细胞高密度培养红细胞的装置和方法，通过该装置和方法培养的细胞密度比常规细胞培养方法提高200倍左右，大大降低了红细胞培养所用的体积，为真正实现红细胞工业化生产打下了坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种体外高密度培养红细胞的装置，包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为：包括由相互平行的4～10根中空纤维管组成的圆柱形套管，圆柱形套管底部依次设有弹性瓣膜、活塞和真空泵，圆柱形套管中部设有废液管，废液管末端设有废液袋，废液管上设有渗透泵，圆柱形套管上部通过连接管与搅拌式生物反应器连接，连接管上设有去白细胞滤网，连接管上连接有柔性管，柔性管末端设有柔性收集袋，柔性管上设有辐照装置。

所述中空纤维管的内径为0.3mm，外径为0.5mm，管壁上孔径为6μm。

所述搅拌式生物反应器为现有技术中已有的产品，其结构为现有技术中常规的结构，如：包括搅拌罐，搅拌罐底部由水套包绕，水套底部有一进水口及出水口，搅拌罐上部设有容器盖，容器盖上设有DO（溶解氧值）监测装置、pH值监测装置、温度监测装置、液面感应装置、转子、气体入口、液体入口和液体出口，液体入口处连接有输送管，输送管上设有喂料泵，液面感应装置与喂料泵连接；液体出口通过连接管与圆柱形套管上部连接。

所述体外高密度培养红细胞的装置的工作原理为：弹性瓣膜与活塞连接，可在真空泵作用下上下运动：当真空泵排出气体时，产生真空状态，从而让活塞带动弹性瓣膜向下运动，进而使得搅拌罐中的红细胞培养液通过连接管进入圆柱形套管；真空泵产生气体时，通过活塞推动弹性瓣膜向上运动，从而使得圆柱形套管中的红细胞培养液通过连接管进入搅拌罐；活塞带动弹性瓣膜上下运动使得红细胞培养液反复通过中空纤维管组成的圆柱形套管，废液不断通过废液管排出至废液袋，而培养的红细胞被截流在中空纤维管中从而实现了细胞的高密度培养（可以达到5×10⁷个细胞/ml至4×10⁸个细胞/ml）。红细胞培养成熟后，通过去白细胞滤网可将白细胞去除，从而使得纯化后的成熟红细胞通过柔性管，红细胞中含有的部分有核细胞经过辐照后与脱核细胞一起被收集于柔性收集袋中。渗透泵将通过中空纤维管的废液排出，由废液袋收集。搅拌罐中的红细胞培养液由液体入口流入，当搅拌罐中的液面下降到一定程度后，液面感应装置感应到后，喂料泵自动启动将红细胞培养液输入搅拌罐内。

一种体外高密度培养成熟红细胞的方法，包括以下步骤：

（一）单个核细胞（MNC）的分离：

（1）将血样置于50ml离心管中，离心2000rpm，10min；

所述血样可以购买得到，也可以自行采集；以脐带血为例，自行采集时，按照脐带血标本采集标准进行采集，足月或早产分娩，排除传染性疾病及各种家族遗传疾病，标本采集严格无菌操作；使用复方枸橼酸血液保护液抗凝；脐血平均容积为50～100ml，标本在采集后的3h内进行分离。

所述造血干细胞血样的来源可以是骨髓、外周血、脐带血以及12～24周胎儿肝脏。

（2）吸取上层血浆转入另一根50ml离心管中，离心2000rpm，10min，吸取上层澄清的血浆，56℃灭活30min，可用于自体灭活血浆在培养过程的前6天的添加应用；

（3）用生理盐水将上述除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀，得稀释血样；

（4）将室温的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque（密度1.077）加入50ml无菌离心管中，15ml/管；

（5）将30ml稀释血样缓慢加在上述15ml的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off（无闸减速）后，离心2000rpm，离心20min，离心管中间白膜层为单个核细胞层；

所述步骤（5）的具体操作方法为：将离心管倾斜45°，在淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque液面以上1cm处缓慢加入稀释血样，注意不要打乱液面界面。

（6）将平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层上2mm处，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞并转移到另一支新的50ml离心管中，每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次（第1次，室温1500r/min，5min；第2次，室温1300r/min，7min），以除去血小板和分离介质，即得到单个核细胞；

（二）CD34+造血干细胞分离（免疫磁珠分离法）：

（1）向上述分离的单个核细胞加入5mlPBS缓冲液（Gibico公司），离心1500r，3分钟，去上清；

（2）每10⁸个单个核细胞加入100μl FcR封闭剂（Miltenyi公司），再加入100μl磁珠偶联CD34+抗体（Miltenyi公司），混匀，在4℃条件下放置15分钟后加入14mlPBS缓冲液，1500r、4℃下离心3分钟，去上清；

（3）上述离心后得到的沉淀重新用500μlPBS缓冲液悬浮；

（4）将分离柱固定于磁铁上，用500μlPBS缓冲液清洗分离柱；

（5）将步骤（3）中的液体样本通过分离柱，然后用PBS缓冲液润洗分离柱3次以去除非特异性结合的细胞；

（6）取下分离柱，用1mlPBSS缓冲液或HAS液冲洗分离柱，收集CD34+细胞于离心管中；

（三）造血干细胞分化成红细胞：

（1）CD34+细胞铺瓶培养，收集到的CD34+细胞以5x10⁴/ml铺瓶，培养液为P1培养液，P1培养液时以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的，培养液中含EPO（sigma公司，3～6U/ml），INSULIN（sigma公司，50～100ng/ml），SCF（R&D公司，50～100ng/ml），DEX（Sigma公司，5～10μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml），Heparin（sigma公司，2U/ml），Transferrin（sigma公司50μg/ml）以及10%的自体血浆（步骤（一）（2）中制备的）；置37℃、5%CO₂条件下培养；

（2）培养至第4天，细胞由培养瓶以1X10⁵/ml转入培养袋，培养液为P2培养液，P2培养液是以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的，培养液中含EPO（sigma公司，3～6U/ml），INSULIN（sigma公司，50～100ng/ml），SCF（R&D公司，50～100ng/ml），DEX（SIGMA公司，5～10μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml）以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；置37℃、5%CO₂条件下培养；

（3）培养至第8天，细胞经PBS缓冲液洗涤去上清后以1x10⁶/ml转入搅拌式生物反应器，培养液为P3培养液，P3培养液是以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的，培养液中含EPO（sigma公司，3～6U/ml），SCF（R&D公司，50～100ng/ml），DEX（SIGMA公司，5～10μM）以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；培养条件设置为37℃、5%CO₂，pH值用HEPES缓冲液（sigma公司）调整为7.35；

所述搅拌式生物反应器的工作体积为5.5L，灌注速率是每天1～3L；搅拌式生物反应器上的喂料泵用于输送细胞悬液，透过的培养基流通过液面感应装置进行控制；错流速率从100～250ml/min使透过液的流速达到10mL/min；

（4）培养至第11天，换用以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX（SIGMA公司，5～10μM）和Heparin（sigma公司，2U/ml）；培养条件设置为37℃、5%CO₂，pH值用HEPES缓冲液（sigma公司）调整为7.35；

（5）培养至第21天，收集终产物，即为红细胞；

所述步骤（3）（4）（5）是在上述体外高密度培养成熟红细胞的装置中进行的，采用此装置培养后，红细胞培养液中的细胞密度可达到5x×10⁷个细胞/ml至4×10⁸个细胞/ml，远远高于常规的培养密度（1～2×10⁶cell/ml）。

上述所涉及的培养液中的试剂因子具体名称如下：促红细胞生成素（EPO）；白介素6(IL-6)；白介素3（IL-3）；促血小板生成素（TPO）；干细胞刺激因子（SCF）；FLT3配体；血管内皮生长因子（VEGF-A165）；胰岛素（Insulin）；干细胞刺激因子（SCF）；转铁蛋白（Transferrin）；地塞米松（DEX）；肝素（Heparin）。

所述体外高密度培养红细胞的方法，从细胞培养时间上可以分为三个阶段，（1）D0～D4：包括：单个核细胞提取，CD34+分离，细胞培养瓶培养；（2）细胞培养袋阶段（D4～D8）；（3）高密度培养阶段（D8～D21）。

所述D0～D4是表示细胞培养的第0天到第四天。（D4～D8）、（D8～D21）同理。

使用本发明的体外高密度培养红细胞的装置和方法，可以使不同来源的造血干细胞在体外分化成大量成熟的、功能完善的红细胞，可实现红细胞的高密度培养，比常规细胞培养方法提高200倍左右，大大降低了红细胞培养所用的体积，为真正实现红细胞工业化生产打下了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明的体外高密度培养红细胞的装置的结构示意图；

其中，1、液体入口；2、DO监测装置；3、pH值监测装置；4、液面感应装置；5、转子；6、气体入口；7、温度监测装置；8、液体出口；9、连接管；10、去白细胞滤网；11、柔性管；12、辐照装置；13、柔性收集袋；14、圆柱形套管；15、废液管；16、废液袋；17、活塞；18、弹性瓣膜；19、水套；20、进水口；21、出水口；P1、喂料泵；P2、渗透泵；P3、真空泵；图中箭头表示液流方向及活塞运动方向。

图2：三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）培养的增殖曲线，横坐标为细胞培养天数，纵坐标表示红系细胞相对于培养初始阶段（D0）增殖倍数。

图3：三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外诱导生成红细胞成熟度比较。

图4：三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外诱导生成红细胞过程中CD45+细胞表面标志表达变化比较，横坐标为细胞培养天数，纵坐标为培养过程中CD45+细胞占所有细胞百分比。

图5：三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外诱导生成红细胞过程中细胞表型变化比较，其中，（1）（2）（3）（4）（5）分别表示培养第0、8、11、14、18天的细胞表型变化示意图，图中，黑色竖条表示胎儿肝脏来源造血干细胞，灰色竖条表示脐血来源造血干细胞，白色竖条表示骨髓来源造血干细胞。横坐标为细胞表面抗原标记，纵坐标为培养过程中表达各种表面抗原标记物细胞占所有细胞百分比。

图6：三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外诱导生成红细胞过程中红细胞血红蛋白类型比较；其中，图（1）（2）表示培养过程中成体血红蛋白（α链、β链、）表达差异，图（3）（4）表示培养过程中成体血红蛋白（α链、γ链、）表达差异，图（5）（6）表示培养过程中成体血红蛋白（ε链、ζ链、）表达差异。图中，黑色竖条表示胎儿肝脏来源造血干细胞，灰色竖条表示脐血来源造血干细胞，白色竖条表示骨髓来源造血干细胞。图中，横坐标表示培养天数，纵坐标表示培养过程中血红蛋白各类型基因表达量。

图7：三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外诱导生成红细胞变形性测定，其中，A图、B图、C图分别为骨髓、脐带血以及胎肝造血干细胞来源红细胞DI（变形系数）值。

图8：第21天三种不同来源造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外培养装置中诱导生成红细胞密度，图中纵坐标表示细胞培养密度。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1  一种体外高密度培养红细胞的装置

包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，如图1所示，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为：包括由相互平行的4～10根中空纤维管组成的圆柱形套管14，圆柱形套管14底部依次设有弹性瓣膜18、活塞17和真空泵P3，圆柱形套管14中部设有废液管15，废液管15末端设有废液袋16，废液管16上设有渗透泵P2，圆柱形套管14上部通过连接管9与搅拌式生物反应器连接，连接管9上设有去白细胞滤网10，连接管9上连接有柔性管11，柔性管11末端设有柔性收集袋13，柔性管11上设有辐照装置12。

所述中空纤维管的内径为0.3mm，外径为0.5mm，管壁上孔径为6μm。

所述搅拌式生物反应器的结构为：包括搅拌罐，搅拌罐底部由水套19包绕，水套19底部有一进水口20及出水口21，搅拌罐上部设有容器盖，容器盖上设有DO监测装置2、pH值监测装置3、温度监测装置7、液面感应装置4、转子5、气体入口6、液体入口1和液体出口8，液体入口1处连接有输送管，输送管上设有喂料泵P1，液面感应装置4与喂料泵P1连接；液体出口8通过连接管9与圆柱形套管14上部连接。

所述体外高密度培养红细胞的装置的工作原理为：弹性瓣膜18与活塞17连接，可在真空泵P3作用下上下运动：当真空泵P3排出气体时，产生真空状态，从而让活塞17带动弹性瓣膜18向下运动，进而使得搅拌罐中的红细胞培养液通过连接管9进入圆柱形套管14；真空泵P3产生气体时，通过活塞17推动弹性瓣膜18向上运动，从而使得圆柱形套管14中的红细胞培养液通过连接管9进入搅拌罐；活塞17带动弹性瓣膜18上下运动使得红细胞培养液反复通过中空纤维管组成的圆柱形套管14，废液不断通过废液管15排出至废液袋16，而培养的红细胞被截流在中空纤维管中从而实现了细胞的高密度培养（可以达到5×10⁷个细胞/ml至4×10⁸个细胞/ml）。红细胞培养成熟后，通过去白细胞滤网10可将白细胞去除，从而使得纯化后的成熟红细胞通过柔性管11，红细胞中含有的部分有核细胞由辐射装置12辐照后与脱核细胞一起被收集于柔性收集袋13中。渗透泵P2将通过中空纤维管的废液排出，由废液袋16收集。搅拌罐中的红细胞培养液由液体入口1流入，当搅拌罐中的液面下降到一定程度后，液面感应装置4感应到后，喂料泵P1自动启动将红细胞培养液输入搅拌罐内。

实施例2  利用实施例1的装置体外高密度培养红细胞（以脐带血来源的造血干细胞为例）

步骤如下：

（一）脐带血单个核细胞（MNC）的分离：

（1）将50ml脐带血血样置于50ml离心管中，离心2000rpm，10min；

所述脐带血血样可以购买得到，也可以自行采集，自行采集时，按照脐带血标本采集标准进行采集，足月或早产分娩，排除传染性疾病及各种家族遗传疾病，标本采集严格无菌操作；使用复方枸橼酸血液保护液抗凝；脐血平均容积为50～100ml，标本在采集后的3h内进行分离。

（2）吸取上层血浆转入另一根50ml离心管中，离心2000rpm，10min，吸取上层澄清的血浆，56℃灭活30min，可用于自体灭活血浆在培养过程的前6天的添加应用；（3）用生理盐水将上述除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀，得稀释血样；

（4）将室温的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque（密度1.077）加入50ml无菌离心管中，15ml/管；

（5）将30ml稀释血样缓慢加在上述15ml的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off（无闸减速）后，离心2000rpm，离心20min，离心管中间白膜层为单个核细胞层；

所述步骤（5）的具体操作方法为：将离心管倾斜45°，在淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque液面以上1cm处缓慢加入稀释血样，注意不要打乱液面界面。

（6）将平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层上2mm处，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞并转移到另一支新的50ml离心管中，每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次（第1次，室温1500r/min，5min；第2次，室温1300r/min，7min），以除去血小板和分离介质，即得到脐带血单个核细胞，离心之后计数；

（二）脐带血CD34+造血干细胞分离（免疫磁珠分离法）：

（1）向上述分离的单个核细胞加入5mlPBS缓冲液（Gibico公司），离心1500r，3分钟，去上清；

（2）每10⁸个单个核细胞加入100μl FcR封闭剂（Miltenyi公司），再加入100μl磁珠偶联CD34+抗体（Miltenyi公司），混匀，在4℃条件下放置15分钟后加入14mlPBS缓冲液，1500r、4℃下离心3分钟，去上清；

（3）上述离心后得到的沉淀重新用500μlPBS缓冲液悬浮；

（4）将分离柱固定于磁铁上，用500μlPBS缓冲液清洗分离柱；

（5）将步骤（3）中的液体样本通过分离柱，然后用PBS缓冲液润洗分离柱3次以去除非特异性结合的细胞；

（6）取下分离柱，用1mlPBSS缓冲液或HAS液冲洗分离柱，收集CD34+细胞于离心管中；

（三）造血干细胞分化成红细胞：

（1）CD34+细胞铺瓶培养，收集到的CD34+细胞以5x10⁴/ml铺瓶，培养液为P1培养液，P1培养液时以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的，培养液中含EPO（sigma公司，5U/ml），INSULIN（sigma公司，75ng/ml），SCF（R&D公司，75ng/ml），DEX（Sigma公司，5μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml），Heparin（sigma公司，2U/ml），Transferrin（sigma公司50μg/ml）以及10%的自体血浆；置37℃、5%CO₂条件下培养；

（2）培养至第4天，细胞由培养瓶以1X10⁵/ml转入培养袋，培养液为P2培养液，P2培养液是以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的，培养液中含EPO（sigma公司，5U/ml），INSULIN（sigma公司，75ng/ml），SCF（R&D公司，75ng/ml），DEX（Sigma公司，5μM），IL-3（sigma公司，5ng/ml）以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；置37℃、5%CO₂条件下培养；

（3）培养至第8天，细胞经PBS洗涤去上清后以1x10⁶/ml转入搅拌式生物反应器，培养液为P3培养液，P3培养液是以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的，培养液中含EPO（sigma公司，5U/ml），INSULIN（sigma公司，75ng/ml），SCF（R&D公司，75ng/ml），DEX（Sigma公司，5μM），以及Heparin（sigma公司，2U/ml）；培养条件设置为37℃、5%CO₂，pH值用HEPES缓冲液（sigma公司）调整为7.35；所述搅拌式生物反应器的工作体积为5.5L，灌注速率是每天1～3L；搅拌式生物反应器上的喂料泵用于输送细胞悬液，透过的培养基流通过液面感应装置进行控制；错流速率从100～250ml/min使透过液的流速达到10mL/min；

（4）培养至第11天，换用以IMDM培养基（GIBICO公司）为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX（SIGMA公司，5μM）和Heparin（sigma公司，2U/ml）；培养条件设置为37℃、5%CO₂，pH值用HEPES缓冲液（sigma公司）调整为7.35；（5）培养至第21天，收集终产物，即为成熟红细胞；

所述步骤（3）（4）（5）是在上述体外高密度培养成熟红细胞的装置中进行的，培养的第8天到第11天，循环流速控制在20mL/min，培养的第11天到第15天，循环流速控制在15mL/min，培养的第15天到第21天，循环流速控制在10mL/min；采用此装置培养后，红细胞培养液中的细胞密度可达到5x×10⁷个细胞/ml至4×10⁸个细胞/ml，远远高于常规的培养密度（1～2×10⁶cell/ml）。

实施例3  不同来源造血干细胞在体外诱导生成红细胞的比较

（一）分别采用三种不同来源的造血干细胞：骨髓（M0）、脐带血(SC)以及胎肝（FF）在体外诱导生成红细胞，培养过程同实施例2；培养过程中，以及培养后进行比较，结果如下：

增值曲线比较如图2所示，由图2表明胎肝来源的造血干细胞在体外增殖能力最强，脐带血来源的造血干细胞增殖能力次之，骨髓来源造血干细胞增殖能力最弱。

红细胞成熟度（形态）比较如图3所示，由图3表明不同来源造血干细胞体外生成红细胞的脱核率依次是骨髓来源造血干细胞大于脐带血来源造血干细胞大于胎肝来源造血干细胞。

CD45+细胞表面标志表达变化比较如图4所示，由图4表明在培养过程中，CD45+表达量不断降低表明造血干细胞在体外不断分化，逐步失去造血干细胞的特性。

细胞表型变化比较如图5所示，由图5表明CD36及CD44等干细胞增殖能力指标在培养过程中基本呈下降趋势，CD71及Glyco A等红细胞成熟度指标逐步上升，说明培养过程是一个由干细胞不断分化成红细胞的过程。

红细胞血红蛋白类型比较如图6所示，由图6表明不同来源造血干细胞生成的红细胞表达的血红蛋白类型并不一致，脐血及外周血来源造血干细胞生成的红细胞主要含有成人型（αβ及αγ），而胎肝来源造血干细胞生成的红细胞主要含有胎儿型血红蛋白（εζ）。红细胞变形性测定比较如图7所示，由图7表明不同来源造血干细胞生成的红细胞的变形性系数略有差异，红细胞变形能力为骨髓大于脐血大于胎肝。

培养结束后，所得到的红细胞密度比较如图8所示，由图8表明由不同来源造血干细胞生成红细胞在培养装置中的终密度可以达到1-3x10⁸/ml大大高于用常规方法培养的细胞密度。

（二）比较时，所用到的细胞分化标志有如下几种：

（1）造血干细胞及其分化标记：CD45+,CD34+,CD38+,CD117+；

（2）粘附标记：CD44+；

（3）红细胞成熟分化标记：CD71+,CD36+,Glycophorine A。

给细胞进行标记的具体实施步骤如下：

（1）10⁵细胞用100μl PBS缓冲液悬浮，加入10μl荧光标记单克隆抗体；4℃下静置30分钟；

（2）1500r离心3分钟，去上清；

（3）重新加入100μl PBS缓冲液，流式细胞仪分析，结果如图4、图5所示。

（三）进行红细胞形态比较时，需要进行Right-Giemsa染色，步骤如下：

（1）5×10⁴个细胞用甩片机（cytospine）甩至载玻片上；自然干燥的载玻片置于染色架上。

（3）将I液（迈格染料lg，甲醇100ml，在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒入烧瓶中，加入其余的甲醇后置入37℃温箱5小时，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2周后使用；临用前取上液40ml，加纯甲醇20ml混合用作工作液）用蒸馏水10倍稀释滴盖载玻片上，20分钟。

（3）倒弃涂片上的I液，自来水漂洗干净。

（4）立即滴盖Ⅱ液（姬氏染粉0.6g，甘油50ml，甲醇100ml，将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3.5小时，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀，放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用）在涂片上染色20分钟。

（5）倒弃涂片上的Ⅱ液，自来水漂洗干净。

（6）趁湿加盖片后镜检，结果如图3所示。

（四）进行红细胞血红蛋白类型比较时，采用PCR检测体外培养红细胞血红蛋白类型，步骤如下：

（1）不同阶段培养细胞（8，11，15，18天）全RNA（totalRNA）用Trizol方法（Invitrogen,Paisley,Scotland）提取；

（2）使用200单位逆转录酶（invitogen公司）及150ng引物（Eurogentech公司）将1μg DNase处理过的RNA转录成cDNA；

（3）以18S基因为内参，对步骤（2）中获得的样本使用ABIPRISM7700实时PCR进行扩增(Applied Biosystems,Foster City,Calif,USA).SYBR green Master Mix、10ng of cDNA以及300nM引物混合成终体积25μL.50℃条件下孵育2分钟后，AmpliTaq Gold聚合酶在95℃条件下激活，在60℃条件下进行40个PCR循环，扩增结果使用2-ΔΔCt分析，结果如图6所示。

（五）进行变形性比较时，检测方法如下：

使用激光衍射法（Ektacytometry）来检测体外培养红细胞变形性，此法原理为红细胞会对透过的激光产生衍射效应，并在衍射图记录装置上获得红细胞的衍射图。静止时，圆盘形红细胞的衍射图呈圆形，纵、横轴等长，旋转时，红细胞在切应力作用下变为椭圆形，衍射图纵、横轴不等长．两轴长度相差越大，表示变形性能越好，反之，变形性则差。所获得的衍射图反映的是红细胞的平均变形性。

（1）培养第18天获得的网织红细胞用去白细胞滤网过滤（lencolab LCG2，Macopharma）。

（2）配置4%PVP（polyvinypyrrolidone）溶液(分子量=30kDa,pH=7.4,渗透压=300mOsm／kg，粘度=1.2cP,含0.004％的牛血清白蛋白)。

（3）步骤（1）中收集的去核红细胞悬浮于步骤（2）中配置的4%PVP溶液。

（4）选择逐渐递增的渗透压梯度（从60-450mosM），使用激光衍射仪器（Technicon，Bayer）分析红细胞变形性，记录红细胞变形系数（DI，deformability index），结果如图7所示。

Claims (7)

1.一种体外高密度培养红细胞的装置，其特征在于：包括搅拌式生物反应器和中空纤维细胞截留装置，其中，中空纤维细胞截留装置的结构为：包括由相互平行的4～10根中空纤维管组成的圆柱形套管，圆柱形套管底部依次设有弹性瓣膜、活塞和真空泵，圆柱形套管中部设有废液管，废液管末端设有废液袋，废液管上设有渗透泵，圆柱形套管上部通过连接管与搅拌式生物反应器连接，连接管上设有去白细胞滤网，连接管上连接有柔性管，柔性管末端设有柔性收集袋，柔性管上设有辐照装置。

2.根据权利要求1所述的体外高密度培养红细胞的装置，其特征在于：所述中空纤维管的内径为0.3mm，外径为0.5mm，管壁上孔径为6μm。

3.根据权利要求1所述的体外高密度培养红细胞的装置，其特征在于：所述搅拌式生物反应器结构为：包括搅拌罐，搅拌罐底部由水套包绕，水套底部有一进水口及出水口，搅拌罐上部设有容器盖，容器盖上设有DO监测装置、pH值监测装置、温度监测装置、液面感应装置、转子、气体入口、液体入口和液体出口，液体入口处连接有输送管，输送管上设有喂料泵，液面感应装置与喂料泵连接；液体出口通过连接管与圆柱形套管上部连接。

4.一种体外高密度培养成熟红细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（一）单个核细胞的分离；

（二）CD34+造血干细胞分离；

（三）造血干细胞分化成红细胞。

5.根据权利要求4所述的体外高密度培养成熟红细胞的方法，其特征在于：所述步骤（一）单个核细胞的分离具体为：

（1）将血样置于50ml离心管中，离心2000rpm，10min；

（2）吸取上层血浆转入另一根50ml离心管中，离心2000rpm，10min，吸取上层澄清的血浆，56℃灭活30min，备用；

（3）用生理盐水将上述除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀，得稀释血样；

（4）将室温的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque加入50ml无菌离心管中，15ml/管；

（5）将30ml稀释血样缓慢加在上述15ml的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off后，离心2000rpm，离心20min，离心管中间白膜层为单个核细胞层；

（6）将平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层上2mm处，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞并转移到另一支新的50ml离心管中，每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次，即得到单个核细胞。

6.根据权利要求4所述的体外高密度培养成熟红细胞的方法，其特征在于：所述步骤（二）CD34+造血干细胞分离具体为：

（1）向单个核细胞加入5mlPBS缓冲液，离心1500r，3分钟，去上清；

（2）每10⁸个单个核细胞加入100μl FcR封闭剂，再加入100μl磁珠偶联CD34+抗体，混匀，在4℃条件下放置15分钟后加入14mlPBS缓冲液，1500r、4℃下离心3分钟，去上清；

（3）上述离心后得到的沉淀重新用500μlPBS缓冲液悬浮；

（4）将分离柱固定于磁铁上，用500μlPBS缓冲液清洗分离柱；

（5）将步骤（3）中的液体样本通过分离柱，然后用PBS缓冲液润洗分离柱3次以去除非特异性结合的细胞；

（6）取下分离柱，用1mlPBSS缓冲液或HAS液冲洗分离柱，收集CD34+细胞于离心管中。

7.根据权利要求4所述的体外高密度培养成熟红细胞的方法，其特征在于：所述步骤（三）造血干细胞分化成红细胞具体为：

（1）CD34+细胞铺瓶培养，收集到的CD34+细胞以5x10⁴/ml铺瓶，培养液为P1培养液，P1培养液时以IMDM培养基为基础培养基配制的，培养液中含EPO 3～6U/ml，INSULIN 50～100ng/ml，SCF 50～100ng/ml，DEX 5～10μM，IL-3 5ng/ml，Heparin 2U/ml，Transferrin50μg/ml以及10%的自体血浆；置37℃、5%CO₂条件下培养；

（2）培养至第4天，细胞由培养瓶以1X10⁵/ml转入培养袋，培养液为P2培养液，P2培养液是以IMDM培养基为基础培养基配制的，培养液中含EPO 3～6U/ml，INSULIN 50～100ng/ml，SCF 50～100ng/ml，DEX 5～10μM，IL-3 5ng/ml以及Heparin 2U/ml；置37℃、5%CO₂条件下培养；

（3）培养至第8天，细胞经PBS缓冲液洗涤去上清后以1x10⁶/ml转入搅拌式生物反应器，培养液为P3培养液，P3培养液是以IMDM培养基为基础培养基配制的，培养液中含EPO3～6U/ml，SCF 50～100ng/ml，DEX 5～10μM以及Heparin 2U/ml；培养条件设置为37℃、5%CO₂，pH值调整为7.35；

（4）培养至第11天，换用以IMDM培养基为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX5～10μM和Heparin 2U/ml；培养条件设置为37℃、5%CO₂，pH值调整为7.35；

（5）培养至第21天，收集终产物，即为红细胞；

所述步骤（3）（4）（5）是在权利要求1所述的体外高密度培养成熟红细胞的装置中进行的。

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