CN104845884A - 在线工业鲁棒化调控细胞状态生产第八因子的装置与方法 - Google Patents

Abstract

在线工业鲁棒化调控细胞状态生产第八因子的装置与方法。本发明公开了一种既可在线、连续、监控多种细胞培养环境中理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态（包括细胞周期等）的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产重组凝血八因子的方法，采用本发明的装置和方法，能降低细胞培养过程中的染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产重组凝血八因子的目的。

Description

在线工业鲁棒化调控细胞状态生产第八因子的装置与方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域中可在线调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置与方法，尤其涉及一种可在线工业鲁棒化(industrially robust)连续监控、连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统的细胞培养环境中各项理生化指标，并可直接在线调节和控制细胞状态的细胞培养、扩增和制备重组凝血八因子的方法。 

背景技术

甲型血友病是一种伴性遗传疾病，人群中该病的总发病率为6人/每10万人，由于诊断方法的进步和医疗水平的提高，血友病发病率（统计数字）有明显的升高趋势，有些国家已超过10/10万，据此估计，我国甲型血友病人数在6万到10万人左右，病人由于凝血机制缺陷，偶遇内外伤往往流血不止，需要输注足量的第八因子制剂，由于第八因子在机体内的半衰期不长，（仅在8-12小时）故止血效果虽然显著，但不能持久，再次出血需再次输注；又因对该病至今尚无根治之术，故病人在一生中都需要第八因子的支持，所以这类病人的总数虽然不多，但需求量却很大。 

我国本土生产的第八因子都来源于人血浆，该工艺具有操作复杂，容易污染，蛋白活性较低的缺点;此外由于原料血浆严重不足，第八因子供应持续紧张，从提高血友病患者的治疗率和保障急诊用药计，国内第八因子的缺口为现有产量的约20倍。 

几年前Bayer公司的基因重组人第八因子（rhFVIII）在我国上市，理论上缓解了药品不足和用药安全的问题，但是进口rhFVIII价格昂贵，多数患者难以负担。（血友病的第八因子治疗不在医保范围）。而目前我国并无公司有能力生产重组人凝血制品，无论是技术水平还是产量，都与国外公司存在巨大差距，并且无法弥补国内患者需求的缺口。并且类似rhFVIII这样的进口产品也为我国生物医药产业带来了生存压力。因此，开发具有自主知识产权的动物细胞培养生产重组人凝血八因子的工艺具有重要的社会和经济价值。 

就重组人凝血八因子的产业化工艺而言，现代动物细胞生物反应器培养表达技术是上述产品的关键核心技术，该技术工艺复杂、难度大。这些先进的重组蛋白生产技术掌握在国外少数制药公司手中，帮助这些跨国公司攫取高额利润。而我国比世界先进技术水平相差悬殊，是牵扯到一系列技术的整体性工业的差距。因此，我们不仅需要快速追赶，缩小差距，更需要加快技术研发，在相关领域取得跨越式发展，形成真正具有自主知识产权的重组凝血八因 子生产的核心关键技术。 

就重组凝血八因子的产业化工艺而言，现代动物细胞生物反应器培养表达技术是上述产品的关键核心技术，该技术工艺复杂、难度大。目前，重组凝血八因子的生产表达方法通常为采用批培养，分批补料培养等。这些重组蛋白生产工艺虽然已经被放大至1000L以上，但是工艺本身存在如下缺点： 

1）培养，表达过程的参数控制较少，不能完全或只能部分程度的控制培养环境的理化条件如温度，pH，CO2和O2浓度，营养物质浓度等； 

2）即使通过反应器对理生化条件进行精确控制，但这种控制方法仍然缺乏对细胞状态本身的精确调节和控制。处于生长和蛋白过程中的细胞状态可以极大地影响最终表达的重组蛋白质量（如蛋白质的糖基化水平，蛋白二级、三级结构的正确形成），而细胞状态并不仅仅是通过上述理生化等参数对细胞的影响所能决定的，对于重组凝血八因子这样的蛋白来说，生产获得的蛋白活性更加是远远比单纯的蛋白质量重要； 

3）批次培养获得的细胞的重复性较低，且极大地受到不同实验和生产技术人员个人操作的影响，在试验和生产中会出现较大的批次间差异（batch to batch variation），这也是目前药物品质控制和监管领域的难题之一。因此，一种具有简便可靠性的鲁棒化（robust）可大规模化（scalable）应用于工业化（industrial）的重组凝血八因子的生产装置和工艺是目前表达工艺（process development）研究领域的瓶颈。 

此外，对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。据公开报导，细胞生长的状态与整个群体的细胞周期分布具有一定的相关性。按照细胞在分裂过程中表现出的显著性差异的行为，细胞周期可以大致分为三个阶段，参见图1： 

gap1phase（G1phase，G1期）是一个细胞周期的起始阶段，在这个阶段，细胞内部进行相关蛋白质的合成等行为，细胞体积和基因组不产生任何变化； 

随后，细胞会根据自身所处的环境来判断是否跨越过限制点（restriction point），进入DNA合成期（DNA synthesis phase，S phase，S期），在S期，细胞主要进行自身基因组DNA的合成复制，复制完毕后，细胞成为2倍体，即基因组翻倍； 

随后细胞进入有丝分裂期（gap2/mitotic phase，G2/M phase，G2/M期），在此时期，细胞完成有丝分裂，得到两个相同的子细胞，完成了一个细胞周期； 

当细胞所处环境不佳，不利于细胞生长时，细胞无法跨过限制点，从而跳出细胞周期，进入一个额外的沉默期（resting phase，G0phase），成为不分裂细胞。 

根据细胞在上述不同周期的细胞行为，通过细胞核染色试剂检测细胞核的DNA含量，配合流式细胞仪即可分辨单个细胞所处的细胞周期并绘制整个群体的细胞周期分布图。 

对于正常培养过程中的细胞而言，细胞整体是一个异步培养体系（asynchronous culture），即在培养过程中细胞整体并不处于细胞周期的相同位置，而是随机分布在细胞周期的各个位置。由于处于细胞周期不同时期的细胞在蛋白过程中表现出的特性可能并不相同，因此细胞整体所呈现的结果可能实质上是由处于不同细胞周期、不同状态的细胞的所占比例的动态变化－即细胞周期分布导致的。 

发明内容

由于细胞生长状态本身极大地影响最终表达的重组蛋白质量，而传统的细胞培养和蛋白表达方法如批培养和补料培养工艺中对于细胞状态的控制相对缺乏，同时细胞状态并不仅仅是通过上述理化参数对细胞的影响所能决定的。因此，实现对细胞生长状态（即细胞生长，细胞周期分布等具体参数）的精确控制，是建立具有简便可靠性的鲁棒化（robust）可大规模化（scalable）应用于工业化（industrial）重组凝血八因子表达工艺（process development）的重要工作。 

本发明的目的在于，针对目前重组凝血八因子传统制备工艺中的上述缺点，提供一种既可在线、连续、监控细胞培养环境中多种理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态（包括细胞周期等）的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产重组凝血八因子的方法，使其降低染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产重组凝血八因子的目的。 

对于传统工艺用细胞状态“好”与“坏”来描述细胞是一种口语化的表达，而“延迟期”，“对数生长期”和“平台期”等言语也是一个较为笼统的概念，不够精确和准确。本发明使用细胞比生长速率（μ）作为精确描述细胞生长的动力学参数，可以在一定程度上反映细胞状态。据发明人的研究结果，这一生长动力学参数与细胞周期分布、细胞在细胞周期内停留时间呈密切关系，通过特定装置组成联动系统调节，可以实现精确调控细胞状态的目标。 

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案实现的： 

一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置，用以趋向性调节和控制细胞状态，该装置至少包括：培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐、若干理生化指标检测器、在线监控系统、细胞状态调节控制装置及联动系统、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和若干可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置 连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连接所述在线监控系统，所述在线监控系统与所述流体无菌控速推动器连接并发送控速指令给所述流体无菌控速推动器，上述所有容器类装置均通过可控速管道体系进行连接，其中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统用于所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。 

优选地，所述细胞截留装置包括浓缩细胞出口和收获细胞出口，所述细胞状态调节控制装置及联动系统可择一与所述可监控细胞生物反应器的罐体、所述细胞截留装置的浓缩细胞出口或所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统至少包括三种工作联动方式： 

第一种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的浓缩细胞出口相连接时，其可将所述细胞截留装置中浓缩的细胞通过细胞截留装置上的排废细胞口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控； 

第二种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述可监控细胞生物反应器的罐体直接相连接时，其可将所述可监控细胞生物反应器内的细胞通过所述可监控细胞生物反应器上的排废口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控； 

第三种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接时，其可在所述细胞截留装置的不同截留效率态时将不同浓度的细胞通过作为排废细胞口的细胞截留装置的收获细胞出口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。 

在本发明的一优选实施例中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统包括细胞分离回流单元和细胞排出单元及细胞状态的调控系统，所述细胞分离回流单元位于所述细胞截留装置上，其可通过流体无菌控速推动器控制细胞回流速度；所述细胞排出单元选择性位于所述细胞截留装置的浓缩细胞出口、收获细胞出口或所述可监控细胞生物反应器的细胞排出口上；所述细胞状态的调控系统将所述在线监控系统的设定值反馈至所述细胞排出单元的流体无菌控速推动器，控制细胞排出的速度与排出的细胞量，当排出的细胞量达到所述细胞状态的调 控系统给出的排出细胞量后，流体无菌控速推动器停止工作。 

本发明还公开了一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，该方法包含以下步骤： 

1)对细胞培养系统进行灭菌，然后向细胞培养系统内通入无菌的PBS缓冲液或无菌培养液，循环清洗整个细胞培养系统； 

2)向细胞培养装置中接种细胞悬液，进行细胞的初级培养； 

3)当细胞生长扩增到适合表达重组蛋白的细胞密度1～100×10⁶个细胞/ml和细胞活力70%以上时，根据培养细胞的生长特性、细胞培养装置的工作体积和在线监控系统检测的细胞培养装置中理生化指标数据设定在线监控系统的各项参数，所述在线监控系统对灌注培养重组凝血八因子表达过程进行自动控制，将细胞培养装置中的各项指标维持在设定的最佳理生化条件，并调节细胞状态调节控制装置及联动系统的相应的流体无菌控速推动器，将细胞状态调节控制为表达重组凝血八因子的最适宜细胞状态，使整个系统达到稳态的指标，同时自动监控和记录整个细胞培养和重组凝血八因子表达过程； 

4)生产完成后，停止培养，产物回收纯化。 

其中优选，所述的步骤2）中，接种细胞悬液的接种密度为0.5～5×10⁶个细胞/ml。 

优选地，所述的步骤2）中，所接种的细胞是用于生产重组凝血八因子的如下工程细胞之一：CHO、HEK293、BHK或Per C.6。 

优选地，所述的步骤3）中，所述理生化指标数据包括细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控数据，该些数据通过在线监测葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酞胺、耗氧速率以及pH值指标获得，同时监测细胞比生长速率和蛋白比生成速率。 

优选地，所述的步骤3）中，检测细胞培养装置中的理生化指标数据的方法为：使细胞培养装置中的培养液没过理生化指标检测器组进行检测，并将理生化指标检测器检测和转换后的信号数据返回给在线监控系统。 

优选地，所述的步骤3）中，理生化指标检测器组可以检测的指标至少包括：温度，PH值，溶氧，溶二氧化碳，葡萄糖，乳酸，细胞密度，氨指标、液位。 

优选地，所述的步骤3）中，在线监控系统对灌注培养重组凝血八因子表达过程进行自动控制包括：在线监控系统接收理生化指标数据并处理，然后发出指令自动调节新鲜预处理培养液的添加速度和废细胞排出速度，维持细胞培养环境的理生化指标为设定的最佳理生化条件，其中，新鲜预处理培养液的添加速度是细胞截留装置上出液口的排出速度与排废细胞 口流速之和。 

优选地，所述的步骤3）中，所述最佳理生化条件至少包括：培养液添加10%-20%的血清(v/v)，若使用无血清培养液，则不添加血清；培养液温度34.5℃±5.5℃，PH值7.0±2.0，溶氧10%～65%，溶二氧化碳5%±8%。 

优选地，所述的步骤3）中，在线监控系统调节控制的细胞状态指标至少包括：细胞比生长速率，细胞周期分布，细胞周期平均停留时间。 

优选地，所述的步骤3）中，达重组凝血八因子的最适宜细胞状态至少包括：细胞周期G0/G1期细胞占30%～85%，S期细胞占15%～70%，G2/M期细胞占10%～30%且其总和为100%，细胞在G0/G1期平均停留时间2小时～80小时，S期平均停留时间4小时～40小时，G2/M期平均停留时间1小时～20小时。 

优选地，所述的步骤3）中，所述整个系统的稳态的指标主要是指乳酸生成速率，葡萄糖消耗速率比值，细胞比生长速率的值保持基本稳定。 

优选地，所述的步骤3）中，自动监控和记录整个细胞培养和重组蛋白表达过程为：设定在线监控系统自动记录每个指标探头监测数据和设备运行参数，自动记录的时间间隔为5～300秒，并存储数据。 

优选地，所述的步骤4）中，判断生产完成的标准为：细胞活率下降，或细胞总数下降明显，或蛋白表达明显降低，可通过工艺放大前的预实验结合整个系统的运行数据确定。 

与现有技术相比，本发明的有益效果如下： 

本发明提供的一种既可在线、连续、监控细胞培养环境中多种理生化指标，又可以直接调节和控制细胞状态（包括细胞周期等）的生物反应器类细胞培养装置及由该装置生产的方法，使重组凝血八因子生产过程降低染菌风险，维持细胞生长环境稳定，保持细胞恒定生长活力，达到高质、高效连续生产重组凝血八因子的目的。 

附图说明

图1为细胞周期示意图； 

图2为本发明实现可在线工业鲁棒化(industrially robust)调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置的一种实施方式的示意图； 

图3为本发明实例1的细胞的初级培养和次级培养过程细胞生长动力学图； 

图4为本发明实例1的细胞的初级培养和次级培养过程细胞周期分布柱状图； 

图5为本发明实例1的次级培养过程重组凝血八因子表达图； 

图6为本发明实例2转染后培养过程重组凝血八因子表达图。 

具体实施方式

以上的描述大致说明了本发明的内容，下面的几个具体实施例将会更直接的体现本发明的情况，但必须指出的是，在此举出的实例仅仅是为了加以说明的目的，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本发明的保护范围内。 

以下实施例中用到的可在线调节和控制CHO或HEK293细胞状态生产重组凝血八因子的装置参见图2，其主要包括：培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐（对应图中上清液收获罐）、连接设置在可监控细胞生物反应器上的若干理生化指标检测器、在线监控系统（对应图中在线监控终端）、细胞状态调节控制装置及联动系统（工作方式包括联动方式一、联动方式二和联动方式三）、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连接所述在线监控系统，所述在线监控系统与所述流体无菌控速推动器连接并发送控速指令给所述流体无菌控速推动器，上述所有容器类装置均通过可控速管道体系进行连接，其中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统用于所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。需要说明的是本示意图2的目的是帮助更好的理解本发明，而并非表明本发明的装置与方法仅仅局限于此附图所表现的形式。 

其中，所述细胞截留装置包括浓缩细胞出口和收获细胞出口，所述细胞状态调节控制装置及联动系统可择一与所述可监控细胞生物反应器的罐体、所述细胞截留装置的浓缩细胞出口或所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统至少包括三种工作联动方式，请结合图2： 

第一种（对应图2中联动方式一），当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的浓缩细胞出口相连接时，其可将所述细胞截留装置中浓缩的细胞通过细胞截留装置上的排废细胞口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控； 

第二种（对应图2中联动方式二），当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述可监 控细胞生物反应器的罐体直接相连接时，其可将所述可监控细胞生物反应器内的细胞通过所述可监控细胞生物反应器上的排废口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控； 

第三种（对应图3中联动方式三），当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接时，其可在所述细胞截留装置的不同截留效率态时将不同浓度的细胞通过作为排废细胞口的细胞截留装置的收获细胞出口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。 

所述细胞状态调节控制装置及联动系统包括细胞分离回流单元和细胞排出单元及细胞状态的调控系统，所述细胞分离回流单元可以为细胞回流口，其位于所述细胞截留装置上，并可通过流体无菌控速推动器控制细胞回流速度；所述细胞排出单元可以为废细胞排出口，其选择性位于所述细胞截留装置的浓缩细胞出口、收获细胞出口或所述可监控细胞生物反应器的细胞排出口上；所述细胞状态的调控系统将所述在线监控系统的设定值反馈至所述细胞排出单元的无菌管道控速器，控制细胞排出的速度与排出的细胞量，当排出的细胞量达到所述细胞状态的调控系统给出的排出细胞量后，流体无菌控速推动器停止工作。 

其中，具体在以下实施例中，培养液储存罐为普通圆柱或方体瓶罐结构，用以盛放无菌培养基，其出口与所述可控速管道体系密封连接，并且所述培养液储存罐通过其罐体上设置的接口及所述接口上设置的无菌滤膜过滤器连通大气。 

可监控细胞生物反应器为普通商用细胞生物反应器，具备多个理生化指标探头接口、多个液体进出口和多个气体进出口，可在无菌条件下使用或更换不同数目的液体接口或气体接口，以输送不同液流或气体进入或离开所述可监控细胞生物反应器，并可选择不同的理生化指标探头组。此外，可监控细胞生物反应器也可根据实际需要液体进出口或气体进出口的数量设置为一个。此外也可以使用具备上述同样功能的自制动物细胞生物反应器。 

理生化指标检测器均选自商用理生化指标检测器，如检测电极，其具备信号转换能力，能将理生化指标传感器检测到的理生化指标数值转化为信号并传输至所述在线监控系统，各理生化指标检测器均由电极导线与所述在线监控系统连接，其中理生化指标检测器至少包括pH值、温度、溶氧、溶CO₂、渗透压、细胞密度、葡萄糖、乳酸、氨指标、液位检测器的一种或几种。此外也可以使用具备上述同样功能的自制理生化指标检测器。 

流体无菌控速推动器选自商品蠕动泵，能以设定的速率推动液体流动，可将流速信号传输至所述在线监控系统，可通过手动或所述在线监控系统自动调节工作功率以达到控制不同 流速或停止流动的目的。此外也可以使用具备上述同样功能的自制可控速流体推动器。 

在线监控系统选自商用控制塔，其具备接收所述理生化指标传感器传输的信号、所述流体控速推动器传输的信号的功能，以及信号转换处理功能，理生化指标和流体控速推动器控制指令发出功能，数据记录存储功能，并具有完整的人机交互界面。此外也可以使用具备上述同样功能的自制在线监控系统。 

可控速管道体系由符合重组蛋白生产需求的普通硅胶管组成管道体系本体并且任何两容器类装置之间的管道体系本体上都带滑动控速夹或控速阀门，所述滑动控速夹或控速阀门设于相应装置出口处。此外，普通硅胶管还可以用高分子聚合膜材管来代替。 

以下实施例中，使用上述装置进行细胞培养的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，包含以下步骤： 

1)对细胞培养系统进行灭菌，然后向细胞培养系统内通入无菌的PBS缓冲液或无菌培养液，循环清洗整个细胞培养系统； 

2)向细胞培养装置中接种细胞悬液，进行细胞的初级培养； 

3)当细胞生长扩增到适合表达重组蛋白的细胞密度1～100×10⁶个细胞/ml和细胞活力70%以上时，根据培养细胞的生长特性、细胞培养装置的工作体积和在线监控系统检测的细胞培养装置中理生化指标数据设定在线监控系统的各项参数，所述在线监控系统对灌注培养重组凝血八因子表达过程进行自动控制，将细胞培养装置中的各项指标维持在设定的最佳理生化条件，并调节细胞状态调节控制装置及联动系统的相应的流体无菌控速推动器，将细胞状态调节控制为表达重组凝血八因子的最适宜细胞状态，使整个系统达到稳态的指标，同时自动监控和记录整个细胞培养和重组凝血八因子表达过程； 

4)生产完成后，停止培养，产物回收纯化。 

其中，所述的步骤2）中，所接种的细胞是用于生产重组凝血八因子的如下工程细胞之一：CHO、HEK293、BHK或Per C.6；接种细胞悬液的接种密度为0.5～5×10⁶个细胞/ml。 

所述的步骤3）中，所述理生化指标数据包括细胞代谢、细胞生长速率、产物合成平衡调控数据，该些数据通过在线监测葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酞胺、耗氧速率以及pH值指标获得，同时监测细胞比生长速率和蛋白比生成速率；检测细胞培养装置中的理生化指标数据的方法为：使细胞培养装置中的培养液没过理生化指标检测器组进行检测，并将理生化指标检测器检测和转换后的信号数据返回给在线监控系统；理生化指标检测器组可以检测的指标至少包括：温度，PH值，溶氧，溶二氧化碳，葡萄糖，乳酸，细胞密度，氨指标。 

所述的步骤3）中，在线监控系统对灌注培养重组凝血八因子表达过程进行自动控制包括：在线监控系统接收理生化指标数据并处理，然后发出指令自动调节新鲜预处理培养液的添加速度和废细胞排出速度，维持细胞培养环境的理生化指标为设定的最佳理生化条件，其中，新鲜预处理培养液的添加速度是细胞截留装置上出液口的排出速度与排废细胞口流速之和。 

所述的步骤3）中，所述最佳理生化条件至少包括：培养液添加10%-20%的血清(v/v)，若使用无血清培养液，则不添加血清；培养液温度34.5℃±5.5℃，PH值7.0±2.0，溶氧10%～65%，溶二氧化碳5%±8%。 

所述的步骤3）中，在线监控系统调节控制的细胞状态指标至少包括：细胞比生长速率，细胞周期分布，细胞周期平均停留时间。 

所述的步骤3）中，表达重组凝血八因子的最适宜细胞状态至少包括：细胞周期G0/G1期细胞占30%～85%，S期细胞占15%～70%，G2/M期细胞占10%～30%且其总和为100%，细胞在G0/G1期平均停留时间2小时～80小时，S期平均停留时间4小时～40小时，G2/M期平均停留时间1小时～20小时。 

所述的步骤3）中，所述整个系统的稳态的指标主要是指乳酸生成速率，葡萄糖消耗速率比值，细胞比生长速率的值保持基本稳定。 

所述的步骤3）中，自动监控和记录整个细胞培养和重组蛋白表达过程为：设定在线监控系统自动记录每个指标探头监测数据和设备运行参数，自动记录的时间间隔为5～300秒，并存储数据。 

所述的步骤4）中，判断生产完成的标准为：细胞活率下降，或细胞总数下降明显，或蛋白表达明显降低，可通过工艺放大前的预实验结合整个系统的运行数据确定。 

以下实施例为使用本发明的在线工业鲁棒化（industrially robust）调节和控制CHO细胞状态生产重组凝血八因子的方法的一些具体实例。 

实例1、可在线工业鲁棒化（industrially robust）调节和控制CHO细胞状态生物反应器生产重组凝血八因子的方法 

本实例中用到的相关试剂和装置如下： 

培养液：美国Sigma生产的Excell CD CHO无血清培养液； 

细胞：表达重组凝血八因子的CHO细胞稳定株； 

可监控细胞生物反应器：荷兰Applicon公司生产的7L动物细胞反应器，工作体积5L； 

在线监控系统：荷兰Applicon公司生产的控制塔。 

本实例中生产重组凝血八因子的方法如下： 

1)在荷兰Applicon公司生产的控制塔上设定温度37°C，PH值7.1，溶氧浓度值45%，溶二氧化碳浓度5%，由加热套控制温度，控制塔上的流量阀自动控制CO₂，N₂，O₂，AIR四路进气用鼓泡供氧的方法控制溶氧浓度和溶二氧化碳浓度，控制塔上连接有1mol/L NaOH和1mol/L HCL的蠕动泵控制PH值，根据液位电极（控制液位）的信号控制添加培养液到可监控细胞生物反应器的细胞培养装置的蠕动泵的速度；可监控细胞生物反应器的罐体上连接有补充新鲜培养液的入液口，该入液口连接培养液储存罐，可监控细胞生物反应器同时和外置式的细胞状态调节装置连接，该细胞状态调节控制装置包括细胞分离回流单元和细胞排出单元，该细胞状态调节控制装置与细胞状态的调控系统共同组成了细胞状态调节控制装置及联动系统，细胞状态调节装置还与产品收获罐（此处为上清液收获罐）相连接以将收获的上清液排出至该产品收获罐内；整套装置连接安装好后121℃、高压蒸汽灭菌20min，置于无菌室内，然后向系统内通入无菌的PBS缓冲液，循环清洗整个系统；随后，排出PBS，加入新鲜培养液，循环24h，检查是否染菌和系统运行稳定性，检验无菌后，将培养液处理至设定值，以80RPM的速度实现培养液的指标均匀； 

2）细胞的初级培养 

以1×10⁶个细胞/ml的密度制备细胞悬液，向可监控细胞生物反应器中接种细胞悬液至终浓度3×10⁵个细胞/ml，批培养96小时后，待细胞扩增到5×10⁶个细胞/ml的密度时开启灌流，灌流速率设为0.8个反应器罐体体积/天（即2.5L/天），继续培养细胞72小时，培养细胞密度至10×10⁶个细胞/ml，之后再继续培养96小时，灌注速率为1个反应器罐体体积/天（即5L/天），细胞密度可达30×10⁶个细胞/ml，细胞活力95%以上，该结果可参见图3； 

3）细胞的次级培养即表达蛋白 

初级培养完成后，在控制塔上设定温度35℃，PH值7.0，溶氧浓度值35%，溶二氧化碳浓度5%，进行灌流培养和生产重组蛋白过程，灌流初始速率设为2个反应器罐体体积/天（即10L/天），根据葡萄糖电极所测得的数据进行动态调节，将培养液中葡萄糖浓度维持在2g/L，同时在线监控系统调节细胞状态调节控制装置及联动系统的细胞回流口（是细胞分离回流单元的实施方式之一）与废细胞排出口（是细胞排出单元的实施方式之一）相连的流体控速推动器，废细胞排出口流速设置为1.5L/天，参见图4，将细胞状态调节控制为细胞比生长速率为0.34d^-1，细胞周期中S期细胞，G0/G1期细胞和G2/M期细胞所占比例分别为为12.01%、 49.10%和38.09%，细胞在G0/G1期平均停留时间2小时～80小时，S期平均停留时间4小时～40小时，G2/M期平均停留时间1小时～20小时，细胞密度达到3×10⁷个细胞/ml，细胞活力95%以上，参见图3。产品收获罐相应的以相同速率收获培养所得到的上清液，每天取样，对细胞密度，细胞活力和蛋白表达量进行检测，同时自动监控和记录整个细胞培养和蛋白表达生产过程中每个理生化指标检测器的探头监测数据和设备运行参数，设置控制塔每30秒记录一次数据并存储； 

4）生产完成 

根据控制塔记录的数据，灌流培养液进液口和出液口的蠕动泵转速基本恒定，保持在2个反应器罐体体积/天，细胞密度维持在30×10⁶个细胞/ml，细胞活力95%以上，连续灌流培养20天后，获得足够的蛋白后，收获全部上清液，停止细胞培养与表达蛋白的过程。进行下一步的蛋白纯化、质量检验及制剂准备过程。并同时关闭在线监控系统，清洗培养装置等。该步骤中判断生产完成的标准为：细胞活率下降，或细胞总数下降明显，或蛋白表达明显降低。 

根据对收获蛋白的理化性质检测结果发现，所收获蛋白的纯度和活性均和常规批次培养或者分批补料培养类似，但由于细胞密度和表达量更好，所以最终收获了更多的高活性高纯度蛋白，蛋白产量明显提高。请参见图5，使用本发明该实施例的培养系统和工艺，调节细胞培养的灌注速率，细胞保持良好的生长状态，从第5天开始表达蛋白，一直高效维持到第30天，细胞活性好，表达量维持在较高状态，各项系统控制参数良好，属于目前报道的工艺中较高水平。 

本发明的装置和方法不仅可用于基于稳定重组细胞株的生物反应器过程生产重组凝血八因子，同时也可以用于各种非稳定重组细胞株生物反应器过程（例如生物反应器基因转染瞬时表达过程）生产重组凝血八因子。以下即是具体实施例。 

实例2、可在线工业鲁棒化（industrially robust）调控生物反应器基因转染瞬时表达过程生产重组凝血八因子 

本实例中用到的试剂和仪器如下： 

培养液：美国Sigma生产的Excell293无血清培养液； 

细胞：无血清悬浮驯化HEK293细胞株； 

可监控细胞生物反应器：荷兰Applikon公司生产的3L动物细胞反应器，工作体积2.1L； 

在线监控系统：荷兰Applicon公司生产的控制塔。 

本实例中生产重组凝血八因子的方法如下： 

1)在荷兰Applikon公司生产的控制塔上设定温度37°C，PH值7.4，溶氧浓度值40%，溶二氧化碳浓度5%，由恒温水套控制温度，控制塔上的流量阀自动控制CO₂,N₂,O₂三路进气用overlay供氧的方法控制溶氧浓度和溶二氧化碳浓度，控制塔上连接有1mol/L NaOH和1mol/L HCL的蠕动泵控制PH值，根据液位电极（液位控制）的信号控制添加培养液到细胞培养装置的蠕动泵的速度，可监控细胞生物反应器通过其罐体上设置的与培养液储存罐直接连接的入液口补充新鲜培养液，可监控细胞生物反应器还与细胞截留装置、细胞状态调节控制装置及联动系统、产品收获罐（此处为上清液收获罐）相连接，以将收获的上清液排出至上清液收获罐内，整套装置连接安装好后121℃、高压蒸汽灭菌20min，置于无菌室内，然后向系统内通入无菌的PBS缓冲液，循环清洗整个系统。随后，排出PBS，加入新鲜培养液，循环24h，检查是否染菌和系统运行稳定性。检验无菌后，将培养液处理至设定值，以60RPM的速度实现培养液的指标均匀； 

2）细胞的培养 

以1×10⁶个细胞/ml的密度制备细胞悬液，向3L生物反应器中接种细胞悬液至终浓度3×10⁵个细胞/ml，不进行灌流培养的情况下培养48小时，待细胞扩增到2×10⁶个细胞/ml的密度时开启灌流，根据葡萄糖电极所测得的数据进行动态设置灌注速率从0.5L/天～4L/天，将培养液中葡萄糖浓度维持在2g/L，同时调节细胞状态调节控制装置及联动系统的回流口（是细胞分离回流单元的实施方式之一）与废细胞排出口（是细胞排出单元的实施方式之一）相连的流体无菌控速推动器，将细胞状态调节控制为细胞比生长速率为0.5d^-1，细胞周期中S期细胞，G0/G1期细胞和G2/M期细胞所占比例分别为27.36%、29.52%和43.12%，细胞在G0/G1期，S期和G2/M期的停留时间分别为6.3小时、5.8小时和4.21小时，细胞密度达到7.5×10⁶个细胞/ml，细胞活力93%，细胞状态调节控制装置及联动系统的初始运行速率设为0.3个反应器罐体体积/天（即0.63L/天），继续培养； 

3）细胞的次级培养即细胞转染表达重组蛋白 

初级培养完成后，将细胞调控至精确状态，在控制塔上设定温度33℃，PH值7.0，溶氧浓度值40%，溶二氧化碳浓度5%，停止灌流系统和细胞状态调节控制装置及联动系统，调节细胞密度至1×10⁶个细胞/mL，进行细胞转染和生产重组蛋白过程，每天取样，对细胞密度，细胞活力和蛋白表达量进行检测，进行细胞的次级培养即蛋白表达过程，同时自动监控和记录整个细胞培养和蛋白表达生产过程，设置控制塔每30秒记录一次数据并存储； 

4）生产完成 

根据控制塔记录的数据，转染后细胞密度达到最大值，重组凝血八因子表达量在转染后第四天达到最大，连续灌流培养10天后获得足够的蛋白后，收获全部上清液，停止细胞培养与表达蛋白的过程。进行一步的蛋白纯化、质量检验及制剂准备过程。并同时关闭在线监控系统，清洗培养装置等。 

对所收获蛋白进行检测，蛋白纯度在95%以上，蛋白活性良好，符合国家法规要求的蛋白原液质量标准，由于该系统通过灌注和控制细胞生理生化参数进行精确控制培养，最终培养时间延长，收获的蛋白数量明显提高，该系统具有更好的应用价值。如图6，转染之后，细胞密度维持在较高水平，蛋白表达在第三天达到最高值，然后持续到细胞密度下降，整个工艺时间长，细胞状态和活性好，最终收获了比传统系统更多的蛋白，提高了效率，降低了成本。 

在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。 

Claims (15)

1.一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置，用以趋向性调节和控制细胞状态，其特征在于，该装置至少包括：培养液储存罐、可监控细胞生物反应器、产品收获罐、若干理生化指标检测器、在线监控系统、细胞状态调节控制装置及联动系统、细胞截留装置、若干流体无菌控速推动器和若干可控速管道体系，其中，所述培养液储存罐通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器与所述可监控细胞生物反应器连接，所述细胞截留装置连接所述可监控细胞生物反应器，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体控速推动器选择性与所述可监控细胞生物反应器或所述细胞截留装置连接，所述细胞状态调节控制装置及联动系统通过所述可控速管道体系经所述流体无菌控速推动器连接所述产品收获罐，所述可监控细胞生物反应器通过所述理生化指标检测器连接所述在线监控系统，所述在线监控系统与所述流体无菌控速推动器连接并发送控速指令给所述流体无菌控速推动器，上述所有容器类装置均通过可控速管道体系进行连接，其中，所述细胞状态调节控制装置及联动系统用于所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。

2.如权利要求1所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置，其特征在于，所述细胞截留装置包括浓缩细胞出口和收获细胞出口，所述细胞状态调节控制装置及联动系统可择一与所述可监控细胞生物反应器的罐体、所述细胞截留装置的浓缩细胞出口或所述细胞截留装置的收获细胞出口相连通，所述细胞状态调节控制装置及联动系统至少包括三种工作联动方式：

第一种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的浓缩细胞出口相连接时，其可将所述细胞截留装置中浓缩的细胞通过细胞截留装置上的排废细胞口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控；

第二种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述可监控细胞生物反应器的罐体直接相连接时，其可将所述可监控细胞生物反应器内的细胞通过所述可监控细胞生物反应器上的排废口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控；

第三种，当所述细胞状态调节控制装置及联动系统与所述细胞截留装置的收获细胞出口相连接时，其可在所述细胞截留装置的不同截留效率态时将不同浓度的细胞通过作为排废细胞口的细胞截留装置的收获细胞出口排出，以达到所述可监控细胞生物反应器内不同细胞比生长速率及不同细胞状态的调控。

3.如权利要求1或2所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的装置，其特征在于，所述细胞状态调节控制装置及联动系统包括细胞分离回流单元和细胞排出单元及细胞状态的调控系统，所述细胞分离回流单元位于所述细胞截留装置上，其可通过流体无菌控速推动器控制细胞回流速度；所述细胞排出单元选择性位于所述细胞截留装置的浓缩细胞出口、收获细胞出口或所述可监控细胞生物反应器的细胞排出口上；所述细胞状态的调控系统将所述在线监控系统的设定值反馈至所述细胞排出单元的无菌管道控速器，控制细胞排出的速度与排出的细胞量，当排出的细胞量达到所述细胞状态的调控系统给出的排出细胞量后，流体无菌控速推动器停止工作。

4.一种在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)对细胞培养系统进行灭菌，然后向细胞培养系统内通入无菌的PBS缓冲液或无菌培养液，循环清洗整个细胞培养系统；

2)向细胞培养装置中接种细胞悬液，进行细胞的初级培养；

3)当细胞生长扩增到适合表达重组蛋白的细胞密度1～100×10⁶个细胞/ml和细胞活力70%以上时，根据培养细胞的生长特性、细胞培养装置的工作体积和在线监控系统检测的细胞培养装置中理生化指标数据设定在线监控系统的各项参数，所述在线监控系统对灌注培养重组凝血八因子表达过程进行自动控制，将细胞培养装置中的各项指标维持在设定的最佳理生化条件，并调节细胞状态调节控制装置及联动系统的相应的流体无菌控速推动器，将细胞状态调节控制为表达重组凝血八因子的最适宜细胞状态，使整个系统达到稳态的指标，同时自动监控和记录整个细胞培养和重组凝血八因子表达过程；

4)生产完成后，停止培养，产物回收纯化。

5.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤2）中，接种细胞悬液的接种密度为0.5～5×10⁶个细胞/ml。

6.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，所述理生化指标数据包括细胞代谢、细胞生长速率、产物合成平衡调控数据，该些数据通过在线监测葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酞胺、耗氧速率以及pH值指标获得，同时监测细胞比生长速率和蛋白比生成速率。

7.根据权利要求4或6所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，检测细胞培养装置中的理生化指标数据的方法为：使细胞培养装置中的培养液没过理生化指标检测器组进行检测，并将理生化指标检测器检测和转换后的信号数据返回给在线监控系统。

8.根据权利要求7所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，理生化指标检测器组可以检测的指标至少包括：温度，PH值，溶氧，溶二氧化碳，葡萄糖，乳酸，细胞密度，氨指标。

9.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，在线监控系统对灌注培养重组凝血八因子表达过程进行自动控制包括：在线监控系统接收理生化指标数据并处理，然后发出指令自动调节新鲜预处理培养液的添加速度和废细胞排出速度，维持细胞培养环境的理生化指标为设定的最佳理生化条件，其中，新鲜预处理培养液的添加速度是细胞截留装置上出液口的排出速度与排废细胞口流速之和。

10.根据权利要求4或9所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，所述最佳理生化条件至少包括：培养液添加10%-20%的血清(v/v)，若使用无血清培养液，则不添加血清；培养液温度34.5°C±5.5°C，PH值7.0±2.0，溶氧10%～65%，溶二氧化碳5%±8%。

11.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，在线监控系统调节控制的细胞状态指标至少包括：细胞比生长速率，细胞周期分布，细胞周期平均停留时间。

12.根据权利要求4或11所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，表达重组凝血八因子的最适宜细胞状态至少包括：细胞周期G0/G1期细胞占30%～85%，S期细胞占15%～70%，G2/M期细胞占10%～30%且其总和为100%，细胞在G0/G1期平均停留时间2小时～80小时，S期平均停留时间4小时～40小时，G2/M期平均停留时间1小时～20小时。

13.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，所述整个系统的稳态的指标主要是指乳酸生成速率，葡萄糖消耗速率比值，细胞比生长速率的值保持基本稳定。

14.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，自动监控和记录整个细胞培养和重组蛋白表达过程为：设定在线监控系统自动记录每个指标探头监测数据和设备运行参数，自动记录的时间间隔为5～300秒，并存储数据。

15.根据权利要求4所述的在线工业鲁棒化调节和控制细胞状态生产重组凝血八因子的方法，其特征在于，所述的步骤4）中，判断生产完成的标准为：细胞活率下降，或细胞总数下降明显，或蛋白表达明显降低。