CN102552899A - 应用生物反应器灌流培养制备狂犬疫苗的方法 - Google Patents

应用生物反应器灌流培养制备狂犬疫苗的方法 Download PDF

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朱昌林
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Abstract

本发明公开一种制备狂犬疫苗的方法，具体公开了一种在涉及接种量、培养液组成、反应器参数等的各项最佳条件下应用生物反应器灌流式培养制备狂犬疫苗的方法。

Description

应用生物反应器灌流培养制备狂犬疫苗的方法
技术领域
本发明涉及制备狂犬疫苗的方法，具体涉及应用生物反应器灌流培养制备狂犬疫苗的方法。
背景技术
狂犬病疫苗是预防狂犬病的唯一有效手段。采用Vero细胞做为生产基质制备狂犬疫苗是国内外目前主要采用的工艺，Vero细胞是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质。早期Vero细胞制备狂犬病疫苗大多数采用转瓶生产工艺，由于受到转瓶表面积和培养条件的限制，细胞密度低，劳动强度大，操作过程易污染，疫苗质量难以得到保证。自从60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，生物反应器便以其高密度、大规模、低成本的优势引起广泛关注。生物反应器培养工艺，具有综合成本低、批量大、批间差小、所获得病毒抗原含量高等优点。国内外许多企业对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，有多家研究机构对贴壁依赖性细胞用生物反应器流加式培养(Fed-batch culture)方法进行了研究，但尚未将灌流式培养(Perfusion culture)方法用于Vero细胞狂犬疫苗生产。灌流式培养是一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应器液体不断取出，使培养环境相对稳定。我们将生物反应器技术和灌流式培养技术结合起来，以微载体为载体，VERO细胞做为生产基质针对狂犬病疫苗大规模工业化生产进行了研究，取得了很好的效果。
生物反应器灌流式培养与流加式培养方式的原理与比较：生物反应器流加式培养的原理：通过流加高浓度葡萄糖和谷氨酰胺，使培养液中的葡萄糖和谷氨酰胺的浓度控制在设定范围内。生物反应器灌流式培养的原理：通过调节灌流速率，将反映细胞代谢活性的某一环境变量控制在设定点。使用流加式培养方式，使得细胞密度和目标产物浓度有所提高，但有时往往提高的不多。因为有三十多种甚至更多的营养物质的浓度需要控制，仅控制葡萄糖和谷氨酰胺的浓度是不高的。采用灌流式培养，可以更精确地控制培养液中的各种营养物质的浓度，使得细胞密度和目标产物浓度大幅提高，弥补了流加式培养方式的不足。
使用生物反应器灌流式培养不仅大大提高了细胞生长密度和病毒液的滴度，而且有助于产物的纯化，较其他方式的生物反应器方法进一步提高了产物的效力和产量。
发明内容
本发明将生物反应器技术和灌流式培养技术结合起来，原理是细胞生长在反应器中悬浮的微载体上，并且通过灌流式系统不断地更新培养液和提供细胞生长和病毒表达所需要的气体环境，以使细胞的生长和病毒的表达达到最佳状态。本发明还通过大量实验找出了适于该方法的涉及接种量、培养液组成、反应器参数等的各项最佳条件，采用这些条件下的生物反应器灌流培养使单位时间内病毒产量得到了很大的提高。
本发明提供一种应用生物反应器灌流培养狂犬病毒的方法，其包括以下步骤：
a)用添加有8-10％小牛血清和1-2％谷氨酰胺、PH值被调节为7.4-7.8的MEM培养基复苏VERO细胞；
b)在生物反应器中用含8-10％小牛血清的MEM溶液作为预孵液将微载体孵育20-24小时；
c)将步骤a)中的复苏VERO细胞接种至步骤b)中的包含微载体的生物反应器中进行培养，接种量为1.8×109-2.2×109个细胞，所述反应器连接有灌流系统，所述灌流系统主要由与液位电极偶联的具有补液和排液功能的蠕动泵组成；
d)反应器内细胞长满单层后，按0.1-0.001MOI加入aG加入狂犬病毒株，吸附4-5小时后开启灌流系统，补加添加有0.5-1％人血白蛋白和1-2％谷氨酰胺，PH值被调节为7.4-7.8的MEM培养基作为细胞维持液，进液量和出液量相同，反应器内培养体积恒定；
e)病毒接种48-72小时后进行病毒液收获，连续收获14-20天；
f)浓缩、灭活、纯化和稀释后，制成疫苗。
在一个优选实施方案中，步骤c)中加入的VERO细胞为由130代VERO细胞复苏至135代的细胞。
在一个更优选的实施方案中，步骤c)中加入的VERO细胞在加入反应器之前用胰蛋白酶消化。
在一个更优选的实施方案中，步骤c)中培养的反应器参数设置为温度34-37℃、转速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧20-30％。
在一个更优选的实施方案中，步骤d)中开启灌流系统后的反应器参数设置为温度34-38℃、转速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧15-25％，出液泵速25％，进液泵速100％，进液量和出液量为每24小时一个罐体积。
在一个更优选的实施方案中，步骤f)中使用PALL超滤器和截留分子量为30W的密理博膜包按20-30倍比例进行浓缩，并且超滤器的系统参数设定为温度4-8℃、泵速50-60rpm、压力差0.1-0.3pa。
在一个更优选的实施方案中，步骤f)中使用β-丙内酯作为灭活剂进行灭活，按1/3000-1/6000浓度加入，在2-8℃下灭活20-24小时，然后在37℃下水解24小时。
在一个更优选的实施方案中，步骤f)中使用阿玛西亚层析系统和琼脂糖凝胶Sepharose 4FF进行纯化，系统参数设定为波长280、温度4-8℃、泵速50-80rpm、压力0.1-0.4pa.
在一个更优选的实施方案中，步骤f)中使用的稀释液为含3％人血白蛋白溶液的PBS。
在一个更优选的实施方案中，所用微载体为GE公司的Cytodex1微载体，所用反应器为NBS公司的4500或310型反应器。
具体实施方式
以下具体描述仅出于举例的目的，而不限制本发明的范围。
本发明使用的VERO细胞来源于中国生物制品检定所。本发明使用的MEM培养基来自北大清一，小牛血清来自武汉三利小牛血清，谷氨酰胺来自北京化工厂或其他进口厂商，胰蛋白酶来自DIFCO公司，硅化液来自GIBCO公司，人血白蛋白来自奥科特法码公司，β-丙内酯来自SERVA。本发明使用的细胞计数装置由计数板和光学显微镜(OLYMPOS)组成。本发明使用的反应器为美国NBS公司4500或310型产品。本发明使用的浓缩设备为PALL超滤器，使用的滤膜为截留分子量30W的密理博膜包。本发明使用的中纯化设备为阿玛西亚层析系统，凝胶为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF。
实施例1
用加入10％小牛血清和1％谷氨酰胺的MEM培养基(调节PH值为-7.8)将130代VERO细胞进行复苏，扩增。后在转瓶中进行扩增培养至接种反应器所需的量，经胰酶消化获得139代细胞2×109个，将所得细胞导入已经加入预孵Cytodex1微载体的灭菌(高压蒸汽115-121℃ 40-60分钟)后的14L生物反应器(反应器为NBS310型)，生物反应器中已加入添加有10％小牛血清和1％谷氨酰胺的MEM培养基(调节PH值为7.4-7.8)。调整反应器参数为温度37℃、转速55rpm、pH值7.8、溶氧30％。每天取样观察细胞，细胞接种7天后按0.001MOI加入aG株狂犬病毒，吸附4小时后开启灌流系统，补加细胞维持液(添加有0.5％人血白蛋白、1％谷氨酰胺的MEM培养基，调节PH值为7.4-7.8)。调整反应器参数为温度35℃、转速50rpm、pH值7.2、溶氧20％、出液泵速25％、进液泵速100％，进液量和出液量为每24小时10L。细胞接种病毒24小时后可进行病毒液收获，连续收获20天，共收获200升病毒液。
检定疫苗病毒收获液的滴度为8.0logLD50。检定方法见中国药典第101页2.2.3项。
将收获的200升病毒液经截留分子量为30W单位的密理博膜包按压力差0.1pa进行浓缩，共收集10L病毒浓缩液。经1/4000β-丙内酯4度24小时灭活，37度2小时水解制得灭活病毒浓缩液10L，经安全检验合格后进行层析纯化，层析系统设定为波长280、温度25℃、泵速80rpm、压力0.4pa，凝胶为Sepharose 4FF。上样后收集第一峰，共收获20L纯化液，根据效力检定指标用含3％人血白蛋白溶液的PBS稀释纯化液共制备半成品40L。经分装后制得水针型狂犬病疫苗6700人份。
在细胞投入量相同的条件下本发明工艺与其他生物反应器工艺相比较，生物反应器灌流培养制备狂犬疫苗的产量是目前普遍采用的生产方法的培养产量的10倍。
实施例2
用加入8％小牛血清和2％谷氨酰胺的MEM培养基(调节PH值为7.4-7.8)将130代VERO细胞进行复苏，扩增。后在转瓶中进行扩增培养至接种反应器所需的量，经胰酶消化获得139代细胞2×109个，将所得细胞导入已经加入预孵Cytodex1微载体的灭菌(高压蒸汽115-121℃ 40-60分钟)后的14L生物反应器(反应器为NBS310型)，生物反应器中已加入添加有8％小牛血清和2％谷氨酰胺的MEM培养基(调节PH值为7.4-7.8)。调整反应器参数为温度37℃、转速55rpm、pH值7.8、溶氧30％。每天取样观察细胞，细胞接种7天后按0.001MOI加入aG株狂犬病毒，吸附4小时后开启灌流系统，补加细胞维持液(添加有1％人血白蛋白、2％谷氨酰胺的MEM培养基，调节PH值为7.4-7.8)。调整反应器参数为温度35℃、转速50rpm、pH值7.8、溶氧20％、出液泵速25％、进液泵速100％，进液量和出液量为每24小时10L。细胞接种病毒24小时后可进行病毒液收获，连续收获20天，共收获200升病毒液。
检定疫苗病毒收获液的滴度为7.85logLD50。检定方法见中国药典第101页2.2.3项。
将收获的200升病毒液经截留分子量为30W单位的密理博膜包按压力差0.1pa进行浓缩，共收集9.5L病毒浓缩液。经1/4000β-丙内酯4度24小时灭活，37度2小时水解制得灭活病毒浓缩液9.5L，经安全检验合格后进行层析纯化，层析系统设定为波长280、温度25℃、泵速80rpm、压力0.4pa，凝胶为Sepharose 4FF。上样后收集第一峰，共收获19L纯化液，根据效力检定指标用含3％人血白蛋白溶液的PBS稀释纯化液共制备半成品38L。经分装后制得水针型狂犬病疫苗6300人份。
实施例3
用加入9％小牛血清和1.5％谷氨酰胺的MEM培养基(调节PH值为7.4-7.8)将130代VERO细胞进行复苏，扩增。后在转瓶中进行扩增培养至接种反应器所需的量，经胰酶消化获得139代细胞2×109个，将所得细胞导入已经加入预孵Cytodex1微载体的灭菌(高压蒸汽115-121℃ 40-60分钟)后的14L生物反应器(反应器为NBS310型)，生物反应器中已加入添加有9％小牛血清和1.5％谷氨酰胺的MEM培养基(调节PH值为7.4-7.8)。调整反应器参数为温度37℃、转速55rpm、pH值7.8、溶氧30％。每天取样观察细胞，细胞接种7天后按0.001 MOI加入aG株狂犬病毒，吸附4小时后开启灌流系统，补加细胞维持液(添加有0.8％人血白蛋白、1.5％谷氨酰胺的MEM培养基，调节PH值为7.4-7.8)。调整反应器参数为温度35℃、转速50rpm、pH值7.5、溶氧20％、出液泵速25％、进液泵速100％，进液量和出液量为每24小时10L。细胞接种病毒24小时后可进行病毒液收获，连续收获20天，共收获200升病毒液。
检定疫苗病毒收获液的滴度为7.65logLD50。检定方法见中国药典第101页2.2.3项。
将收获的200升病毒液经截留分子量为30W单位的密理博膜包按压力差0.1pa进行浓缩，共收集L病毒浓缩液。经1/4000β-丙内酯4度24小时灭活，37度2小时水解制得灭活病毒浓缩液9L，经安全检验合格后进行层析纯化，层析系统设定为波长280、温度25℃、泵速80rpm、压力0.4pa，凝胶为Sepharose 4FF。上样后收集第一峰，共收获18L纯化液，根据效力检定指标用含3％人血白蛋白溶液的PBS稀释纯化液共制备半成品36L。经分装后制得水针型狂犬病疫苗6000人份，1.0ml/支。
检定疫苗的效力达到了5.5IU。检定方法见(中国药典附录XI A)。

Claims (10)

1.一种应用生物反应器灌流培养狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)用添加有8-10％小牛血清和1-2％谷氨酰胺、PH值被调节为7.4-7.8的MEM培养基复苏VERO细胞；
b)在生物反应器中将微载体用含8-10％小牛血清的MEM溶液作为预孵液孵育20-24小时；
c)将步骤a)中的复苏VERO细胞接种至步骤b)中的包含微载体的生物反应器中进行培养，接种量为1.8×109-2.2×109个细胞，所述反应器连接有灌流系统，所述灌流系统主要由与液位电极偶联的具有补液和排液功能的蠕动泵组成；
d)反应器内细胞长满单层后，按0.1-0.001MOI加入aG加入狂犬病毒株，吸附4-5小时后开启灌流系统，补加添加有0.5-1％人血白蛋白和1-2％谷氨酰胺，PH值被调节为7.4-7.8的MEM培养基作为细胞维持液，进液量和出液量相同，反应器内培养体积恒定；
e)病毒接种48-72小时后进行病毒液收获，连续收获14-20天；
f)浓缩、灭活、纯化和稀释后，制成疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中加入的VERO细胞为由130代VERO细胞复苏至135代的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c)中使用的VERO细胞在加入反应器之前用胰蛋白酶消化。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)中培养的反应器参数设置为温度34-37℃、转速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧20-30％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤d)中开启灌流系统后的反应器参数设置为温度34-38℃、转速50-55rpm、pH值7.2-7.8、溶氧15-25％，出液泵速25％，进液泵速100％，进液量和出液量为每24小时一个罐体积。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤f)中使用PALL超滤器和截留分子量为30W的密理博膜包按20-30倍比例进行浓缩，并且超滤器的系统参数设定为温度4-8℃、泵速50-60rpm、压力差0.1-0.3pa。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤f)中使用β-丙内酯作为灭活剂进行灭活，按1/3000-1/6000浓度加入，在2-8℃下灭活20-24小时，然后在37℃下水解24小时。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤f)中使用阿玛西亚层析系统和琼脂糖凝胶Sepharose 4FF进行纯化，系统参数设定为波长280、温度4-8℃、泵速50-80rpm、压力0.1-0.4pa.
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤f)中使用的稀释液为含3％人血白蛋白溶液的PBS。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所用微载体为GE公司的Cytodex1微载体，所用反应器为NBS公司的4500或310型反应器。
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