CN103725735A - 一种从短小芽孢杆菌e14中分离抗菌蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法，该方法通过发酵生产制得发酵菌液；离心制得上清液；然后用硫酸铵沉淀，所得沉淀用缓冲液重悬，得重悬液；通过离子交换法分离，收集洗脱峰、浓缩、透析，得活性成分分离峰。再通过抗菌活性检测和蛋白质电泳检测，测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0kD之间。本发明方法设计简单合理，操作方便，通过本发明方法可以分离得到具有抗哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）效果的蛋白质。

Description

一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法

技术领域

 本发明涉及一种抗菌蛋白质的制备方法，特别是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法。

背景技术

近三十年来，我国渔业取得了长足发展，水产品产量连续十多年居世界首位，是世界上唯一一个养殖产量超过捕捞产量的国家，水产品出口也已占农产品出口净收入的50%以上。渔业已经成为我国大农业中发展最快的产业之一，在促进农村产业结构调整、增加农民收入、保障食物安全、优化国民膳食结构以及维护国家海洋权益等方面做出了重要贡献。然而随着水产养殖业的不断发展，养殖规模的不断扩大，病害发生的频率越来越高、造成的损失也越来越大。

引起海水养殖病害的微生物主要有病毒、细菌和真菌，在细菌当中，弧菌是引起海水养殖品种中细菌性疾病的最重要的病原菌之一，流行面积广并且发病率高，给养殖业造成了巨大的危害，弧菌已成为水产领域长期以来的一大研究热点。

目前防治此类病害大多使用抗生素和化学合成药物，其对产品质量的影响显而易见，因此研究开发抗生素的替代品就显得十分迫切和重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法设计合理、可操作性强、分离的产物纯度高的从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）发酵生产：取培养过夜的短小芽孢杆菌E14（Bacillus  pumilus）将短小芽孢杆菌E14种子菌液接种于2216E液体培养基中，接种量为5%，180rpm，28℃培养24h；得发酵菌液；

（2）上清液制备：发酵菌液1200rpm，4℃离心30min，上清液再次离心，重复2-3次；得上清液；

（3）硫酸铵沉淀：将硫酸铵烘干磨细，依据饱和硫酸铵溶液配制表，分别称取不同等份，冰上边搅拌边加入上清液中，获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液，然后冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心5 min；取上清，继续冰上边搅拌边加入硫酸铵，至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液，冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心30 min，沉淀用缓冲液重悬，重悬体积为沉淀前上清液的1/10，得重悬液；缓冲液为50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，含150 mmoL NaCl，50 mmoL EDTA；

（4）离子交换法分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow即DEAE FF分离；

装柱：根据柱子大小，取适量的DEAE FF，加入适量的buffer A即50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，用玻璃棒轻轻搅拌，将其引流到层析柱中； 

平衡柱子：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统上操作，buffer A平衡10倍柱体积，流速1.0 mL/min；

上样与洗脱：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统中设置程序，完全自动进行，全程流速1.0 mL/min，当A₂₈₀ 大于0.05时开始收集，每管收集1.5 mL，程序如下： V为柱体积：

①  buffer A再平衡5×V；

②  重悬液上样80 mL；

③  buffer A平衡5×V；

④  buffer B即50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，0.8 mol/L NaCl，由0 % - 100 % 梯度洗脱10×V；

⑤  buffer B洗脱5×V；

⑥  buffer A洗脱5×V；

（5）收集、浓缩、透析：将洗脱峰收集，同一峰的各试管合并，-70 ℃冰箱预冷过夜，用LG-5冷冻干燥机浓缩；冻干样品用适量buffer C溶解，移至截留分子量为30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h，中间换透析液一次，得活性成分分离峰；buffer C为50 mM Tris-HCl pH8.0，含50 mmol NaCl，0.5 mmol EDTA；

（6）抗菌活性检测：抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法： 将过夜培养的病原菌-哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上，待培养基表面稍干后，将直径为6 mm的无菌滤纸片放置于培养皿中，然后吸取50 μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上，28℃培养，16 h后观察抑菌圈，测量抑菌圈大小；

（7）蛋白质电泳检测；对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS-PAGE电泳检测，按常规SDS-PAGA技术规程操作，测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0 kD之间。

与现有技术相比，本发明方法设计简单合理，操作方便，通过本发明方法可以分离得到具有抗哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）效果的蛋白质。

附图说明

图1为短小芽孢杆菌E14活性成分化学属性及其在在细胞中位置的确定图；其中：1为短小芽孢杆菌E14菌液，2为上清液，3为沉淀，4为水煮处理，5为蛋白酶K处理，6为2216E；

图2为不同硫酸铵浓度沉淀的活性成分图；其中：图中数字为沉淀活性成分时的硫酸铵浓度，ck₁为透析缓冲液；ck₂为80%硫酸铵；

图3为短小芽孢杆菌E14活性成分DEAE FF分离图谱；

图4为短小芽孢杆菌E14活性成分DEAE FF分离峰抑菌活性图；其中：1为透析前，2为透析后，ck₁为透析液；ck₂为无菌水；

图5为短小芽孢杆菌E14活性成分DEAE FF分离峰蛋白电泳结果图；其中：1为透析前，2为透析后，ck₁为透析液；ck₂为无菌水。

具体实施方式

以下参照附图进一步描述本发明的具体技术方案，以便本领域技术人员进一步的理解本发明，而不构成对本发明权利要求的限制。

实施例1，一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法，其步骤如下：

（1）发酵生产：取培养过夜的短小芽孢杆菌E14（Bacillus  pumilus）将短小芽孢杆菌E14种子菌液接种于2216E液体培养基中，接种量为5%，180rpm，28℃培养24h；得发酵菌液；

（2）上清液制备：发酵菌液1200rpm，4℃离心30min，上清液再次离心，重复2-3次；得上清液；

（3）硫酸铵沉淀：将硫酸铵烘干磨细，依据饱和硫酸铵溶液配制表，分别称取不同等份，冰上边搅拌边加入上清液中，获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液，然后冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心5 min；取上清，继续冰上边搅拌边加入硫酸铵，至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液，冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心30 min，沉淀用缓冲液重悬，重悬体积为沉淀前上清液的1/10，得重悬液；缓冲液为50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，含150 mmoL NaCl，50 mmoL EDTA；

（4）离子交换法分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow即DEAE FF分离；

装柱：根据柱子大小，取适量的DEAE FF，加入适量的buffer A即50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，用玻璃棒轻轻搅拌，将其引流到层析柱中； 

平衡柱子：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统上操作，buffer A平衡10倍柱体积，流速1.0 mL/min；

上样与洗脱：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统中设置程序，完全自动进行，全程流速1.0 mL/min，当A₂₈₀ 大于0.05时开始收集，每管收集1.5 mL，程序如下： V为柱体积：

①  buffer A再平衡5×V；

②  重悬液上样80 mL；

③  buffer A平衡5×V；

④  buffer B即50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，0.8 mol/L NaCl，由0 % - 100 % 梯度洗脱10×V；

⑤  buffer B洗脱5×V；

⑥  buffer A洗脱5×V；

（5）收集、浓缩、透析：将洗脱峰收集，同一峰的各试管合并，-70 ℃冰箱预冷过夜，用LG-5冷冻干燥机浓缩；冻干样品用适量buffer C溶解，移至截留分子量为30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h，中间换透析液一次，得活性成分分离峰；buffer C为50 mM Tris-HCl pH8.0，含50 mmol NaCl，0.5 mmol EDTA；

（6）抗菌活性检测：抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法： 将过夜培养的病原菌哈维氏弧菌3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上，待培养基表面稍干后，将直径为6 mm的无菌滤纸片放置于培养皿中，然后吸取50 μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上，28℃培养，16 h后观察抑菌圈，测量抑菌圈大小；

（7）蛋白质电泳检测；对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS-PAGE电泳检测，按常规SDS-PAGA技术规程操作，测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0 kD之间。

实施例2，参照图1－5，从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法实验：

1.实验方法

1.1短小芽孢杆菌E14拮抗活性的检测

短小芽孢杆菌E14，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保存，保存号CGMCC No.6682。

本研究采用滤纸片抑菌圈法。将短小芽孢杆菌E14接种于2216E液体培养基中，28℃培养20 h，吸取0.l mL培养液均匀涂抹于2216E固体培养基平板上，待培养基表面稍干后，将直径为6 mm的无菌滤纸片放置于培养皿中，然后吸取50 μL待测拮抗菌分次滴加于滤纸片上，28℃培养，16 h后观察抑菌圈、测量抑菌圈大小。

1.2  短小芽孢杆菌E14活性物质在细胞中位置的确定

取培养过夜的液体短小芽孢杆菌E14 1 mL菌液，于12000 rpm 离心30 min，留上清备用。沉淀用等体积2216E重悬、超声破碎，然后取过夜发酵菌液、发酵菌液上清液及沉淀重悬液各50 μL进行抑菌活性检测。

1.3  短小芽孢杆菌E14活性物质属性的判断

处理1，取过夜发酵菌液约200μL，95℃水煮10 min；处理2，取过夜发酵菌液约200μL，按终浓度0.1 mg/mL添加蛋白酶K，55℃水浴4 h。分别将处理1、处理2及过夜发酵菌液50 μL进行抑菌活性检测。

1.4  短小芽孢杆菌E14活性物质的分离纯化

根据前述研究结果，视活性成分的化学属性和在细胞中的位置，分别选用不同的分离纯化方法，本实验以胞外蛋白质类活性成分的分离纯化为例说明研究方法。

1.4.1    短小芽孢杆菌E14活性成分的粗分离—硫酸铵分级沉淀法

（1）      短小芽孢杆菌E14发酵液上清液的制备：将过夜培养的发酵液在12000 rpm，4℃离心30 min，取上清，再离心，至不再有沉淀为止；

（2）      短小芽孢杆菌E14活性成分的小量制备：首先配制硫酸铵饱和溶液，通过调整发酵液上清液与饱和硫酸铵的比例（冰上操作），分别制备20%，40%，60%和80%硫酸铵的沉淀物，依次检测各浓度下沉淀物的抑菌活性，获得不同拮抗菌活性成分可选用的最适硫酸铵浓度；

（3）      短小芽孢杆菌E14活性成分的大量制备：以步骤（2）中获得的最适硫酸铵浓度为依据，称取适量固体硫酸铵（注意用前烘干磨细），冰上边搅拌边加入发酵液上清液中，然后静置20 min，沉淀用少量缓冲液（50 mmol Tris-HCl pH 8.0，含150 mmol NaCl, 50 mmol EDTA）重悬，部分用于检测抑菌活性，部分用于后续实验。

1.4.2    短小芽孢杆菌E14活性成分的细分级分离—离子交换法

采用DEAE Sepharose Fast Flow(以下简称DEAE FF)分离。

（1）      装柱：根据柱子大小，取适量的DEAE FF，加入适量的buffer A（50 mmoL Tris-HCl pH 8.0），用玻璃棒轻轻搅拌，将其引流到层析柱中； 

（2）      平衡柱子：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统上操作，buffer A平衡10倍柱体积，流速1.0 mL/min；

（3）      上样与洗脱：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统中设置程序，完全自动进行，全程流速1.0 mL/min，当A₂₈₀ 大于0.05时开始收集，每管收集1.5 mL，程序如下（下文V为柱体积）：

①  buffer A再平衡5×V；

②  上样80 mL，可根据样品体积调整；

③  buffer A平衡5×V；

④  buffer B（50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，0.8 mol/L NaCl）由0 % - 100 % 梯度洗脱10×V；

⑤  buffer B洗脱5×V；

⑥  buffer A洗脱5×V；

（4）      收集、浓缩、透析和保存。将洗脱峰收集，同一峰的各试管合并，-70 ℃冰箱预冷过夜，用LG-5冷冻干燥机浓缩。冻干样品用少量buffer C（50 mM Tris-Cl pH8.0，含50 mM NaCl，0.5 mM EDTA）溶解，移至截留分子量为30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h，中间换透析液一次，透析后的样品用于抗菌活性实验或应用。

1.5  短小芽孢杆菌E14活性成分分子量测定

常规SDS-PAGE电泳检测。

2.     实验结果

3.1短小芽孢杆菌E14活性成分化学属性及其在在细胞中位置的确定

按方法2.1-2.3操作，结果如图1。

95℃加热和蛋白酶K处理均可使拮抗菌丧失活性，表明该活性物质为蛋白质类；沉淀重悬液无抑菌活性以及上清液具有抑菌活性，说明抑菌活性成分被分泌在细胞外。

2.2  短小芽孢杆菌E14活性物质的粗分离

按方法2.4.1操作，不同硫酸铵浓度沉淀的活性成分，其抑菌活性如图2。

由图2看出，浓度为60%和80%的硫酸铵溶液均可析出具有抑菌活性的活性成分，其中80%硫酸铵抑菌活性更强。因此后续实验大量制备活性成分时选用80%的硫酸铵浓度。

2.3  短小芽孢杆菌E14活性物质的纯化

按方法2.4.2操作，梯度洗脱峰比较单一，如图3。收集分离峰，经抑菌活性检测（图4），证明该峰就是目标物即拮抗物质。

2.4  短小芽孢杆菌E14活性成分分子量测定

按常规SDS-PAGA技术规程操作，经离子交换层析分离的目标峰，电泳结果如图5（透析后浓度比较小，未显示电泳条带）。可见短小芽孢杆菌E14的拮抗物质分子量在在97.2-116.0 kD之间。

Claims (1)

1.一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）发酵生产：取培养过夜的短小芽孢杆菌E14（Bacillus  pumilus）将短小芽孢杆菌E14种子菌液接种于2216E液体培养基中，接种量为5%，180rpm，28℃培养24h；得发酵菌液；

（2）上清液制备：发酵菌液1200rpm，4℃离心30min，上清液再次离心，重复2-3次；得上清液；

（3）硫酸铵沉淀：将硫酸铵烘干磨细，依据饱和硫酸铵溶液配制表，分别称取不同等份，冰上边搅拌边加入上清液中，获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液，然后冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心5 min；取上清，继续冰上边搅拌边加入硫酸铵，至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液，冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心30 min，沉淀用缓冲液重悬，重悬体积为沉淀前上清液的1/10，得重悬液；缓冲液为50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，含150 mmoL NaCl，50 mmoL EDTA；

（4）离子交换法分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow即DEAE FF分离；

装柱：根据柱子大小，取适量的DEAE FF，加入适量的buffer A即50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，用玻璃棒轻轻搅拌，将其引流到层析柱中； 

平衡柱子：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统上操作，buffer A平衡10倍柱体积，流速1.0 mL/min；

上样与洗脱：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统中设置程序，完全自动进行，全程流速1.0 mL/min，当A₂₈₀ 大于0.05时开始收集，每管收集1.5 mL，程序如下： V为柱体积：

buffer A再平衡5×V；

重悬液上样80 mL；

buffer A平衡5×V；

buffer B即50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，0.8 mol/L NaCl，由0 % - 100 % 梯度洗脱10×V；

buffer B洗脱5×V；

buffer A洗脱5×V；

（5）收集、浓缩、透析：将洗脱峰收集，同一峰的各试管合并，-70 ℃冰箱预冷过夜，用LG-5冷冻干燥机浓缩；冻干样品用适量buffer C溶解，移至截留分子量为30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h，中间换透析液一次，得活性成分分离峰；buffer C为50 mmol Tris-Cl pH8.0，含50 mmol NaCl，0.5 mmol EDTA；

（6）抗菌活性检测：抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法： 将过夜培养的病原菌哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上，待培养基表面稍干后，将直径为6 mm的无菌滤纸片放置于培养皿中，然后吸取50 μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上，28℃培养，16 h后观察抑菌圈，测量抑菌圈大小；

（7）蛋白质电泳检测；对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS-PAGE电泳检测，按常规SDS-PAGA技术规程操作，测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0 kD之间。

Images