CN105002240A - 一种抗菌素及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗菌素及其制备方法与应用，制备方法为：先将乳酸乳球菌ATCC？11454菌种活化后，挑取单菌落进行培养，离心去除菌种得到发酵液，将发酵液pH调至2后再利用旋转蒸发浓缩，再将pH调至初始值然后离心后取上清，过滤处理后得到发酵浓缩液；将发酵浓缩液与PBS缓冲液混合，再加入Triton？X-114和MgSO₄构成的双水相体系，离心使双水相达到相平衡后取上相，再用PBS缓冲液稀释后制得含乳酸链球菌素和Triton？X-114的抗菌素。本发明的抗菌素对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌效果。本发明的抗菌素包含Nisin和Triton？X-114，两者的结合使得抗菌素具有较高的效价。本发明的提取工艺简单、成本低，适用于间歇性和规模化生产加工高效价、高收率的抗菌素。

Description

一种抗菌素及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体涉及一种抗菌素及其制备方法与应用。

背景技术

Nisin亦称乳酸链球菌素，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，是一种细菌抗菌肽，仅有34个氨基酸组成，分子量为3510Da左右，其活性分子常以二聚体和四聚体的形式存在。乳酸链球菌素由亲水端和疏水端构成，是典型的表面活性物质。Nisin对大多数革兰氏阳性细菌均有抑制能力，产芽孢的革兰氏阳性菌种对Nisin尤其敏感。在一般情况下，Nisin对革兰氏阴性菌种、酵母和霉菌无抑制效果。因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。食用后在人体的生理pH条件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，具有高效、无毒、无残留、无耐药性、耐酸、耐高温、安全、高效等优点，在生物饲料添加、食品防腐保鲜以及药物治疗方面有着广阔的应用前景。

目前Nisin的生产主要以乳酸乳球菌为生产菌，采用经蛋白酶处理的巴氏灭菌奶和酵母膏作为培养基，在一定条件下进行发酵、提取获得。工业上常用的提取方法有有机溶剂法、吸附法、膜分离法和柱层析法。有机溶剂法是分离Nisin的经典方法，操作简便，但回收率低，产物活性低；吸附法能使产物保持较高的活性，但当发酵液中的Nisin浓度超过细胞吸附能力时，只能回收部分Nisin，损失率较高；用膜分离法得到的产物纯化效果不佳，杂质较多；柱层析法能获得较高纯度的产物，但是处理量小，分离时间长。

这些分离纯化工艺的不足导致Sigma公司生产的Nisin价格昂贵，纯度只有2.5％；而国产的Nisin价格虽然不高，其效价、纯度和稳定性都非常低。这使得高效价、高纯度Nisin的获得及其广泛应用受到影响。

发明内容

本发明目的在于提供一种抗菌素及其制备方法解决现有乳酸链球菌素生产时分离纯化工艺的不足，价格昂贵，效价、纯度和稳定性都非常低等问题。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：

本发明的抗菌素的制备方法包括如下步骤：

步骤一，将乳酸乳球菌ATCC 11454菌种活化后，挑取单菌落进行培养，离心处理后去除菌种，获得乳酸乳球菌发酵液；

步骤二，将步骤一所得发酵液pH调至2以下，再利用旋转蒸发浓缩，再将pH调至初始值，然后离心处理后取上清，过滤处理后得到乳酸乳球菌发酵浓缩液；

步骤三，取步骤二所得发酵浓缩液与PBS缓冲液以重量比2:1混合，再加入Triton X-114和MgSO₄混合液构成双水相体系，离心处理使双水相达到相平衡后取上相，再用PBS缓冲液稀释后制得包含乳酸链球菌素和Triton X-114的抗菌素。

该方法通过乳酸乳球菌的培养、旋转蒸发浓缩和Triton X-114/MgSO₄双水相体系萃取制得抗菌素，抗菌素中包含抗菌肽乳酸链球菌素和具有抑菌效果的表面活性剂Triton X-114，两者的结合起协同作用使得抗菌素具有较高的效价。

抗菌肽乳酸链球菌素在酸性条件下耐高温，旋转蒸发前先将发酵液pH调至2以下有利于避免活性损失。

进一步的，步骤一所述培养包括活化培养24-26h，平板划线培养18-20h，种子液培养20-22h和扩大培养16-18h；所述培养均在29-31℃恒温培养箱中。

进一步的，步骤二所述过滤处理为用0.2-0.25μm的滤膜过滤至少一次除菌。

进一步的，步骤三所述发酵浓缩液、所述Triton X-114和所述MgSO₄重量比为(15.5-15.7)：(0.95-1.05)：(0.144-0.156)；所述PBS缓冲液浓度为0.018-0.022M。

进一步的，所述双水相体系的相比为0.21-0.23。

进一步的，所述离心处理为在24-26℃，11000-13000rpm的条件下离心28-32min。

一种上述制备方法制备的抗菌素。

上述抗菌素的应用，主要是对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌效果。

进一步的，所述革兰氏阳性细菌包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌。其抑菌效果顺序为：枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>酿脓链球菌，而对三种革兰氏阴性菌种(大肠杆菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌)均无明显抑制作用。抗菌素抑菌活性用其抑菌效价衡量，所用方法为琼脂扩散法，选用金黄色葡萄球菌为敏感菌。

进一步的，所述抗菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效价为9143IU/mL，抗菌素中富集分离得到的乳酸链球菌素效价为3210IU/mL。本发明所得抗菌素抑菌活性用其抑菌效价衡量，所用方法为琼脂扩散法，选用金黄色葡萄球菌为敏感菌。对金黄色葡萄球菌的抑菌效价可达到Sigma公司乳酸链球菌素标准品(0.01g/mL)效价的91.43％。抗菌素中富集分离得到的乳酸链球菌素效价占抗菌素总效价的35.11％。

与现有技术相比，本发明采用旋转蒸发浓缩和Triton X-114/MgSO₄双水相萃取，避免了传统提取技术活性低、收率低等弊端，提取工艺简单、成本低，适用于间歇性和规模化生产加工高效价、高收率的抗菌素成品。本发明制得的抗菌素同时包含抗菌肽乳酸链球菌素和表面活性剂Triton X-114，两者的结合起协同作用使得抗菌素具有较高的效价，对革兰氏阳性菌种有良好的抑菌效果。

附图说明

图1是本发明的抗菌素制备工艺流程图；

图2是本发明实施例中发酵浓缩液的Tricine-SDS-PAGE图，M表示Marker，F表示发酵浓缩液，S表示Sigma公司生产的乳酸链球菌素标准品；

图3是进行抑菌实验时标准品与样品的加样方式，Si表示乳酸链球菌素标准品，U1表示未知效价样品；

图4是本发明制得的抗菌素与双水相分配乳酸乳球菌培养基对金黄色葡萄球菌的抑菌效价，实验组是抗菌素，对照组双水相分配乳酸乳球菌培养基；上相是乳酸链球菌素和Triton X-114的抗菌素，下相是MgSO₄和相对少量损失的乳酸链球菌素和Triton X-114；

图5是本发明制得的抗菌素与发酵浓缩液的抑菌效价对比图；上相即是含乳酸链球菌素和Triton X-114的抗菌素；

图6是本发明制得的抗菌素对枯草芽孢杆菌的抑制效果；

图7是本发明制得的抗菌素对酿脓链球菌的抑制效果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

抗菌素的制备

(1)制备乳酸乳球菌发酵液：根据表1的配方配制培养基，在115℃灭菌30min后，将购买的菌种乳酸乳球菌ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在30℃恒温培养箱中活化培养24h。待菌种活化后，将25mL固体培养基倒入平板中，用接种针取少许活化好的菌液划线接种于平板上，在30℃条件下培养18h。长出菌种后，挑取单菌落接种于30mL种子液培养基中，在30℃恒温培养箱中培养20h。然后将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中进行发酵培养，培养条件为30℃培养16h。培养完毕后，将发酵液在25℃，12000rpm的条件下离心30min，取上清液，制得乳酸乳球菌发酵液。

表1 乳酸乳球菌ATCC 11454培养基配方

(2)制备乳酸乳球菌发酵浓缩液：准确量取90mL发酵液，记录初始发酵液的pH值，用浓盐酸将其pH调至2以下，经过旋转蒸发将体积浓缩6倍，再用固体NaOH将浓缩后的发酵液pH调回初始值。将浓缩后的发酵液在25℃，12000rpm的条件下离心30min后，弃沉淀用0.22μm的滤膜过滤一次除菌，制得乳酸乳球菌发酵浓缩液。

(3)制备抗菌素：取50mL离心管，加入Triton X-1140.8g，25％的MgSO4溶液0.48g，乳酸乳球菌发酵浓缩液12.48g，0.02M PBS 6.24g，配制成20g双水相体系。在室温下混匀30min后，将双水相放入超速离心机中，在25℃，12000rpm的条件下离心30min，取上相，用0.02M PBS稀释8倍即可获得抗菌素。

实施例2

抗菌素的制备

(1)制备乳酸乳球菌发酵液：根据表1的配方配制培养基，在115℃灭菌30min后，将购买的菌种乳酸乳球菌ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在29℃恒温培养箱中活化培养24h。待菌种活化后，将25mL固体培养基倒入平板中，用接种针取少许活化好的菌液划线接种于平板上，在29℃条件下培养18h。长出菌种后，挑取单菌落接种于30mL种子液培养基中，在29℃恒温培养箱中培养20h。然后将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中进行发酵培养，培养条件为29℃培养16h。培养完毕后，将发酵液在24℃，11000rpm的条件下离心28min，取上清液，制得乳酸乳球菌发酵液。

(2)制备乳酸乳球菌发酵浓缩液：准确量取90mL发酵液，记录初始发酵液的pH值，用浓盐酸将其pH调至2以下，经过旋转蒸发将体积浓缩6倍，再用固体NaOH将浓缩后的发酵液pH调回初始值。将浓缩后的发酵液在24℃，11000rpm的条件下离心28min后，弃沉淀用0.2μm的滤膜过滤两次除菌，制得乳酸乳球菌发酵浓缩液。

(3)制备抗菌素：取50mL离心管，加入Triton X-1140.76g，25％的MgSO₄溶液0.46g，乳酸乳球菌发酵浓缩液12.4g，0.018M PBS 6.2g，配制成20g双水相体系。在室温下混匀30min后，将双水相放入超速离心机中，在24℃，11000rpm的条件下离心28min，取上相，用0.018M PBS稀释8倍即可获得抗菌素。

实施例3

抗菌素的制备

(1)制备乳酸乳球菌发酵液：根据表1的配方配制培养基，在115℃灭菌30min后，将购买的菌种乳酸乳球菌ATCC 11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在31℃恒温培养箱中活化培养26h。待菌种活化后，将25mL固体培养基倒入平板中，用接种针取少许活化好的菌液划线接种于平板上，在31℃条件下培养20h。长出菌种后，挑取单菌落接种于30mL种子液培养基中，在31℃恒温培养箱中培养22h。然后将培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中进行发酵培养，培养条件为31℃培养18h。培养完毕后，将发酵液在26℃，13000rpm的条件下离心32min，取上清液，制得乳酸乳球菌发酵液。

(2)制备乳酸乳球菌发酵浓缩液：准确量取90mL发酵液，记录初始发酵液的pH值，用浓盐酸将其pH调至2以下，经过旋转蒸发将体积浓缩6倍，再用固体NaOH将浓缩后的发酵液pH调回初始值。将浓缩后的发酵液在26℃，13000rpm的条件下离心32min后，弃沉淀用0.25μm的滤膜过滤三次除菌，制得乳酸乳球菌发酵浓缩液。

(3)制备抗菌素：取50mL离心管，加入Triton X-1140.84g，25％的MgSO₄溶液0.5g，乳酸乳球菌发酵浓缩液12.56g，0.022M PBS 6.28g，配制成20g双水相体系。在室温下混匀30min后，将双水相放入超速离心机中，在26℃，13000rpm的条件下离心32min，取上相，用0.022M PBS稀释8倍即可获得抗菌素。

按照实施例1、实施例2和实施例3所述方法制备的抗菌素做如下检测。

一、发酵浓缩液中乳酸链球菌素的鉴定

(1)TCA-丙酮沉淀：取未开封的500g TCA药品，加入227mL超纯水，用磁力搅拌器混匀溶解，配制成100％的TCA溶液。将1.35mL乳酸乳球菌发酵浓缩液与0.15mL 100％的TCA溶液均匀混合，放置于-20℃的冰箱中静置沉淀2h，取出后在4℃，14000rpm的条件下离心15min，弃上清。在沉淀中加入0.2mL冷丙酮清洗，然后在4℃，14000rpm的条件下离心10min，弃上清，反复操作两次。将得到的沉淀放入37℃烘箱中烘干5min，加入裂解液(6M尿素+2M硫脲)溶解。

(2)电泳试剂及凝胶的配制：用超纯水清洗电泳玻璃板和胶条，烘干后按照说明书进行安装，然后用1.5％的琼脂封胶。根据表2和表3分别配制电泳试剂、分离胶、夹层胶和浓缩胶，插入样品梳。待凝胶聚合后，在上、下电泳槽内分别加入阴极缓冲液与阳极缓冲液，小心拔出梳子，准备上样。

表2 电泳试剂配方

表3 凝胶配方

(3)Tricine-SDS-PAGE：将18μL样品与6μL的4×loading buffer混匀后，与Marker一同放入沸水浴中加热5min，取出冷却至室温，用微量进样器上样。上样后，插上电极，接通电源进行电泳。先将电压调至20V电泳20min，以利于胶孔疏松。然后以60V电压进行电泳，样品进入分离胶后，将电压调至80V。电泳完成后，取出凝胶，进行固定、染色和脱色处理。

如图2所示，乳酸乳球菌发酵浓缩液中的蛋白经电泳跑出的条带位置与乳酸链球菌素标准品一致，证明发酵浓缩液中的确存在乳酸链球菌素。

二、抗菌素效价的测定

(1)金黄色葡萄球菌的培养：根据表4的配方配制培养基，在121℃灭菌30min后，将甘油保藏的金黄色葡萄球菌菌液以10％(v/v)的比例接入5mL液体培养基中，在37℃恒温摇床中以200rpm转速振荡培养12h。待菌种活化后，将25mL固体培养基倒入平板中，用接种针取活化好的菌液划线接种于平板上，在37℃恒温培养箱中静置培养18h。长出菌种后，挑取单菌落接种于30mL种子液培养基中，在37℃，200rpm转速的摇床中振荡培养12h，然后以3％(v/v)的比例接种于100mL新鲜液体培养基中，在相同条件下振荡培养6h后，将菌液用0.02M PBS稀释至浓度为1×108cfu/mL左右的菌悬液。

表4 金黄色葡萄球菌培养基配方

(2)抑菌实验：取10mL培养基平铺于平板中，待其凝固之后取稀释后的1mL金黄色葡萄球菌菌悬液与15mL培养基混匀，倾倒于平板中，效价培养基中琼脂的含量为1％。将牛津杯放置于平板上，在牛津杯中加入100μL的标准品或样品。加入后先在无菌操作台中通风扩散30min，然后在4℃冰箱中扩散24h，最后将平板放入37℃恒温培养箱中培养24h，培养完毕后用游标卡尺测量并记录抑菌圈的大小。

标准品与样品的牛津杯放置方法如图3所示。选用的标准效价从高到低依次为80000IU/mL、40000IU/mL、20000IU/mL、10000IU/mL、5000IU/mL、2500IU/mL以及1250IU/mL，分别对应图中S1～S7，S4为中间浓度。图中每个浓度的标准品需准备三个平板，实验结束后分别求出六个中间浓度标准品与六个Si(i为1、2、3、5、6或7)抑菌圈大小的平均值，并计算标准偏差与相对标准偏差。然后进行平板间差异校正，计算公式如下：

X_C＝X_S-(X_R-P)

式中：X_C为标准品平均值的校正值，X_S为原始标准品平均值，X_R为六个中间浓度标准品的平均值，P为所有中间浓度标准品的平均值。

计算出X_C后，即可绘制乳酸链球菌素抑菌标准曲线。样品效价的测定与标准曲线的绘制类似，用样品(U1)替代其他标准品溶液与中间浓度标准品进行实验即可。

从图4可以得出抗菌素对金黄色葡萄球菌的效价为9143IU/mL，可达到Sigma公司乳酸链球菌素标准品(浓度为0.01g/mL)效价的91.43％，通过计算图中实验组和对照组的效价之差得出富集分离得到的乳酸链球菌素效价为3210IU/mL，占整个抗菌素效价的35.11％。

图5中可以看出经过双水相分配得到的抗菌素比浓缩后的发酵液效价增大了11倍，可见双水相体系不仅能较好的富集分离发酵液中的乳酸链球菌素，Triton X-114与乳酸链球菌素的结合也能显著提高抗菌素的效价。

如表5所示，受乳酸链球菌素抑菌谱的影响，获得的抗菌素只对革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌和酿脓链球菌有抑制效果，抑菌效价分别为13881IU/mL和7385IU/mL。而对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌无抑制作用。

如图6和图7所示对比了抗菌素对枯草芽孢杆菌和酿脓链球菌的抑菌圈生长状态。从图中可以看出抗菌素对枯草芽孢杆菌的抑菌明显，由于酿脓链球菌生长缓慢，菌体颜色与培养基相近，得到的抑菌圈不够明显。

表5 抗菌素对其他菌种的抑制作用

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种抗菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将乳酸乳球菌ATCC 11454菌种活化后，挑取单菌落进行培养，离心处理后去除菌种，获得乳酸乳球菌发酵液；

步骤二，将步骤一所得发酵液pH调至2以下，再利用旋转蒸发浓缩，再将pH调至初始值，然后离心处理后取上清，过滤处理后得到乳酸乳球菌发酵浓缩液；

步骤三，取步骤二所得发酵浓缩液与PBS缓冲液以重量比2:1混合，再加入Triton X-114和MgSO₄混合液构成双水相体系，离心处理使双水相达到相平衡后取上相，再用PBS缓冲液稀释后制得包含乳酸链球菌素和Triton X-114的抗菌素。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤一所述培养包括活化培养24-26h，平板划线培养18-20h，种子液培养20-22h和扩大培养16-18h；所述培养均在29-31℃恒温培养箱中。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤二所述过滤处理为用0.2-0.25μm的滤膜过滤至少一次除菌。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤三所述发酵浓缩液、所述Triton X-114和所述MgSO₄重量比为(15.5-15.7)：(0.95-1.05)：(0.144-0.156)；所述PBS缓冲液浓度为0.018-0.022M。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述双水相体系的相比为0.21-0.23。

6.根据权利要求1-5任一条所述制备方法，其特征在于，所述离心处理为在24-26℃，11000-13000rpm的条件下离心28-32min。

7.一种根据权利要求1-5任一项所述制备方法制备的抗菌素。

8.根据权利要求7所述抗菌素的应用，其特征在于，所述抗菌素对革兰氏阳性细菌有抑菌效果。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于所述革兰氏阳性细菌包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述抗菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效价为9143IU/mL，所述抗菌素中乳酸链球菌素效价为3210IU/mL。