CN104762352B

CN104762352B - 一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用

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Publication number: CN104762352B
Application number: CN201510174012.0A
Authority: CN
Inventors: 吴正均; 郭本恒; 刘振民; 韩瑨; 徐晓芬
Original assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2015-04-13
Publication date: 2018-07-20
Anticipated expiration: 2035-04-13
Also published as: CN104762352A

Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，震荡发酵培养获得发酵液，将所得发酵液离心取上清液；(2)将所得上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为2:1～4:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～10℃，静置的时间为12～36小时，将混合液离心收集沉淀物，除去溶剂即得。与传统细菌素相比，本发明制备的细菌素制剂性质更稳定，该细菌素制剂可以直接用于食品的生产，从而达到抑制腐败菌的增殖，延长食品货架期的目的，进而降低了食品防腐剂的应用成本。

Description

一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用。

背景技术

细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的物质，主要成分为多肽、蛋白质或蛋白质复合物，最早由Jacob于1953年提出。近年来，广谱抗生素的普及甚至滥用所带来的负面效应日益突出，新型抗生素替代品的研究迫在眉睫。作为蛋白质类物质的细菌素，由于可被蛋白酶降解，其安全性很高，故受到越来越多的关注。尽管目前开发获得的细菌素(Nisin)已具备了极高的防腐与抑菌的应用价值，但受Nisin本身的特性(低pH条件下性质稳定，pH>7.0抑菌活性逐渐丧失)的影响，其应用的范围受到了极大的局限性，其次，制备细菌素的成本非常高、细菌素的来源相对有限，上述问题很大程度上限制了细菌素的开发和利用。

中国专利申请(CN 103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种，Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并将其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性，但尚未得到该菌株产出的抑菌性细菌素。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有细菌素制剂稳定性差，制备成本高，来源不足的现状，提供了一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用。

本发明人发现类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株的发酵液上清，经乙醇沉淀处理后可获得具有强烈抑菌活性的细菌素制剂，从而完成了本发明。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，震荡发酵培养获得发酵液，将所得发酵液离心取上清液；

(2)将步骤(1)上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为2:1～4:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～10℃，静置的时间为12～36小时，将混合液离心收集沉淀物，除去溶剂即得。

其中步骤(1)为将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，震荡发酵培养获得发酵液，将所得发酵液离心取上清液。其中所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)为本领域常规的类芽孢杆菌，较佳地为发酵产生细菌素的类芽孢杆菌，更佳地为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC No.8333。所述类芽孢杆菌为现有技术，其制备方法为本领域常规制备方法，或者通过从保藏中心购买获得。其中所述养类芽孢杆菌的培养基为本领域常规的培养基，所述培养基的配方较佳地为：氮源1～3％、碳源1～10％、L-胱氨酸0.01～0.03％、硫酸钠0.01～0.03％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1～0.3％、乙酸钠1～3％、氯化钠0.05～0.15％、碳酸氢钠0.1～0.3％，余量为水，所述百分比为质量百分比。其中所述氮源为本领域常规氮源，只要能够为类芽孢杆菌的发酵提供氮元素即可，所述氮源较佳地为酵母膏，蛋白胨和/或酪朊水解物中的一种或多种。其中所述碳源为本领域常规的碳源，只要能够为类芽孢杆菌的发酵提供碳元素即可，所述碳源较佳地为蔗糖和/或糖蜜。其中所述类芽孢杆菌的接种量较佳地为1～5％，更佳地为1.5～4％，最优地为2％，所述百分比为体积百分比，所述类芽孢杆菌的发酵温度较佳地为25～37℃，更佳地为32～35℃，所述发酵的时间较佳地为18～48小时，更佳地为24～36小时，优选地为30小时，所述震荡培养的速度较佳地为100～300rpm，更佳地为150～200rpm，优选地为180rpm。

本发明所述的发酵方法将所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于培养基之前，较佳地还包括该类芽孢杆菌CGMCC No.8333活化获得类芽孢杆菌种子的步骤。所述步骤较佳地包括以下步骤：将本发明所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种在TYC固体培养基中，25～30℃培养18～28小时即得类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子；将所得类芽孢杆菌CGMCCNo.8333种子的菌落均匀分散于TYC液体培养基内，再按2％～5％体积百分比的接种量接种于TYC液体培养基中震荡培养，摇床转速为100～200rpm，培养18-28小时，将所得培养物离心弃去上清，所得菌体用无菌蒸馏水洗涤后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，即得发酵用的类芽孢杆菌的种子。

其中步骤(2)为将步骤(1)上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为2:1～4:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～10℃，静置的时间为12～36小时，将混合液离心收集沉淀物，除去溶剂，即得。

其中所述离心的速度较佳地为8,000～15,000g，更佳地为10,000～12,000g，离心的时间较佳地为5～15分钟，更佳地为8～10分钟，离心的温度较佳地为4～8℃，更佳地为5～7℃。其中所述乙醇与上清液混合的体积比为较佳地为2:1～4:1，更佳地为3:1，所述静置的温度较佳地为2～10℃，更佳地为5～8℃，所述静置的时间较佳地为12～36小时，更佳地为18～30小时，最佳地为24小时。其中所述乙醇为本领域常规的乙醇，更佳地为无水乙醇。当所述离心的条件或者乙醇沉淀条件的技术参数值在本发明请求保护范围之外时，会使所得类芽孢杆菌细菌素制剂的抑菌活性显著降低。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种如本发明所述制备方法所得类芽孢杆菌细菌素制剂。

本发明所述类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法中各步骤技术特征的优选范围与上文所述制备方法中相应的技术内容完全一致，具体请参见上文所述技术内容，此处不再赘述。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：如本发明所述的类芽孢杆菌细菌素制剂在制备食品防腐剂中的应用。

本发明所述类芽孢杆菌细菌素制剂可以广泛应用于制备各种食品防腐剂，功能性食品或者功能性饲料中。所述应用较佳地为在制备食品防腐剂中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、解决了当前细菌素来源狭隘的现状，开创性地将类芽孢杆菌应用于细菌素制剂的制备方法；

2、与传统细菌素Nisin相比，采用本发明制备的细菌素制剂性质更稳定，尤其在中性条件下抑菌活性显著高于Nisin，因此，具有比Nisin更优的应用价值；

3、采用本发明制备的类芽孢杆菌细菌素制剂可以直接用于食品的生产，从而达到抑制腐败菌的增殖，延长食品货架期的目的，进而降低了食品防腐剂的应用成本。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为15～25℃。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。

实施例1类芽孢杆菌细菌素制剂的制备与抑菌活性的检测

1、材料与方法

种子(发酵菌种)的制备：将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)(所述类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.8333该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOIDCo，英国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm震荡培养24h取出，以2％(体积百分比)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co，英国)，30℃、180rpm震荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。

指示菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC 1.879、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CGMCC 1.1848、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)CGMCC1.9136，以上指示菌株都购买自CGMCC。

指示菌液的制备：将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于LB固体培养基(购买自OXOID Co，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL LB液体培养基(购买自OXOID Co，英国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm震荡培养24h取出，以2％(体积百分比)接种量接种于LB液体培养基(购买自OXOID Co，英国)，30℃、180rpm震荡培养20h后，即得相应的指示菌液。

指示平板的制备：将上述方法制备的指示菌液进行稀释，使其细菌浓度约为10⁷cfu/mL，以体积比1：150的比例吸取稀释的指示菌液注入45℃无菌LB固体培养基中，充分混匀后迅速倒平板，待平板凝固且表面水分蒸发完全后即可。

抑菌活性的检测方法：以点种法在指示平板上滴加20μL待测样品，置于30℃培养20h后测量并记录抑菌圈直径。

发酵培养基的制备：将氮源、碳源、L-胱氨酸、硫酸钠、Na₂HPO₄·12H₂O、乙酸钠、氯化钠、碳酸氢钠按所需比例完全溶解于水中，118℃灭菌15min，冷却至室温，即得无菌的发酵培养基。

2、类芽孢杆菌细菌素制剂的制备

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株以5％(体积百分比)接种量接种于无菌的发酵培养基中，25℃、100rpm震荡发酵培养18h获得发酵液，将上述发酵液8,000rpm离心15min取上清液，加入上清液体积2倍的无水乙醇，混合均匀后于10℃静置36小时，进行醇沉，之后于4℃，8,000rpm离心15min取上清液，经减压浓缩和冷冻干燥后即得类芽孢杆菌细菌素制剂A。其中，发酵培养基的配方为：蛋白胨0.5％、酪朊水解物0.5％、蔗糖10％，L-胱氨酸0.03％、硫酸钠0.01％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.3％、乙酸钠1％、氯化钠0.05％、碳酸氢钠0.3％，余量为水，所述百分比为质量百分比。

3、类芽孢杆菌细菌素制剂抑菌活性的检测

将类芽孢杆菌细菌素制剂A用无菌蒸馏水溶解，使其还原为醇沉前上清液的体积，测定其抑菌活性。结果如下表所示：

表1类芽孢杆菌细菌素制剂的抑菌效果

由表1可以看出，类芽孢杆菌细菌素制剂A作用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)产生的抑菌圈直径分别为9mm、12mm和10mm，由此可见，本发明所得类芽孢杆菌制剂A对上述革兰氏阳性菌具有显著的抑菌效果。

实施例2类芽孢杆菌细菌素制剂的制备与抑菌活性的检测

1、材料与方法：同实施例1。

2、类芽孢杆菌细菌素制剂的制备

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株以1％(体积百分比)接种量接种于无菌的发酵培养基中，37℃、300rpm震荡发酵培养48h获得发酵液，将上述发酵液10,000rpm离心10min取上清液，加入上清液体积4倍的无水乙醇，混合均匀后于2℃静置12小时进行醇沉，之后于8℃，10,000rpm离心10min取上清液，经减压浓缩和冷冻干燥后即得类芽孢杆菌细菌素制剂B。其中，发酵培养基的配方为：酵母膏1％、酪朊水解物2％、蔗糖1％，L-胱氨酸0.01％、硫酸钠0.03％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1％、乙酸钠3％、氯化钠0.15％、碳酸氢钠0.1％，余量为水，所述百分比为质量百分比。

3、类芽孢杆菌细菌素制剂抑菌活性的检测

将类芽孢杆菌细菌素制剂B用无菌蒸馏水溶解，使其还原为醇沉前上清液的体积，测定其抑菌活性。结果如下表所示：

表2类芽孢杆菌细菌素制剂的抑菌效果

由表2可以看出，类芽孢杆菌细菌素制剂B作用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)产生的抑菌圈直径分别为8mm、10mm和9mm，由此可见，本发明所得类芽孢杆菌细菌素制剂B对上述革兰氏阳性菌具有显著的抑菌效果。

实施例3类芽孢杆菌细菌素制剂的制备与抑菌活性的检测

1、材料与方法：同实施例1。

2、类芽孢杆菌细菌素制剂的制备

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株以2％(体积百分比)接种量接种于无菌的发酵培养基中，30℃、180rpm震荡发酵培养30h获得发酵液，将上述发酵液15,000rpm离心5min取上清液，加入上清液体积3倍的无水乙醇，混合均匀后于8℃静置24小时进行醇沉，再次15,000rpm离心5min取上清液，经减压浓缩和冷冻干燥后即得类芽孢杆菌细菌素制剂C。其中，发酵培养基的配方为：酵母膏0.5％、蛋白胨1.5％、蔗糖5％，L-胱氨酸0.02％、硫酸钠0.02％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％，余量为水，所述百分比为质量百分比。

3、类芽孢杆菌细菌素制剂抑菌活性的检测

将所得类芽孢杆菌细菌素制剂C用无菌蒸馏水溶解，使其还原为醇沉前上清液的体积，测定其抑菌活性。结果如下表所示：

表3类芽孢杆菌细菌素制剂的抑菌效果

由表3可以看出，类芽孢杆菌细菌素制剂C作用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)产生的抑菌圈直径分别为12mm、14mm和12mm，由此可见，本发明所得类芽孢杆菌细菌素制剂C对上述革兰氏阳性菌具有显著的抑菌效果。

实施例4类芽孢杆菌细菌素制剂的制备与抑菌活性的检测

1、材料与方法：同实施例1。

2、类芽孢杆菌细菌素制剂的制备

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株以1.5％(体积百分比)接种量接种于无菌的发酵培养基中，32℃、150rpm震荡发酵培养24h获得发酵液，将上述发酵液12,000rpm离心5min取上清液，加入上清液体积3倍的无水乙醇，混合均匀后于3℃静置30小时进行醇沉，之后于5℃，12,000rpm离心8min取上清液，经减压浓缩和冷冻干燥后即得类芽孢杆菌细菌素制剂。其中，发酵培养基的配方为：酵母膏0.5％、蛋白胨1.5％、蔗糖5％，L-胱氨酸0.02％、硫酸钠0.02％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％，余量为水，所述百分比为质量百分比。

3、类芽孢杆菌细菌素制剂抑菌活性的检测

检测方法与实施例1相同，所得类芽孢杆菌细菌素制剂作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为11mm、13mm和10mm。

实施例5类芽孢杆菌细菌素制剂的制备与抑菌活性的检测

1、材料与方法：同实施例1。

2、类芽孢杆菌细菌素制剂的制备

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株以4％(体积百分比)接种量接种于无菌的发酵培养基中，35℃、200rpm震荡发酵培养36h获得发酵液，将上述发酵液15,000rpm离心5min取上清液，加入上清液体积3倍的无水乙醇，混合均匀后于6℃静置18小时进行醇沉，之后于7℃，15,000rpm离心5min取上清液，经减压浓缩和冷冻干燥后即得类芽孢杆菌细菌素制剂。其中，发酵培养基的配方为：酵母膏0.5％、蛋白胨1.5％、蔗糖5％，L-胱氨酸0.02％、硫酸钠0.02％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％，余量为水，所述百分比为质量百分比。

3、类芽孢杆菌细菌素制剂抑菌活性的检测

检测方法与实施例1相同，所得类芽孢杆菌细菌素制剂作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为10mm、12mm和10mm。

对比例1

将实施例3中的接种量，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度，无水乙醇加入量以及部分培养基组成逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的细菌素制剂。各组细菌素制剂还原为醇沉前上清液的体积后，其测定的抑菌效果下表所示。

表4不同方法制备所得类芽孢杆菌细菌素制剂的抑菌效果

从表4所示的结果中可以得出，将所述类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法中接种量，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度，无水乙醇加入量以及部分培养基组成调整到本发明之外的时候，所得细菌素制剂的抑菌效果显著降低。

对比例2

以实施例3所述方法制备的类芽孢杆菌细菌素制剂C为待测样品，同时选用目前市场上常规的细菌素产品尼萨普林(Nisaplin，购买自丹尼斯克公司)为对照。尼萨普林是传统的商业化抑菌产品，其核心有效成分为乳酸链球菌素Nisin，此外还有氯化钠等其他成份。将类芽孢杆菌细菌素制剂C和尼萨普林分别溶解于pH＝3、5、7、9的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为50mg/mL的待测样品组S-3、S-5、S-7、S-9和对照组N-3、N-5、N-7、N-9，各组样品的抑菌效果如下表所示。

表5与常规细菌素产品的抑菌效果比较

表5显示了常规的细菌素制品与本发明制备的类芽孢杆菌细菌素制剂在不同pH条件下的抑菌效果，数据表明，尼萨普林在中性或中性以上的pH条件下，其抑菌活性开始丧失，而本发明制备的类芽孢杆菌细菌素制剂却在相同条件下依然保持着稳定的抑菌能力，由此可见，本发明制备的类芽孢杆菌细菌素制剂具有更优秀的抑菌稳定性，该特性推翻了现有细菌素制品只能应用于偏酸环境下的食品加工领域的局限性，因此，本发明制备的类芽孢杆菌细菌素制剂可应用的食品加工范围将比现有细菌素制品更广。

效果实施例1

按传统工艺制作的香肠(制作方法引自下述文献：袁秋萍.乳酸链球菌素在肉制品中的应用[J].食品工业科技,1998(4):27-28.)，其中，对照组1的香肠中仅添加亚硝酸钠，添加量为0.15g/kg，对照组2的香肠中添加亚硝酸钠和常规细菌素产品尼萨普林，添加量分别为0.04g/kg和0.4g/kg，样品组的香肠中添加了亚硝酸盐和实施例3制备获得的细菌素制剂C，添加量分别为0.04g/kg和0.6g/kg，各香肠样品制作完成后测定菌落总数，结果如下表所示。

表6香肠制作工艺中类芽孢杆菌细菌素制剂的抑菌效果

由表6可知，在香肠的制作工艺中，添加本发明所制备的类芽孢杆菌细菌素制剂，其成品中的抑菌效果与现有细菌素产品相仿，而且香肠的色、香、味没有明显的变化，由此可见，以本发明所制备的类芽孢杆菌细菌素制剂完全可替代现有细菌素产品在各种防腐、抑菌等方面应用。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，震荡发酵培养获得发酵液，将所得发酵液离心取上清液；所述类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.8333，所述的培养基的配方为：氮源1～3%、碳源1～10%、 L-胱氨酸0.01～0.03%、硫酸钠0.01～0.03%、Na₂HPO₄•12H₂O 0.1～0.3%、乙酸钠 1～3%、氯化钠0.05～0.15%、碳酸氢钠0.1～0.3%，余量为水，所述百分比为质量百分比；所述碳源为蔗糖和/或糖蜜，所述氮源为酵母膏，蛋白胨和/或酪朊水解物中的一种或多种；所述类芽孢杆菌的接种量为1～5%，所述百分比为体积百分比，所述类芽孢杆菌的发酵温度为25～37℃，所述发酵的时间为18～48小时，所述震荡培养的速度为100～300 rpm；

（2）将步骤（1）所得上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为2:1～4:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～10℃，静置的时间为12～36 小时，将混合液离心收集上清，除去沉淀物即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述类芽孢杆菌的接种量为1.5～4%，所述百分比为体积百分比，所述类芽孢杆菌的发酵温度为32～35℃，所述发酵的时间为24～36小时，所述震荡培养的速度为150～200 rpm。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心的速度为8,000～15,000g，离心的时间为5～15分钟，离心的温度为4～8℃。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心的速度为10,000～12,000g，离心的时间为8～10分钟，离心的温度为5～7℃。

5.一种如权利要求1～4任一项所述制备方法所得类芽孢杆菌细菌素制剂。

6.如权利要求5所述的类芽孢杆菌细菌素制剂在制备食品防腐剂中的应用。