CN108728497A - 一种变形链球菌抑制剂及其制备方法 - Google Patents

一种变形链球菌抑制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种变形链球菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中加入硫酸铵，离心取沉淀，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到变形链球菌抑制剂。上述技术方案中的制备方法，拓宽了变形链球菌抑制剂的种类和来源，制得的抑制剂可以有效抑制变形链球菌、金黄色葡萄球菌等，具有较好的应用前景。

Description

一种变形链球菌抑制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种变形链球菌抑制剂及其制备方法。
背景技术
龋齿，俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。引发龋齿的因素众多，如细菌、口腔环境(食物、唾液)、宿主等，其中，细菌是龋齿发生必要条件，一般认为致龋菌有两种类型，一种是产酸菌属，其中主要为变形链球菌、放线菌属和乳杆菌，可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿；另一种是革兰阳性球菌，可破坏有机质，经过长期作用可使牙齿形成龋洞。上述致龋菌中，变形链球菌被国内外学者公认为是引发龋齿的最主要和最重要的病原菌。因此，通过抑制或杀灭变形链球菌的方法来控制口腔中主要致龋菌的数量，进而预防和治疗龋齿是行之有效的手段。
中国专利申请CN103740618A公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种(后被定名为牛类芽孢杆菌，Paenibacillus bovis)，并将其中的模式菌株BD3526于 2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。此外，中国专利申请 CN104757544A和CN104762350A公开了该菌株具有代谢天然培养基产抑菌性物质的能力及其应用，但并未揭示代谢产物中发挥抑菌作用的明确组分。
目前控制龋齿的药物较少，氨硝酸银是为数不多的药物的其中之一，氨硝酸银是一种防腐杀菌性药物，具有防腐、收敛、杀菌及腐蚀作用，但该药物会使牙齿染色，故不适用于前牙治疗。现在直接靶向性地直接抑制的药物，尤其是临床药物不多，因此，找到变形链球菌的新型抑制剂是当务之急。其次，从培养基角度来看，大部分的报道采用化学合成培养基作为发酵基料生物代谢产生或直接合成，这将直接影响抑菌药物的制备成本和使用安全性。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供了一种变形链球菌抑制剂的制备方法，以制得一种新型变形链球菌抑制剂。
第一方面，提供一种变形链球菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a) 将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中加入硫酸铵，离心取沉淀，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到变形链球菌抑制剂。
进一步地，上述步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.6x106～8x106cfu/mL。
进一步地，上述步骤(a)中，所述麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。
进一步地，上述步骤(a)中，发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；发酵的温度为25℃～35℃；发酵的时间为48～96h。
进一步地，上述步骤(b)中，离心的速度为6,000～10,000g，离心的时间为10～20分钟。
进一步地，上述步骤(b)中，高温水浴的温度为60～80℃，保温时间为 10～30分钟。
进一步地，上述步骤(b)中，硫酸铵加入量为使硫酸铵饱和度达到 30％～70％。
进一步地，上述步骤(c)中，凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D 2.6cm ×30cm；分离条件包括：以体积比为3的甲醇-水溶液进行等度洗脱，洗脱速度为2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。
进一步地，上述步骤(d)中，HPLC采用的色谱柱为C18柱，规格为Sunfire C18柱，20mm×250mm，粒径5μm；分离条件包括：以含0.1％TFA的水为 A相，含0.1％TFA的乙腈为B相进行梯度洗脱，洗脱速度为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。收集保留时间在54.21min的组分，得到变形链球菌抑制剂。
第二方面，提供一种变形链球菌抑制剂，由第一方面的任一种变形链球菌抑制剂的制备方法制得，该变形链球菌抑制剂的分子量为411Da。
上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、硫酸铵沉淀，凝胶柱分离、HPLC纯化、冷冻干燥，制备得到一种新型变形链球菌抑制剂，拓宽了变形链球菌抑制剂的种类。该抑制剂除了可以有效抑制变形链球菌，还对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌和枯草芽孢杆菌都具有显著的抑菌作用，并且具有良好的热稳定性，在不同的pH值环境下抑菌效果稳定，在肠道或口腔中不易失活，具有较好的应用前景。
此外，上述技术方案中的制备方法还披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成变形链球菌抑制剂的新用途，拓宽了变形链球菌抑制剂的来源。同时，纯天然、廉价的麸皮培养基，令制得的变形链球菌抑制剂具有更高的使用安全性、更低的制备成本。
生物材料保藏信息：
本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)BD3526菌株，已于2013年 10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。
附图说明
图1为本发明实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上的分离效果。
图2为本发明实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上分离后点种法检测抑菌活性的效果。
图3为本发明实施例1中粗品2在HPLC上的纯化效果。
图4为本发明实施例1中变形链球菌抑制剂的高分辨质谱图。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在面临“如何提供一种新的变形链球菌抗菌剂”这一技术问题时，发明人经过创造性劳动，在一个具体实施方式中，提供了一种变形链球菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis) CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤 (a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中缓慢加入硫酸铵，离心取沉淀，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1； (c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集、检测、合并抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC 纯化，收集、检测、合并抑菌活性组分，冷冻干燥，得到变形链球菌抑制剂。
上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、硫酸铵沉淀，凝胶柱分离、HPLC纯化、冷冻干燥，制备得到一种新型变形链球菌抑制剂，拓宽了变形链球菌抑制剂的种类。通过效果实施例1-4可见，该抑制剂除了可以有效抑制变形链球菌，还对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌和枯草芽孢杆菌都具有显著的抑菌作用，并且具有良好的热稳定性，在不同的pH值环境下抑菌效果稳定，在肠道或口腔中不易失活，具有较好的应用前景。
上述技术方案中的制备方法还披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成变形链球菌抑制剂的新用途，拓宽了变形链球菌抑制剂的来源。同时，纯天然、廉价的麸皮培养基，令制得的变形链球菌抑制剂具有更高的使用安全性、更低的制备成本。此外，制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用牛类芽孢杆菌这一种单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。
进一步地，步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为 1.6x106～8x106cfu/mL；较佳地为3.2x106～6.4x106cfu/mL，更佳地为 4.8x106cfu/mL。
进一步地，上述步骤(a)中，麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入麸皮，混匀充分后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。
进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵方式为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；较佳地为150～250rpm；更佳地为200rpm。
进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵温度为25℃～35℃；较佳地为 28℃～32℃；更佳地为30℃。
进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵时间为48～96h；较佳地为60～84 小时；更佳地为72小时。
结合对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，牛类芽孢杆菌 CGMCCNo.8333发酵麸皮培养基，再经过灭活蛋白酶、离心后得到的麸皮发酵液上清对变形链球菌的抑菌效果明显下降了。而在优选范围之内，接种量、麸皮浓度、振荡速度、发酵温度和时间相互配合，使得牛类芽孢杆菌 CGMCC No.8333发酵产生的抑菌活力更佳。
进一步地，上述步骤(b)中，优选的离心的速度为6,000～10,000g，较佳地为7,000～9,000g，更佳地为8,000g；优选的离心时间为10～20分钟，较佳地为13～17分钟，更佳地为15分钟。
进一步地，上述步骤(b)中，高温水浴的温度较佳地为60～80℃，更佳地为65～75℃，最优地为70℃；保温时间较佳地为10～30分钟，更佳地为 15～25分钟，最优地为20分钟。
进一步地，上述步骤(b)中，硫酸铵加入量较佳为使硫酸铵饱和度达到30％～70％，更佳地为使硫酸铵饱和度达到40％～70％，最佳地为使硫酸铵饱和度达到60％。
进一步地，上述步骤(b)中，上述的冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
进一步地，上述步骤(c)中，凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D 2.6cm ×30cm，流动相较佳地为体积比为3：1的甲醇-水溶液；洗脱速度较佳地为 2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。
进一步地，上述步骤(d)中，HPLC采用的色谱柱为C18柱，规格为 Sunfire C18柱(20mm×250mm，粒径5μm)，分离条件为：以含0.1％TFA 的水(A相)和含0.1％TFA的乙腈(B相)进行梯度洗脱，洗脱速度较佳地为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。
上述的步骤(a)(b)(c)(d)前后或步骤之间，在不影响本发明的核心思想的基础上本领域技术人员还可以增加其他合理的步骤，亦包括在本发明的保护范围之内。
在另一个具体实施方式中，还提供一种变形链球菌抑制剂，由上述任一种变形链球菌抑制剂的制备方法制得，该变形链球菌抑制剂的分子量为411 Da。该新型变形链球菌抑制剂除了可以有效抑制变形链球菌，还对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌和枯草芽孢杆菌都具有显著的抑菌作用，并且具有良好的热稳定性，在不同的pH值环境下抑菌效果稳定，在肠道或口腔中不易失活，具有较好的应用前景。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。
实施例1
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333(该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC 液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1.6x108cfu/mL。
(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为4％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。
(c)凝胶柱分离：将待分离样品(下述的粗品1)溶解于流动相(体积比为3：1的甲醇-水溶液)中配制成浓度为50mg/mL的溶液，取2mL上样于LH20凝胶柱(规格为D 2.6cm×30cm)，以2mL/min的流速进行等度洗脱，以2.5min/管的速度收集洗脱液，平行蒸发仪蒸干，向各管中加入200 μL无菌水，以点种法测定各管的抑菌活性，合并抑菌活性组分，冷冻干燥。
(d)HPLC纯化：将待纯化样品(下述的粗品2)溶解于31％(V/V) 的乙腈溶液中配制成浓度为20mg/mL的溶液，取200μL上样于配备有C18柱(Sunfire C18柱：20mm×250mm，5μm)的半制备型HPLC，采用含0.1％TFA的水(A相)和含0.1％TFA的乙腈(B相)，以4mL/min的流速进行梯度洗脱(梯度洗脱步骤如下表1所示)，以1.5min/管的速度收集洗脱液，平行蒸发仪蒸干，向各管中加入200μL无菌水，以点种法测定各管的抑菌活性，合并抑菌活性组分，冷冻干燥。
表1梯度洗脱步骤
(e)样品抑菌活性的检测方法：点种法。待测样品溶解于无菌水中，吸取10μL滴于铺有变形链球菌(CGMCC 1.2499，购自CGMCC)作为指示菌的营养琼脂平板上，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈的有无和大小。抑菌圈直径越大，抑菌效果越佳。
2、变形链球菌抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3％(v/v)无菌接种于 4％(w/w)麸皮培养基中，30℃、200rpm培养72小时得发酵液。
将发酵液8,000g离心15min取上清，置于70℃水浴保温20分钟灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到60％， 8,000g离心15min取沉淀，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。
将粗品1先进行LH20凝胶柱分离，分离效果如图1所示，点种检测抑菌活性的效果如图2所示，图2中培养皿的19～24标注的6块区域依次分别对应了LH20凝胶柱分离洗脱下来的管号19～24，不同管中的洗脱液被取出少量用于点种法滴在平板上进行抑菌活性检测。合并20～23管内的活性组分得到粗品2，再经HPLC纯化(纯化效果如图3所示)，发现保留时间在54.21 min的组分具有抑菌活性，收集该组分，即得变形链球菌抑制剂。
3、变形链球菌抑制剂分子量的确定
将上述HPLC纯化后的抑菌活性组分进行高分辨质谱分析，结果如图4 所示，该活性组分的质荷比为412.3，换算后，该组分的分子量为411Da。
实施例2
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为6％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。
(c)凝胶柱分离、HPLC纯化及样品抑菌活性的检测方法：同实施例1。
2、变形链球菌抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1％(v/v)无菌接种于 6％(w/w)麸皮培养基中，35℃、100rpm培养96小时得发酵液。
将发酵液10,000g离心10min取上清，置于80℃水浴保温10分钟灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70％， 10,000g离心10min取沉淀，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。
进一步的LH20凝胶柱分离、HPLC纯化步骤与实施例1相同，制得变形链球菌抑制剂。
3、变形链球菌抑制剂分子量的确定方法：同实施例1。
实施例3
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为2％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。
(c)凝胶柱分离、HPLC纯化及样品抑菌活性的检测方法：同实施例1。
2、变形链球菌抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量5％(v/v)无菌接种于 2％(w/w)麸皮培养基中，25℃、300rpm培养48小时得发酵液。
将发酵液6,000g离心20min取上清，置于60℃水浴保温30分钟灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到40％， 6,000g离心20min取沉淀，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。
进一步的LH20凝胶柱分离、HPLC纯化步骤与实施例1相同，制得变形链球菌抑制剂。
3、变形链球菌抑制剂分子量的确定方法：同实施例1。
实施例4
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为5％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。
(c)凝胶柱分离、HPLC纯化及样品抑菌活性的检测方法：同实施例1。
2、变形链球菌抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量2％(v/v)无菌接种于 5％(w/w)麸皮培养基中，32℃、150rpm培养84小时得发酵液。
将发酵液9,000g离心13min取上清，置于65℃水浴保温25分钟灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到50％， 9,000g离心13min取沉淀，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。
进一步的LH20凝胶柱分离、HPLC纯化步骤与实施例1相同，制得变形链球菌抑制剂。
3、变形链球菌抑制剂分子量的确定方法：同实施例1。
实施例5
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为3％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在110℃下灭菌12min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。
(c)凝胶柱分离、HPLC纯化及样品抑菌活性的检测方法：同实施例1。
2、变形链球菌抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量4％(v/v)无菌接种于3％(w/w)麸皮培养基中，28℃、250rpm培养60小时得发酵液。
将发酵液7,000g离心17min取上清，置于75℃水浴保温15分钟灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到30％， 7,000g离心17min取沉淀，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。
进一步的LH20凝胶柱分离、HPLC纯化步骤与实施例1相同，制得变形链球菌抑制剂。
3、变形链球菌抑制剂分子量的确定方法：同实施例1。
效果实施例1
将实施1中制备的变形链球菌抑制剂溶解在pH 7的磷酸盐缓冲溶液 (20mM)中配成64μg/mL溶液，并以倍半稀释法制备得到32、16、8、 4、2、1μg/mL溶液，分别取10μL滴在铺有金黄色葡萄球菌(CGMCC 1.879)、藤黄微球菌(CGMCC 1.1848)、单增李斯特杆菌(CGMCC1.9136)、枯草芽孢杆菌(CGMCC 1.4255)、变形链球菌(CGMCC 1.2499)、蜡状芽孢杆菌(CGMCC 1.1626)、沙门氏菌(CGMCC 1.1859)、大肠杆菌(CGMCC 1.8732)、痢疾杆菌(CGMCC1.1869)、荧光假单胞菌(CGMCC 1.6279) 作为指示菌(均购自CGMCC)的营养琼脂平板上，置于37℃培养24h，观察有无抑菌圈出现，出现抑菌作用的最低浓度称为最小抑菌浓度(MIC)。结果如表2所示：
表2变形链球菌抑制剂对不同致病菌的抑菌作用
由表2可知，本发明所制备的变形链球菌抑制剂不仅对变形链球菌有明显的抑制效果，而且对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特杆菌、枯草芽孢杆菌也有显著的抑菌作用。
效果实施例2
将实施1中制备的变形链球菌抑制剂溶解在pH 7的磷酸盐缓冲溶液 (20mM)中配成100μg/mL溶液，分别取100μL溶液置于50℃、60℃、 70℃、80℃、90℃、100℃、121℃条件下热处理2h，以未经热处理的样品作为对照，取100μL加入铺有变形链球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表3所示。
表3变形链球菌抑制剂经不同温度处理后的抑菌活性
由表3可知，经不同温度处理后，变形链球菌抑制剂的抑菌圈直径与对照样品无显著差异，表明变形链球菌抑制剂具有良好的热稳定性。
效果实施例3
将实施1中制备的变形链球菌抑制剂分别溶解在pH 2，pH 3，pH 4， pH 5，pH 6，pH7，pH 8，pH 9，pH 10的磷酸盐缓冲溶液(20mM)中配成100μg/mL溶液，取100μL加入铺有变形链球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表4所示。
表4pH对变形链球菌抑制剂抑菌活性的影响
由表4可知，不同pH条件下变形链球菌抑制剂，除了在强碱pH10 和强酸pH2条件抑菌活性略有下降外，在pH3～9范围内均可保持稳定的抑菌效果。
效果实施例4
分别称取4mg胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶(均购自Sigma)，溶解在20mM，pH 7的磷酸盐缓冲溶液中，配制成终浓度为4mg/ml的酶液。将实施1中制备的变形链球菌抑制剂溶解在无菌水中配成100μg/mL溶液，再分别调节至上述各个酶的最适pH(胰蛋白酶：7.8～8.5，胃蛋白酶：2.0～3.0，蛋白酶K：7.2～7.5，链霉蛋白酶：7.8～8.0)，以体积比1：3将酶液与样品溶液混合，使酶终浓度为1mg/ml。最后，将混合液在37℃水浴中保温2h，调节pH至中性，以加入同等体积的磷酸盐缓冲溶液样品作为对照，上述样品各取100μL加入铺有变形链球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表5所示：
表5变形链球菌抑制剂经不同蛋白酶处理后的抑菌活性
由表5可知，变形链球菌抑制剂经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶处理后，活性基本没有明显变化，因此变形链球菌抑制剂在动物肠道或口腔中不易失活，具有应用前景。
对比例1
将实施例1中的接种量，麸皮含量，培养温度，发酵时间以及发酵振荡的速度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的麸皮发酵液，将各组所得发酵液上清pH调节至7.0后，取100μL加入铺有变形链球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表6所示。
表6不同方法制备所得麸皮发酵液上清对变形链球菌的抑制效果
上述方法同样被用于测定实施例1～5所述方法制备的麸皮发酵液上清，其抑菌效果如表7所示。
表7实施例1～5制备的麸皮发酵液上清对变形链球菌的抑制效果
参照表6和表7所示的结果中可以得出，将所述变形链球菌抑制剂的制备方法中接种量，麸皮含量，培养温度，发酵时间以及发酵振荡的速度调整到优选范围之外的时候，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333依然可以发酵麸皮产生变形链球菌抑制剂，但是其产率明显下降。
对比例2
参考实施例1所述方法，比较由牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus) LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的麸皮发酵液上清对变形链球菌的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养 24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h 取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物 9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。
嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co. 德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLM17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(b)麸皮培养基的制备：同实施例1。
2、麸皮发酵液上清的制备
将各菌株以3％(v/v)接种量无菌接种于4％(w/w)麸皮培养基中，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，牛类芽孢杆菌30℃、200rpm振荡培养)72h，获得相应的麸皮发酵液。
将上述发酵液按照实施例1中所述方法进行灭活蛋白酶，离心，制备得到麸皮发酵液上清。
3、抑菌活性的测定
将不同菌株所得发酵液上清pH调节至7.0后，取100μL加入铺有变形链球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表8示：
表8不同菌株制备的麸皮发酵液上清的抑菌效果
由表8可知，其他常规发酵菌株不具有发酵麸皮培养基产生抗变形链球菌物质的能力，而牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333可以发酵麸皮培养基，最后得到变形链球菌抑制剂，对变形链球菌的抑制活性非常显著。
以上对本发明所提供的变形链球菌抑制剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (12)

1.一种变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；
(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，向上清中加入硫酸铵，离心取沉淀，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；
(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；
(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到变形链球菌抑制剂。
2.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.6x106～8x106cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。
4.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；所述发酵的温度为25℃～35℃；所述发酵的时间为48～96h。
5.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述离心的速度为6,000～10,000g，离心的时间为10～20分钟。
6.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述高温水浴的温度为60～80℃，保温时间为10～30分钟。
7.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，硫酸铵沉淀时，硫酸铵加入量为使硫酸铵饱和度达到30％～70％。
8.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述的凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D 2.6cm×30cm；分离条件包括：以体积比为3：1的甲醇-水溶液进行等度洗脱，洗脱速度为2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。
9.根据权利要求1所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述的HPLC采用的色谱柱为C18柱，规格为Sunfire C18柱，20mm×250mm，粒径5μm；分离条件包括：以含0.1％TFA的水为A相，含0.1％TFA的乙腈为B相，进行梯度洗脱，洗脱速度为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。
10.根据权利要求9所述的变形链球菌抑制剂的制备方法，其特征在于，收集保留时间在54.21min的组分。
11.一种变形链球菌抑制剂，其特征在于，由权利要求1-10任一项所述的变形链球菌抑制剂的制备方法制得。
12.根据权利要求11所述的变形链球菌抑制剂，其特征在于，分子量为411Da。
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