CN110122575A - 一种由牛类芽孢杆菌制备发酵豆乳粉的方法及制备出的发酵豆乳粉与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由牛类芽孢杆菌制备发酵豆乳粉的方法，该方法包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于豆浆中进行发酵代谢，冷冻干燥即得发酵豆乳粉。还公开了该方法制备出的发酵豆乳粉与其在抗龋齿方面的应用。本发明制备的发酵豆乳粉可显著降低变形链球菌生物膜的形成量，披露了牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333发酵豆乳粉具有抗龋齿的新用途，具备良好的应用前景。与其它可制备豆乳粉的菌株或该菌株可生长繁殖的培养基相比，CGMCC No.8333所制备的发酵豆乳粉具有显著的抑制变形链球菌生物膜形成的活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发酵豆乳粉的制备方法。此外，本发明还涉及一种发酵豆乳粉及其应用。
背景技术
龋齿，俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。如不及时治疗，病变继续发展，形成龋洞，终至牙冠完全破坏消失，其发展的最终结果是牙齿丧失。龋齿特点是发病率高，分布广。该病是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
引发龋齿的因素众多，如细菌、口腔环境(食物、唾液)、宿主等，其中，细菌是龋齿发生必要条件，一般认为致龋菌有两种类型，一种是产酸菌属，其中主要为变形链球菌(Streptococcus mutans，简称S.mutans)、放线菌属和乳杆菌，可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿；另一种是革兰阳性球菌，可破坏有机质，经过长期作用可使牙齿形成龋洞。上述致龋菌中，变形链球菌被国内外学者公认为是引发龋齿的最主要和最重要的病原菌。然而上述这些病原菌并不是直接定植于牙齿表面，而是通过与变形链球菌所产生的生物膜(不溶性多糖)结合形成牙菌斑后，间接地粘附于牙齿表面，随着致龋菌不断在生物膜上的积累，龋齿的程度逐渐恶化。因此，减少其生物膜的产量也可达到防治龋齿的目的。
目前，有关龋齿治疗的研究中绝大部分报道集中于控制或降低口腔中变形链球菌的数量，然而，健康的口腔环境一般是处于有害菌与有益菌达到平衡的状态，有害菌过度的减少会带来口腔菌群失衡，进而引起人体的其他不良反应。此外，临床上使用的一些针对变形链球菌的杀菌药物，如氨硝酸银等化合物，副作用强，长期使用会令牙齿染色，故不适用于前牙治疗。而通过减少变形链球菌生物膜产量同样可降低龋齿患病风险，并且不破坏口腔菌群的固有平衡或产生副作用，但这方面的报道相对较少，尤其是与微生物发酵制品有关的研究极其有限，具有抑制变形链球菌生物膜形成的发酵制品相当匮乏。
因此，提供具有抑制变形链球菌生物膜形成的发酵制品是当务之急。这是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供了一种发酵豆乳粉的制备方法，采用该方法可以制得具有抑制变形链球菌生物膜形成的发酵豆乳粉。
具体的，一方面，提供了一种发酵豆乳粉的制备方法，包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，冷冻干燥后即得发酵豆乳粉。
所述牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333菌株已于2013 年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCCNo.8333菌株的保藏信息在专利 CN103740618B中已经公开。
进一步地，所述发酵菌剂的接种量为2x107～1x108cfu/mL。
进一步地，所述发酵菌剂还包含植物乳杆菌ATCC14917，植物乳杆菌 ATCC14917与牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种比例为1～9：1～9。
植物乳杆菌ATCC14917购买自ATCC，植物乳杆菌ATCC14917与牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333作为复合菌剂发酵豆浆时，制备得到的发酵豆乳粉具有显著的抑制变形链球菌生物膜形成的活性。
进一步地，所述豆浆中固形物的质量百分比含量为1％～9％。
进一步地，所述发酵的温度为15℃～45℃，时间为2～48h。
进一步地，所述发酵为静置培养。
第二方面，还提供了一种发酵豆乳粉，由上述任一种制备方法制得。
进一步地，上述发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度 IC50≤69mg/mL。
第三方面，还提供一种发酵豆乳粉在制备抗龋齿食品方面的应用。
与现有技术相比，上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以豆浆作为培养基进行发酵，制备得到具有变形链球菌生物膜抑制活性的发酵豆乳粉，披露了牛类芽孢杆菌 (Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333发酵豆乳粉具有抗龋齿的新用途。与其它可制备发酵豆乳粉的菌株或该菌株可生长繁殖的培养基相比，CGMCC No.8333所制备的发酵豆乳粉具有显著的抑制变形链球菌生物膜形成的活性。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在一个具体的实施方式中，提供了一种发酵豆乳粉的制备方法，包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，冷冻干燥后即得发酵豆乳粉。
上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以豆浆作为培养基进行发酵，制备得到具有变形链球菌生物膜抑制活性发酵豆乳粉，牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333利用豆浆合成的代谢物质具有变形链球菌抑制活性，披露了牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333发酵豆乳粉具有抗龋齿的新用途。与其它可制备发酵豆乳粉的菌株或该菌株可生长繁殖的培养基相比， CGMCC No.8333所制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制效果更显著，并且稳定性佳。
进一步地，上述步骤中，所述发酵菌剂的接种量为2x107～1x108cfu/mL；较佳地为4x107～8x107cfu/mL，更佳地为6x107cfu/mL。
进一步地，上述发酵菌剂还包含植物乳杆菌ATCC14917，植物乳杆菌 ATCC14917与牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种比例为1～9：1～9。当植物乳杆菌ATCC14917与牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333作为复合菌剂发酵豆浆时，制备得到的发酵豆乳粉具有显著的抑制变形链球菌生物膜形成的活性。
进一步地，上述步骤中，优选的豆浆为大豆、赤豆、绿豆、蚕豆、大白芸豆和小白芸豆豆浆中的至少一种，更佳的为大豆豆浆。
进一步地，上述步骤中，优选的豆浆中固形物的质量百分比含量为 1％～9％；较佳地为3％～7％；更佳地为5％。豆浆中固形物含量与最终产品的生物膜抑制效果有直接关系，当固形物含量过高时，会引起菌体生境渗透压增加，影响菌体的生长而降低抑膜物质的合成量，另外生产成本也会上升，而固形物含量过低则会因营养成分不足导致活菌增殖效果差，同样会影响抑膜物质的产生。
进一步地，上述步骤中，优选的发酵温度为15℃～45℃；较佳地为25℃～ 40℃；更佳地为37℃。
进一步地，上述步骤中，优选的发酵时间为2～48h；较佳地为12～36h；更佳地为24h。
进一步地，上述步骤中，优选的发酵方式为静置培养。牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333为兼性厌氧菌，在静置培养条件下，能快速地生产繁殖。
进一步地，上述步骤中，优选的冷冻干燥为真空冷冻干燥，优选的真空冷冻干燥条件为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
采用冷冻干燥，将发酵豆浆制备成发酵豆乳粉，从而更便于消费者使用和运输，同时，冷冻干燥得到的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜抑制活性不会产生较大的变化。
结合实施例和比较例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，由牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制效果明显下降。而在优选范围之内，接种量、豆浆浓度、培养温度和发酵时间相互影响，使得由牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis) CGMCC No.8333制备的发酵豆乳粉具有更佳的变形链球菌生物膜形成的抑制效果。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种发酵豆乳粉，该发酵豆乳粉由上述任一种发酵豆乳粉的制备方法制得。
由于发酵豆乳粉的制备方法具备上述的有益效果，由该制备方法制得的发酵豆乳粉也具有相应的有益效果，此处不再赘述。
进一步的，上述发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度 IC50≤69mg/mL。结合实施例亦可知，上述发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制效果显著高于其他可制备发酵豆乳粉的菌株。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所有原料均为市售，并均符合相关的国家标准。
实施例1
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌种子(发酵菌种)的制备：将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、 180rpm振荡培养24h后，培养物15000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，即得发酵用的种子，种子液的菌浓度为2x109cfu/mL。
变形链球菌菌悬液的制备：将变形链球菌CGMCC No.1.2499(购自 CGMCC，中国)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于 BHI固体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL BHI液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于BHI液体培养基，37℃厌氧培养24h后，培养物 15000rpm离心10min，弃上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，以BHI液体培养基重悬至106cfu/mL即可。
(b)豆浆的制备：将大豆干豆称重后，加入五倍质量的水置于37℃浸泡8h，弃去水，在豆浆机中加入一定比例的湿豆与水，制得所需固形物含量的豆浆，经121℃灭菌20min，得到指定固形物含量的无菌大豆豆浆。
(c)发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率与IC50的测定：
发酵豆乳粉的预处理：将发酵豆乳粉溶解于无菌水中，pH调节至6.80，即得待测样品。
抑制活性的测定：将无菌的磁力搅拌子A(5×10mm)浸没于0.22μm滤膜无菌过滤后的健康人群唾液中37℃孵育4h，用无菌的磁力搅拌子B (10×50mm)吸起磁力搅拌子A，以10mM、pH7.0的PBS淋洗，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中。向培养孔中加入1.6mLBHI液体培养基、200μL变形链球菌菌悬液(106cfu/mL)和400μL待测样品溶液或空白对照溶液(未发酵的大豆豆浆)，再次37℃厌氧孵育24h(购买自Greiner 公司，德国)。用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干。向培养孔中加入1.6mL、 0.1％(w/v)的结晶紫溶液染色15min，用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS淋洗去除多余的染色液，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干。向培养孔中加入300μL无水乙醇脱色15min，取200μL转移至96孔板(购买自Greiner公司，德国)内，用酶标仪测定OD600nm，即为变形链球菌生物膜形成量所对应的量化数据。以上述方法测定空白对照与待测样品的OD600nm，并计算生物膜抑制剂的抑制率。生物膜抑制率(I)：
I＝(OD600nm(空白对照)-OD600nm(待测样品))/OD600nm(空白对照) ×100％
对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定：以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释，获得不同浓度的待测样品组，利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对变形链球菌生物膜形成的抑制率，根据浓度与生物膜形成的抑制率构成的线性关系计算得出样品对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度(IC50)。
2、发酵豆乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量3％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于固形物含量5％(w/w，大豆占水的质量百分比，下同)的大豆豆浆中，37℃静置培养24h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10Pa 的条件下真空冷冻干燥后，得发酵豆乳粉A。
3、发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
将发酵豆乳粉A以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝65mg/mL。
实施例2
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌种子(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)豆浆的制备：将赤豆干豆称重后，加入五倍质量的水置于37℃浸泡8h，弃去水，在豆浆机中加入一定比例的湿豆与水，制得所需固形物含量的豆浆，经121℃灭菌20min，得到指定固形物含量的无菌赤豆豆浆。
(c)发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率与IC50的测定：同实施例1。
2、发酵豆乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量1％(v/v) 无菌接种于固形物含量9％(w/w)的赤豆豆浆中，15℃静置培养48h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度 30Pa的条件下真空冷冻干燥后，得发酵豆乳粉B。
3、发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
将发酵豆乳粉B以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝69mg/mL。
实施例3
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌种子(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)豆浆的制备：将绿豆干豆称重后，加入五倍质量的水置于37℃浸泡8h，弃去水，在豆浆机中加入一定比例的湿豆与水，制得所需固形物含量的豆浆，经121℃灭菌20min，得到指定固形物含量的无菌绿豆豆浆。
(c)发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率与IC50的测定：同实施例1。
2、发酵豆乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量5％(v/v) 无菌接种于固形物含量1％(w/w)的绿豆豆浆中，45℃静置培养2h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度20Pa 的条件下真空冷冻干燥后，得发酵豆乳粉C。
3、发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
将发酵豆乳粉C以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝68mg/mL。
实施例4
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌种子(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)豆浆的制备：将蚕豆干豆称重后，加入五倍质量的水置于37℃浸泡8h，弃去水，在豆浆机中加入一定比例的湿豆与水，制得所需固形物含量的豆浆，经121℃灭菌20min，得到指定固形物含量的无菌蚕豆豆浆。
(c)发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率与IC50的测定：同实施例1。
2、发酵豆乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量2％(v/v) 无菌接种于固形物含量7％(w/w)的蚕豆豆浆中，25℃静置培养36h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度 25Pa的条件下真空冷冻干燥后，得发酵豆乳粉D。
3、发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
将发酵豆乳粉D以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝67mg/mL。
实施例5
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌种子(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)豆浆的制备：将大白芸豆和小白芸豆干豆以质量比1：1称重混合后，加入五倍质量的水置于37℃浸泡8h，弃去水，在豆浆机中加入一定比例的湿豆与水，制得所需固形物含量的豆浆，经121℃灭菌20min，得到指定固形物含量的无菌白芸豆豆浆。
(c)发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率与IC50的测定：同实施例1。
2、发酵豆乳粉的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量4％(v/v) 无菌接种于固形物含量3％(w/w)的白芸豆豆浆中，40℃静置培养12h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度25Pa的条件下真空冷冻干燥后，得发酵豆乳粉E。
3、发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
将发酵豆乳粉E以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝66mg/mL。
实施例6
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)植物乳杆菌种子的制备：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC14917的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，然后用接种环取一环划线于 MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v) 接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10 分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1x109cfu/mL。
(c)大豆豆浆的制备：同实施例1。
(d)发酵豆浆对变形链球菌生物膜形成的抑制率测定：同实施例1。
2、发酵豆浆的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量1.5％ (v/v)，及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC14917以接种量1.5％ (v/v)，无菌接种于固形物含量5％(w/w)的大豆豆浆中，37℃静置培养24h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度25Pa的条件下真空冷冻干燥后得发酵豆乳粉F。
3、发酵豆浆对变形链球菌生物膜形成抑制率的测定
将发酵豆乳粉F以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝54mg/mL。
实施例7
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)植物乳杆菌的制备：同实施例6。
(c)大豆豆浆的制备：同实施例1。
(d)发酵豆浆对变形链球菌生物膜形成的抑制率测定：同实施例1。
2、发酵豆浆的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量4.5％(v/v)，及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 14917以接种量0.5％ (v/v)，无菌接种于固形物含量3％(w/w)的大豆豆浆中，40℃静置培养12h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度25Pa的条件下真空冷冻干燥后得发酵豆乳粉G。
3、发酵豆浆对变形链球菌生物膜形成抑制率的测定
将发酵豆乳粉G以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝55mg/mL。
实施例8
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌(发酵菌种)和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)植物乳杆菌的制备：同实施例6。
(c)大豆豆浆的制备：同实施例1。
(d)发酵豆浆对变形链球菌生物膜形成的抑制率测定：同实施例1。
2、发酵豆浆的制备
将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333以接种量0.5％ (v/v)，及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 14917以接种量4.5％ (v/v)，无菌接种于固形物含量7％(w/w)的大豆豆浆中，45℃静置培养2h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度25Pa的条件下真空冷冻干燥后得发酵豆乳粉H。
3、发酵豆浆对变形链球菌生物膜形成抑制率的测定
将发酵豆乳粉H以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明该发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50＝58mg/mL。
效果实施例1产品口味与喜好程度测试
以上述实施例1-8所制备的发酵豆乳粉产品A、B、C、D、E、F、G、 H溶解于温水中，得到浓度为50mg/mL的复原发酵豆乳，以此为实验对象，进行产品的口味测试。测试人数50人。品尝方式：采用不记名打分的方式进行品尝；分别对上述发酵豆乳粉产品A、B、C、D、E、F、G、H的色泽、风味、口感、营养项进行单独打分，每一项满分是25分，计算平均分及其总分，统计结果记录于表1。同时，根据对产品的整体喜好程度给出的意见，统计对每个单品的喜好人数，统计结果记录于表2。
表1产品口味测试结果数据统计表
表2产品喜好程度测试结果数据统计表
从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，通过本发明技术方案中的方法所制得的由牛类芽孢杆菌、牛类芽孢杆菌和植物乳杆菌制备的具有变形链球菌生物膜抑制活性的发酵豆乳粉在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。
效果实施例2常温条件下发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜抑制活性的稳定性
将实施例1-8制备的发酵豆乳粉A、B、C、D、E、F、G、H置于常温条件(20℃)保存0、10、20和30天后取出，分别测定各样品对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50，结果如表3所示。
表3常温条件下发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成抑制效果的稳定性
由表3可知，所有测试的发酵豆乳粉在常温条件(20℃)保存30天后，对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50稳定保持在同一水平，稳定性较好。
对比例1
将实施例1中的接种量，豆浆浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵豆乳粉，各组所得发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50如表4所示。
表4不同方法制备所得发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50
从表4所示的结果中可以得出，将所述发酵豆乳粉的制备方法中接种量，豆浆浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，由牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCC No.8333制备的发酵豆乳粉依然可以抑制变形链球菌生物膜的形成量，但是其抑制效果明显下降。
因此，在优选范围之内，接种量、豆浆浓度、培养温度和发酵时间相互影响，使得由牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333制备的发酵豆乳粉具有更佳的变形链球菌生物膜形成的抑制效果。
对比例2
将实施例6中的接种量，豆浆浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵豆乳粉，各组所得发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50如表5所示。
表5不同方法制备所得发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50
从表5所示的结果中可以得出，将所述发酵豆乳粉的制备方法中接种量，豆浆浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，由牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCC No.8333和植物乳杆菌(L.plantarum) ATCC 14917制备的发酵豆乳粉依然可以抑制变形链球菌生物膜的形成量，但是其抑制效果明显下降。
因此，在优选范围之内，接种量、豆浆浓度、培养温度和发酵时间相互影响，使得由牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333和植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC14917(购买自ATCC)制备的发酵豆乳粉具有更佳的变形链球菌生物膜形成的抑制效果。
对比例3
参考实施例1所述方法，比较由牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis) CGMCCNo.8333、植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC 14917(购买自ATCC)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
牛类芽孢杆菌种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
植物乳杆菌(发酵菌种)的制备：同实施例6。
干酪乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内， 37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co. 德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mLM17液体 (购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内， 40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLM17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。
(b)大豆豆浆的制备：同实施例1。
(c)发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率与IC50的测定：同实施例1。
2、发酵豆乳粉的制备
将各菌株以3％(v/v)接种量无菌接种于固形物含量5％(w/w)的大豆豆浆中，分别培养(牛类芽孢杆菌、植物乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养)24h，冷冻干燥后获得相应的发酵豆乳粉。
3、发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
上述不同菌株制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50如表6所示：
表6不同菌株制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50
由表6可知，由其他菌株制备的发酵豆乳粉不具有变形链球菌生物膜抑制活性，而牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜的抑制活性非常显著。
通过实施例6可知，牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333 和植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC 14917(购买自ATCC)共同制备的发酵豆乳粉半抑制率浓度IC50＝54mg/mL，将其与牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis) CGMCC No.8333或植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC 14917单独制备的发酵豆乳粉相对比，牛类芽孢杆菌(Paenibacillusbovis)CGMCC No.8333和植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC 14917(购买自ATCC)共同制备的发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜的抑制活性显著。
对比例4
1、材料与方法
(a)牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333和变形链球菌菌悬液的制备：同实施例1。植物乳杆菌ATCC14917的制备：同实施例6。
(b)发酵液冻干粉对变形链球菌生物膜形成的抑制率测定：
发酵液冻干粉的预处理：将发酵液冻干粉溶解于无菌水中，pH调节至6.80，即得待测样品。
抑制活性的测定：参照实施例1所述方法，以未发酵的培养基作为空白对照进行测定。
(c)对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定：同实施例1。
2、牛类芽孢杆菌单菌发酵液冻干粉、牛类芽孢杆菌和植物乳杆菌混合发酵液冻干粉的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333以3％(v/v)接种量无菌接种于含蔗糖1％的M17液体培养基，37℃厌氧培养24h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度25Pa的条件下真空冷冻干燥后，得到牛类芽孢杆菌单菌发酵液冻干粉；
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333以1.5％(v/v)接种量，及植物乳杆菌ATCC14917以1.5％(v/v)接种量，无菌接种于含蔗糖1％的M17液体培养基，37℃厌氧培养24h，在板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度25Pa的条件下真空冷冻干燥后，得到牛类芽孢杆菌和植物乳杆菌混合发酵液冻干粉。
3、发酵液冻干粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50的测定
将发酵液冻干粉以上述方法制备为待测样品后测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制活性，结果表明牛类芽孢杆菌单菌发酵液冻干粉、牛类芽孢杆菌和植物乳杆菌混合发酵液冻干粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50均不可测得(发酵液冻干粉制备的最大浓度待测溶液对变形链球菌未达到半数抑制的效果)。
对比例5
将实施例1-8制备的发酵豆乳粉A、B、C、D、E、F、G、H溶解于无菌水中，pH调节至6.80，再以4℃、10,000rpm离心10min，上清部分即为无菌的复原发酵豆乳(待测样品)。根据实施例1中所述方法测定上述样品进行对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50，结果如表7所示。
表7无菌的复原发酵豆乳对变形链球菌生物膜形成抑制效果
由表7可知，无菌的复原发酵豆乳对变形链球菌生物膜形成抑制率依然有较强的抑制活性，说明抑制作用来自菌株代谢豆浆后的产物。但各组无菌复原发酵豆乳的生物膜抑制效果均低于无菌处理前的样品组，这表明无菌处理前的复原发酵豆乳的抑制生物膜菌膜的效果也来自活菌与代谢产物共同作用。
以上对本发明所提供的发酵豆乳粉的制备方法、制备出的发酵豆乳粉与应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种由牛类芽孢杆菌制备发酵豆乳粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：将牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵代谢，冷冻干燥后即得发酵豆乳粉。
2.根据权利要求1所述的发酵豆乳粉的制备方法，其特征在于，所述发酵菌剂的接种量为2x107～1x108cfu/mL。
3.根据权利要求1所述的发酵豆乳粉的制备方法，其特征在于，所述发酵菌剂还包含植物乳杆菌ATCC14917，植物乳杆菌ATCC14917与牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333的接种比例为1～9：1～9。
4.根据权利要求1所述的发酵豆乳粉的制备方法，其特征在于，所述豆浆中固形物的质量百分比含量为1％～9％。
5.根据权利要求1所述的发酵豆乳粉的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为15℃～45℃，时间为2～48h。
6.根据权利要求1所述的发酵豆乳粉的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
7.根据权利要求1所述的发酵豆乳粉的制备方法，其特征在于，所述发酵为静置培养。
8.一种由牛类芽孢杆菌制备的发酵豆乳粉，其特征在于，由权利要求1～7任一种制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的发酵豆乳粉，其特征在于，所述发酵豆乳粉对变形链球菌生物膜形成的半抑制率浓度IC50≤69mg/mL。
10.一种如权利要求8或9所述的发酵豆乳粉在制备抗龋齿食品方面的应用。
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