CN107410479B - 一种发酵乳及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵乳及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：将唾液链球菌CGMCC NO.13308接种于含蔗糖的脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳。本发明首次采用唾液链球菌CGMCC NO.13308发酵脱脂乳，唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌生长及其生物膜形成具有抑制活性，披露了唾液链球菌CGMCC NO.13308具有使发酵脱脂乳生成抗龋齿物质的新用途。与其他常规发酵脱脂乳的菌株相比，唾液链球菌CGMCC NO.13308所制备的发酵乳对变形链球菌生物形成的抑制活性显著，并且稳定性好。

Description

一种发酵乳及其制备方法
技术领域
本发明属于发酵乳的技术领域，具体涉及一种发酵乳及其制备方法。
背景技术
龋齿，俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。如不及时治疗，病变继续发展，形成龋洞，终至牙冠完全破坏消失，其发展的最终结果是牙齿丧失。龋齿特点是发病率高，分布广。该病是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
引发龋齿的因素众多，如细菌、口腔环境(食物、唾液)、宿主等，其中，细菌是龋齿发生必要条件，一般认为致龋菌有两种类型，一种是产酸菌属，其中主要为变形链球菌(Streptococcus mutans，简称S.mutans)、放线菌属和乳杆菌，可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿；另一种是革兰阳性球菌，可破坏有机质，经过长期作用可使牙齿形成龋洞。所述致龋菌中，变形链球菌被国内外学者公认为是引发龋齿的最主要和最重要的病原菌。因此，通过抑制或杀灭变形链球菌的方法来控制口腔中主要致龋菌的数量，进而预防和治疗龋齿是行之有效的手段。目前控制的药物较少，氨硝酸银是为数不多的其中之一，氨硝酸银是一种防腐杀菌性药物，具有防腐、收敛、杀菌及腐蚀作用，但该药物可使牙齿染色，故不适用于前牙治疗。
而另一方面，由于变形链球菌所产生的生物膜(不溶性多糖)可促进致龋菌在牙齿表面的吸附与积累，继而形成牙菌斑恶化龋齿的程度，因此，减少其生物膜的产量也可达到防治龋齿的目的，相对于控制变形链球菌数量的研究而言，以减少生物膜产量来防治龋齿的研究相对较少。
近年来有关利用益生菌调节口腔菌群的研究越来越多，但报道的角度大多侧重于控制变形链球菌数量或抑制菌膜产量，极少有兼具所述两方面功能菌株的报道，而且，将抗龋益生菌应用于功能性食品的实例更是凤毛麟角，这是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
基于所述技术问题，本发明提供了一种发酵乳的制备方法，采用该方法可以制得兼具抑制变形链球菌生长及其生物膜形成效果的功能性发酵乳。
具体的，一方面，本发明提供了一种发酵乳的制备方法，该方法包括以下步骤：将唾液链球菌CGMCC NO.13308接种于含蔗糖的脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳。
所述唾液链球菌(Streptococcus salivarius)CGMCC No.13308菌株已于2016年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
优选的，所述唾液链球菌CGMCC NO.13308的接种量为7x106～3.5x107cfu/mL。接种量过多或过少时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种的繁殖速度缓慢，使最终获得的发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为3～12％，所述脱脂乳为配制获得的。
优选的，所述脱脂乳中蔗糖的含量为0.25～5％。蔗糖的含量过高或过低时，均不利于菌种发酵生成发酵乳。
优选的，所述发酵的方式为厌氧培养。在厌氧条件下，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种能够快速繁殖，发酵生成对变形链球菌生物膜形成具有抑制活性的发酵乳。
优选的，所述发酵的温度为26℃～42℃。发酵温度过高或过低时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种的代谢缓慢，会导致发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，所述发酵的时间为3～12h。在所述优选时间范围内，唾液链球菌CGMCCNO.13308菌种能够发酵脱脂乳，生成对变形链球菌生物膜形成具有抑制活性的发酵乳。
第二方面，还提供了一种发酵乳，由所述任一制备方法制得。所述发酵乳中的唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌的生长及其生物膜形成有抑制作用，对变形链球菌生物膜形成的抑制率＞20％。
本发明的有益效果：本发明首次采用唾液链球菌CGMCC NO.13308发酵脱脂乳，唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌生长及其生物膜形成具有抑制活性，披露了唾液链球菌CGMCC NO.13308具有使发酵脱脂乳生成抗龋齿物质的新用途。与其他常规发酵脱脂乳的菌株相比，唾液链球菌CGMCC NO.13308所制备的发酵乳对变形链球菌生物形成的抑制活性显著，并且稳定性好。
附图说明
图1为实施例1中唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌效果。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在一个具体的实施方式中，提供了一种发酵乳的制备方法，该方法包括以下步骤：将唾液链球菌CGMCC NO.13308接种于含蔗糖的脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳。
上述技术方案中的制备方法，首次采用一株兼具抑制变形链球菌生长及其生物膜形成效果的唾液链球菌CGMCC NO.13308，以含蔗糖的脱脂乳作为培养基进行发酵，制备得到抗龋发酵乳，披露了唾液链球菌CGMCC NO.13308具有使发酵脱脂乳生成抗龋齿物质的新用途。与其他常规发酵脱脂乳的菌株相比，唾液链球菌CGMCC NO.13308所制备的发酵乳对变形链球菌生物形成的抑制活性更显著，并且稳定性较好。
优选的，唾液链球菌CGMCC NO.13308的接种量为7x106～3.5x107cfu/mL；较佳地为1.4x107～2.8x107cfu/mL，更佳地为2.1x107cfu/mL。接种量过多或过少时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种繁殖速度慢，使得最终获得的发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
脱脂乳可以是新鲜的脱脂乳，也可以是配制而成的脱脂乳。优选的为配制的脱脂乳，配制的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为3～12％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入脱脂乳粉，混匀充分溶解后，95～125℃灭菌5～20min，冷却即得。
优选的，脱脂乳中蔗糖的含量为0.25～5％；较佳地为0.5～3％；更佳地为1％。蔗糖为唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种提供了碳源，蔗糖的含量过高或过低时，均不利于菌种的生长和繁殖，不利于菌种发酵生成发酵乳。
优选的，所述发酵温度为26～42℃；较佳地为30℃～38℃；更佳地为34℃。发酵温度过高或过低时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种的代谢缓慢，会导致发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。
优选的，所述发酵时间为3～12h；较佳地为5～8h；更佳地为6h。在所述优选时间范围内，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种能够发酵脱脂乳，生成对变形链球菌生物膜形成具有抑制活性的发酵乳。
优选的，所述发酵方式为厌氧培养。唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种为厌氧菌，在厌氧条件下，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种能够快速繁殖，发酵生成对变形链球菌生物膜形成具有抑制活性的发酵乳。
结合实施例和比较例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，唾液链球菌CGMCCNo.13308发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制效果明显下降。而在优选范围之内，接种量、脱脂乳浓度、蔗糖浓度、发酵温度和时间相互影响，使得液链球菌CGMCC No.13308发酵得到的具有抑制变形链球菌生物膜形成的发酵乳的抑制效果更佳。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种发酵乳，该发酵乳由上述任一种发酵乳的制备方法制得。所述发酵乳中的唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌的生长及其生物膜形成有抑制作用。所述发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制率为＞20％。结合实施例亦可知，上述发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制活性显著高于其他常规脱脂乳发酵菌株。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所有原料均为市售，并均符合相关的国家标准。
实施例1
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：
唾液链球菌CGMCC No.13308：将唾液链球菌CGMCC No.13308的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL M17液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于M17液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为7x108cfu/mL。
变形链球菌CGMCC 1.2499：将变形链球菌CGMCC 1.2499(购买自CGMCC)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于BHI固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL BHI液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于BHI液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为6x108cfu/mL。
(2)脱脂乳的制备：将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，再加入1％(w/v)蔗糖充分溶解，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得脱脂乳。
(3)唾液链球菌抑制变形链球菌活性的检测方法：点种法。吸取少量发酵乳用无菌蒸馏水稀释，将稀释液用涂布棒均匀涂布于M17琼脂平板上，置于37℃厌氧培养24小时，再用接种针从平板上随机挑取单菌落点种于铺有变形链球菌作为指示菌的BHI琼脂平板上，置于37℃厌氧培养24小时，观察并记录抑菌圈的有无及大小。抑菌圈直径越大，抑菌活性越强。
(4)唾液链球菌发酵乳对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：将唾液链球菌发酵乳10000rpm 5℃离心取上清调节pH至6.80，取100μL上述上清与100μL重悬有变形链球菌(105cfu/mL)的含蔗糖(0.25％w/v)BHI液体培养基同时加入96微孔板中，37℃厌氧培养24h，用去离子水将参与反应的微孔洗涤3次，去除游离细菌，室温下倒扣微孔板，待其自然干燥后，向微孔内加入100μL 0.5g/L的结晶紫溶液，室温下染色15min后除去染色液，以大量去离子水冲洗去未吸附的结晶紫，自然干燥后每孔加入200μL无水乙醇溶解吸附的结晶紫，使用酶标仪检测600nm下样品组吸光度值OD样品组，以沸水浴灭活的发酵乳上清进行相同操作在600nm下测得相应的对照组吸光度值OD对照组，用公式“抑制率＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％”计算对生物膜形成的抑制率。
2、发酵乳的制备
将唾液链球菌CGMCC NO.13308种子以接种量3％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于含1％(w/v)蔗糖的8％(w/w)脱脂乳，34℃厌氧培养6h得发酵乳A。
3、抑制活性的测定
将发酵乳A以上述方法分别测定菌体对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制活性，结果表明，发酵乳A中的唾液链球菌CGMCC NO.13308菌体对变形链球菌的抑菌圈直径为18mm(如图1所示)，发酵乳A对变形链球菌生物膜形成的抑制率为37％。
实施例2
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(2)脱脂乳的制备：将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，再加入5％(w/v)蔗糖充分溶解，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得脱脂乳。
(3)唾液链球菌抑制变形链球菌活性的检测方法及其发酵乳对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例1。
2、发酵乳的制备
将唾液链球菌CGMCC NO.13308种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含5％(w/v)蔗糖的12％(w/w)脱脂乳，42℃厌氧培养3h得发酵乳B。
3、抑制活性的测定
将发酵乳B以上述方法分别测定菌体对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制活性，结果表明，发酵乳B中的唾液链球菌CGMCC NO.13308菌体对变形链球菌的抑菌圈直径为16mm，发酵乳B对变形链球菌生物膜形成的抑制率为24％。
实施例3
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(2)脱脂乳的制备：将质量百分比为3％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，再加入0.25％(w/v)蔗糖充分溶解，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得脱脂乳。
(3)唾液链球菌抑制变形链球菌活性的检测方法及其发酵乳对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例1。
2、发酵乳的制备
将唾液链球菌CGMCC NO.13308种子以接种量5％(v/v)无菌接种于含0.25％(w/v)蔗糖的3％(w/w)脱脂乳，30℃厌氧培养12h得发酵乳C。
3、抑制活性的测定
将发酵乳C以上述方法分别测定菌体对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制活性，结果表明，发酵乳C中的唾液链球菌CGMCC NO.13308菌体对变形链球菌的抑菌圈直径为17mm，发酵乳C对变形链球菌生物膜形成的抑制率为31％。
实施例4
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(2)脱脂乳的制备：将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，再加入0.5％(w/v)蔗糖充分溶解，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得脱脂乳。
(3)唾液链球菌抑制变形链球菌活性的检测方法及其发酵乳对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例1。
2、发酵乳的制备
将唾液链球菌CGMCC NO.13308种子以接种量1％(v/v)无菌接种于含0.5％(w/v)蔗糖的10％(w/w)脱脂乳，26℃厌氧培养8h得发酵乳D。
3、抑制活性的测定
将发酵乳D以上述方法分别测定菌体对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制活性，结果表明，发酵乳D中的唾液链球菌CGMCC NO.13308菌体对变形链球菌的抑菌圈直径为16mm(如图1所示)，发酵乳D对变形链球菌生物膜形成的抑制率为25％。
实施例5
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
(2)脱脂乳的制备：将质量百分比为5％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，再加入3％(w/v)蔗糖充分溶解，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得脱脂乳。
(3)唾液链球菌抑制变形链球菌活性的检测方法及其发酵乳对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例1。
2、发酵乳的制备
将唾液链球菌CGMCC NO.13308种子以接种量2％(v/v)无菌接种于含3％(w/v)蔗糖的5％(w/w)脱脂乳，38℃厌氧培养5h得发酵乳E。
3、抑制活性的测定
将发酵乳E以上述方法分别测定菌体对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制活性，结果表明，发酵乳E中的唾液链球菌CGMCC NO.13308菌体对变形链球菌的抑菌圈直径为17mm(如图1所示)，发酵乳E对变形链球菌生物膜形成的抑制率为28％。
效果实施例1产品口味与喜好程度测试
取上述实施例1-5所制备的发酵乳产品A、B、C、D和E为实验对象，进行产品的口味测试。测试人数50人。品尝方式：采用不记名打分的方式进行品尝；分别对上述发酵乳粉产品A、B、C、D和E的色泽、风味、口感、营养项进行单独打分，每一项满分是25分，计算平均分及其总分，统计结果记录于表1。同时，根据对产品的整体喜好程度给出的意见，统计对每个单品的喜好人数，统计结果记录于表2。
表1产品口味测试结果数据统计表
表2产品喜好程度测试结果数据统计表
从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，通过本发明技术方案中的方法所制得的具有抗龋齿功能的发酵乳在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。
效果实施例2冷藏条件下发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制效果的稳定性
将实施例1-5制备的发酵乳A、B、C、D和E置于冷藏条件(8℃)保存0、5、10和15天后取出，分别测定各样品对变形链球菌生物膜形成的抑制率，结果如表3所示。
表3冷藏条件下发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制效果的稳定性
由表3可知，所有测试的发酵乳在冷藏(8℃)保存15天后，对变形链球菌生物膜形成的抑制效果稳定保持在同一水平，稳定性较好。
对比例1
将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，蔗糖浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵乳，各组所得发酵乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制效果如表4所示。
表4不同方法制备所得发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制效果
从表4所示的结果中可以得出，将所述发酵乳的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，蔗糖浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，唾液链球菌CGMCCNO.13308依然可以发酵脱脂乳产生抑制变形链球菌生物膜形成的物质，但是产物对变形链球菌生物膜形成的抑制效果明显下降。
对比例2
参考实施例1所述方法，比较由唾液链球菌CGMCC NO.13308、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制效果，具体操作如下：
1、材料与方法
(1)种子(发酵菌种)的制备：
干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。
唾液链球菌和嗜热链球菌种子的制备：将唾液链球菌CGMCC NO.13308和嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL M17液体，40℃培养24h后，培养物9000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(2)脱脂乳的制备：同实施例1。
(3)各菌株的发酵乳对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例1。
2、发酵乳的制备
将各菌株以3％(v/v)接种量无菌接种于含1％(w/v)蔗糖的8％(w/w)脱脂乳，分别培养(唾液链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌34℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养)6h，获得相应的发酵乳。
3、抑制活性的测定
上述不同菌株制备的发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制率如表5所示：
表5不同菌株制备的发酵乳对变形链球菌生物膜形成的抑制率
由表5可知，其他常规脱脂乳发酵菌株发酵脱脂乳的产物不具有抑制变形链球菌生物膜形成的活性，而唾液链球菌CGMCC NO.13308制备的发酵乳粉对变形链球菌生物膜形成的抑制活性非常显著。
以上对本发明所提供的发酵乳、发酵乳的制备方法以及发酵乳粉进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种发酵乳的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将唾液链球菌CGMCCNO.13308接种于含蔗糖的脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳，所述脱脂乳中蔗糖的含量为0.25～5％，所述发酵的方式为厌氧培养，所述发酵的温度为26～42℃，所述发酵的时间为3～12h；
所述唾液链球菌CGMCC NO.13308的接种量为7×106～3.5×107cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的发酵乳的制备方法，其特征在于，所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为3～12％。
3.一种发酵乳，其特征在于，由权利要求1～2任一项所述的制备方法制得。
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