CN103740618A - 一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 - Google Patents

一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。该类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），保藏编号为CGMCC No.8333，是类芽孢杆菌属的一个新种，其分类地位是Paenibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus damxungensis sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用类芽孢杆菌做出了一定的贡献。该菌株属类芽孢杆菌属，多糖含量丰富，可作为一种微生物治疗剂，也可用来制备胞外多糖。

Description

一种类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体的涉及一种类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）新种及其培养方法和应用。 
背景技术
以形态学为分类基础，早期研究将类芽孢杆菌归入芽孢杆菌属。1994年，Ash等通过PCR探针试验分析了不同芽孢杆菌种的16S rRNA序列，并发现一些芽孢杆菌与其他芽孢杆菌的表型特征差异极大，16S rRNA序列存在高度特异性。以此，Ash将多粘芽孢杆菌等11个种从芽孢杆菌属中分离出来，独立为类芽孢杆菌属（Paenibacillus）。 
类芽孢杆菌属，其模式种为Paenibacillus polymyxa ATCC842T，细胞呈杆状，最适温度28～30℃，主要的脂肪酸为为反异式饱和脂肪酸C15：0。类芽孢杆菌属G+C含量范围为45～54mol％。 
一般认为G+C mol%差别大于5%，可判断着两株菌不属于同一个种（甚至在其他性状相似的情况下也可作上述判断）。DNA同源性的分析能够最终确定菌株的分类，也是确定新种的一个途径。在最适的条件下，DNA同源性在70%以上是属于同一种的，在20%以上是属于同一属的。 
目前研究认为，将表现性和DNA同源性结合起来划分种和属的效果是准确可取的。 
类芽孢杆菌属的很多微生物对植物具有防病作用和促生作用，因此在农业生产中具有很好的应用潜力。类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质，如酶、抗菌物质、植物激素以及絮凝剂等，这些活性物质大多为蛋白质、多糖、多肽等。类芽孢杆菌产生的抗菌物质按其物质类型及分子大小可分为小分子的多肽抗生素类、大分子的拮抗蛋白（酶）类等。这些抗菌物质性质比较稳定，如耐高温、高压，对酸碱稳定，对蛋白酶不敏感等。 
发明内容
本发明的目的是提供类芽孢杆菌属的一个新种及其培养方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。 
本发明的技术方案之一是：一种类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），保藏编号为CGMCC No.8333。 
本发明的技术方案之二是：一种培养类芽孢杆菌CGMCC No.8333的方法，包括以下步骤，将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于培养基中，在15～40℃和pH5.5～8.5条件下培养。 
本发明所述的培养的温度为15～40℃，优选30℃。 
本发明所述的培养的pH值为5.5～8.5，优选6.0。 
本发明，优选的，所述的培养的培养基中还包括不超过10%的NaCl，所述百分比为质量百分比。 
本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。 
本发明所述的培养的接种量为常规，优选2%，所述百分比为体积百分比。 
本发明所述的培养基为类芽孢杆菌常规培养基，优选是TYC培养基。 
本发明所述的培养是常规的类芽孢杆菌培养，较佳的在在需氧条件下进行。 
本发明的技术方案之三是：类芽孢杆菌CGMCC No.8333在制备胞外多糖中的应用。 
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。 
本发明所用试剂和原料均市售可得。 
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了类芽孢杆菌属的一个新种， 该菌株的分类地位是Paenibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus damxungensis sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，对我们以后更好地利用类芽孢杆菌做出了一定的贡献。本发明的类芽孢杆菌BD3526，可作为一种微生物治疗剂，也可用来制备胞外多糖。 
生物材料保藏信息
本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，名称为BD3526。 
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。 
图1显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526在TYC培养基上的菌落形态 
图2显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526的生长曲线。横坐标为时间，纵坐标为96孔板中100μL培养液在600nm下的OD值。 
图3显示本发明类芽孢杆菌新种菌株BD3526的16S rRNA系统发育进化树。 
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。 
Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGMCC No.1.8907T）与Paenibacillus polymyxa ATCC842T（CGMCC No.1.4261T）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。 
实施例1本发明新微生物的获得 
从西藏自治区当雄县采集牦牛奶，以无菌方式取1ml，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30℃培养24-48小时。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的菌落。 
实施例2本发明新微生物的获得及其特征 
Biolog微生物自动检测仪（生产厂商：Biolog公司）鉴定实验： 
Biolog微生物自动检测仪（生产厂商：Biolog公司）鉴定实验，是Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，筛选95种不同碳源或其他化学物质，配合显色物质，固定于96孔板上（A1孔为阴性对照）。接种菌悬液培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行呼吸代谢过程中产生的化学还原物质欲显色物质发生反应导致的吸光度以及由于微生物生长造成的浊度，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得到最终鉴定结果。 
1）取如上所述实施例1中的单菌落多个，分别接种到液体TYC中，30℃培养24h。 
2）在10000r/min下离心20min，弃去上清液，加1mL生理盐水，在振荡器上振动5min使之混匀；再于10000r/min下离心20min，重复2次，除去其中的碳源；弃去上清液，加1mL生理盐水，在振荡器上振动5min使之混匀，于2000r/min下离心1min。 
3）取上清液倒入装有20mL已灭菌生理盐水（NaC1，0.85％）的试管中，并使其OD590维持在0.13±0.02。 
4）将如上所述稀释液加入Biolog ECO微平板中(150μL／孔)，然后在20℃下培养，每隔12h用Biolog细菌自动读数仪读取数据，连续测定2d。 结果如表1所示。 
表1.菌株BD3526的Biolog鉴定结果 
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000051
对结果进行鉴定需要考虑3个参数，可能性（Probability，PROB）、相似性（Similarity，SIM）、位距（Distance，DIS）。SIM和DIS值是2个重要的参数，表示测试结果与数据库相应的数据的匹配程度。当DIS<5.0，SIM>0.75为良好的匹配。结果显示，其中的菌株BD3526鉴定的SIM值0.535<0.75，说明与数据库中数据匹配度低，表示与数据库中的菌种在代谢特征上存在较大差异，可能是一个新的微生物种类。 
菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，名称是BD3526。 
实施例3本发明新微生物的特征 
1、菌落特征： 
取菌株BD3526的单菌落，转接到TYC固体培养基（琼脂）上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果如图1所示。结果显示，菌株BD3526在TYC固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘稠，表面光泽，不透明的菌落，直径约3～5mm。 
2、形态学观察及生理生化特征： 
挑取在TYC固体培养基（琼脂）上培养24h的新鲜培养物，进行生理 生化测试。结果显示，BD3526为革兰氏阳性杆菌，芽孢端生，为椭圆形，不膨大。 
BD3526其理化反应参数如表2。 
表2.菌株BD3526的理化实验结果 
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000061
3、API50CHB鉴定特征 
利用API50CHB鉴定系统（生产厂商：bioMe′rieux）测定菌株BD3526发酵碳水化合物的产酸情况。API50CHB的试剂条中，不同的序列号对应不同的碳源，同时，其中含有指示剂，这样，如果其对应的碳源被利用，则培养液pH下降，指示剂便会改变颜色，利于观察记录。 
1)API50CHB基础培养基成分：胰蛋白胨1g，酵母膏0.5g，硫酸铵2g，酚红0.18g，无机盐基础（Cohen-Bazire）10ml，磷酸盐缓冲液（pH7.8）1000ml。 
2)在平板上培养菌株，挑取有多个大小相近，单菌落分离的平板。挑取大小相近的单菌落若干个，加入1)中的培养基中，制成OD600=0.4～0.6的菌悬液。 
3)将接过种的API50CHB培养基加入到含有实验条的小管中，上面覆盖一层已灭菌的石蜡油。 
4)在30℃的恒温培养箱中培养，分别在24小时和48小时记录实验现象。 
菌株BD3526利用碳水化合物发酵产酸的结果如表3、4所示。 
表3.菌株BD3526的API50CHB鉴定结果 
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000062
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000071
“+”表示利用糖产酸，“-”表示不产酸。 
表4.菌株BD3526与其相近类芽孢杆菌的利用碳水化合物水解产酸的对比表 
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000072
注：菌株1为BD3526，菌株2为Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T）； 
W是指“weak”，弱阳性。 
如表4所示，菌株BD3526与菌株2Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T）利用碳水化合物水解产酸方面有明显差异，属于不同种。 
实施例4本发明新微生物的生长特性 
1.生长曲线： 
1)各取30mL TYC液体培养基于100mL锥形瓶中，用多层(8-12层)纱布封口后，121℃高温蒸汽灭菌15分钟； 
2)挑取在TYC固体培养基（琼脂）上培养24h的新鲜培养物，接种到上述TYC液体培养基，30℃摇床培养20～24h,作为种子。 
3)将2）中所培养的BD3526种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYC液体培中，混匀。取150μl混合液加入costar96孔灭菌微孔板中，3份平行，并以不接种的TYC液体培养基做空白。波长600nm下测量OD值，间隔30min。结果见图2。 
2.生长温度： 
将2）中所培养的BD3526种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYC液体培中，混匀。分别置于4℃、15℃、30℃、37℃、40℃、60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24h和48h时测定其生长情况。得到菌株BD3526生长温度范围为15～40℃，较佳地为30℃。 
3.生长NaCl耐受性 
将2）中所培养的BD3526种子按2%(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0%、2.0%、5.0%、7.0%和10.0%的TYC培养基，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。结果显示菌株BD3526的NaCl耐受性为10%。 
4.生长pH范围 
用无菌的HCL和NaOH将灭好菌的TYC培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0，将2）中所培养的BD3526种子按2%接种量接入，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。得到菌株BD3526生长的pH范围为5.5～8.5，较佳地为6.0。 
实施例5本发明新微生物的16S系统发育学特征 
利用天跟细菌基因组提取试剂盒（TIANAMP Bacteria DNA Kit），按照革兰氏阳性菌操作步骤获得菌株BD3526的基因组DNA。分别测定其230nm、260nm、280nm的吸光度，其A260：A280：A230为1：0.510：0.445。纯度符合要求。 
利用27F，1492R引物扩增菌株BD3526的16S rDNA片段。纯化，然后与pMD19-T Simple Vector的TA克隆载体连接，放于16℃的水浴中反应过夜，转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，于氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上涂布，在37℃培养16-20小时后，挑取阳性转化子。将上述阳 性转化子送上海杰李生物公司测序。将测序结果放到NCBI及EzTaxon数据库中，比对得到与最相近的菌株（Paenibacillus hunanensis FeL05T）相似性为96.6%。 
如上所述的引物对序列为，1492R：TACCTTGTTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。 
菌株BD3526的16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO.1所示。 
如上所述的16S rRNA序列采用软件CLUSTAL_X program(version1.83)进行比对，使用软件MEGA version4.0.2.software绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图3所示。从图3可见，通过对16S rRNA基因的系统发育树分析，菌株BD3526可以归入到Paenibacillus hunanensis簇。但是，菌株BD3526与Paenibacillus hunanensis模式菌株相似性为96.6%。而97%则是同一属内不同种类菌株相似性的16SrRNA的阈值，而且很多文献中证明了有些菌16S rRNA基因序列的相似性超过了99%，但是他们仍然属于不同的菌种。故菌株BD3526较有可能为新的微生物物种，有待其他生理生化指标的验证。 
实施例6本发明新微生物的脂肪酸含量特征 
菌株BD3526的总脂肪酸含量的测定。 
配置如下溶液：I，45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；II，190ml浓盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水；III，200ml正己烷与200ml乙醚混合均匀；IV，10.8克氢氧化钠溶于900ml蒸馏水；V，饱和氯化钠溶液。 
1）取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液I，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5～10S，继续沸水浴25min； 
2）待样品管冷却后，加入2ml溶液II，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却； 
3）向上述溶液中，加入1.25ml溶液III，快速振荡10min左右，弃去下 层水相； 
4）在剩余有机相重加入3ml溶液IV及0.1-0.2ml溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置色谱样品瓶中。 
HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢化焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，5℃/min升至260℃，随后40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比为100：1，进样量为2μl；检测温度300℃，氢气流速为30ml/min，空气流速为216ml/min，补充气（氮气）流速为30ml/min。 
结果显示，菌株BD3526的主要细胞脂肪酸为反异式饱和脂肪酸C15：0、反异式十七碳饱和脂肪酸、十六碳饱和脂肪酸，百分含量分别为59.02%、11.09%、7.66%。符合类芽孢杆菌属主要的脂肪酸为为反异式饱和脂肪酸C15：0。而且同相似菌株脂肪酸种类与含量上，均有差异，以此判断同相似菌株属于不同种类。 
实施例7本发明新微生物的G＋C mol％含量特征 
菌株BD3526基因组DNA的G＋C mol％含量测定。 
使用熔解温度（Tm）法，以大肠埃希氏（E.coli K12，AS1.365）为参比对照，所用仪器为Perkin/Elmer公司Lambda35UV/VIS Spectrometer;用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下： 
1）将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD260nm值于0.3～0.4之间； 
2）在波长260nm首先记录25℃的OD值，然后设定升温程序，从65℃开始到95℃，其间每分钟升高1℃； 
3）OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕； 
4）根据热变性曲线，得出熔链温度（Tm），计算G＋C mol％含量。 
在0.1×SSC溶液中计算公式为： 
G＋C mol％＝G＋C mol％AS1.365＋2.08（Tm未知－TmAS1.365） 
试验测定的E.coli K12，AS1.365的Tm为75.810℃，待测菌株的Tm值和G+C mol%。 
菌株BD3526的G+C mol%结果见表5。 
表5.菌株BD3526的G+C mol%含量 
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000111
菌株BD3526的G＋C mol％为47.48%，Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGMCC1.8907T=DSM22170T）G＋C mol％为53.3%（两者差异大于5%）。类芽孢杆菌属G＋C含量范围45～54mol％。依据东方秀、蔡秒英主编的《常见细菌系统鉴定手册》，类芽孢杆菌属G＋C含量范围45～54mol％；两株菌G+C mol%差别大于5%，可判断不属于同一个种（在其他性状相似的情况下也可作上述判断）。由此判断，菌株BD3526归为类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.），同最相近的菌株Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGMCC1.8907T=DSM22170T）属于不同种。 
实施例8本发明新微生物的杂交试验 
菌株BD3526同遗传亲缘关系最相似的菌种及类芽孢杆菌属模式菌种的杂交试验。 
参考16S rRNA的结果，对BD3526与遗传亲缘关系最相似的种Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGMCC1.8907T=DSM22170T）及Paenibacillus模式菌株Paenibacillus polymyxa ATCC842T（=CGMCC1.4261T=DSM36T=KCTC3858T）进行DNA-DNA杂交试验。 
采用液相复性率方法，所用仪器为Perkin Elmer Lambda35UV/VIS Spectrophotometer。温度控制用PTP-1Peltier System数字控温系统。步骤如下： 
1）DNA样品处理：如上所述实施例5中提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W打24分钟（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm2.0，将DNA样品剪切为2-5×105道尔顿的片段。 
2）将待测DNA样品（A、B）分别用0.1×SSC精确配制成为OD260nm1.8～2.0，且两者OD260nm值一致（精确到0.001）； 
3）进入UV Winlab程序（生产厂商：Perkin Elmer），出现其方法窗口，在方法窗口中选择时间驱动TD方法，通过Timed.Inst.Sample.设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimal renaturation temperature，TOR），将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR=0.51×（G+C）mol%+47计算。 
4）取两株菌种DNA样品各400μl分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200μl装在同一个离心管中为混合样品； 
5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过PTP-1控温系统（生产厂商：Perkin Elmer）设置100℃变性15min，然后降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线； 
6）根据软件UV Winlab，在其中的Algorithm栏中选择Slope,得出复性数率（V），即斜率（通常V表示为每分钟吸光值的减少值）； 
7）根据公式计算同源杂交率。 
Figure DEST_PATH_GDA0000466875050000121
DNA-DNA杂交结果如下： 
BD3526/Paenibacillus hunanensis FeL05T(三次重复): 
H%=39.82%  (I)； 
H%=41.60%  (II)； 
H%=42.10%  (III)。 
BD3526/Paenibacillus polymyxa ATCC842T(三次重复)： 
H%=41.62%  (I)； 
H%=46.60%  (II)； 
H%=48.60%  (III)。 
结果显示，菌株BD3526同Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGMCC1.8907T=DSM22170T）的DNA同源性为39.82～42.10%，同类芽孢杆菌属的模式菌种Paenibacillus polymyxa ATCC842T（=CGMCC1.4261T=DSM36T=KCTC3858T）DNA的同源性为41.62～48.60%。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，在最适的条件下，DNA同源性在70%以上是属于同一种的，在20%以上是属于同一属的。并结合实施例2，3，4，5，6的数据，由此判断菌株BD3526属于类芽孢杆菌属的一个新种。该菌株的分类地位是Paenibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并选菌株BD3526为该种的模式菌株。 
实施例9本发明新微生物的用途 
从图1看出，菌株BD3526的菌落粘稠，表明其具有高产量的胞外多糖。挑取如上所述单菌落接种到TYC液体培养基发酵，酒精沉淀得到产物，经鉴定为多糖。该多糖，由菌株BD3526天然发酵产生，安全无毒，可作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂等应用于工业化。菌株BD3526也可直接以微生物治疗剂形式使用。 
Figure IDA0000451289930000011
Figure IDA0000451289930000021

Claims (10)

1.一种类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.8333。
2.一种培养类芽孢杆菌CGMCC No.8333的方法，其特征在于，包括以下步骤：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于培养基中，在15～40℃和pH5.5～8.5条件下培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的温度为30℃。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的pH值为6.0。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的培养基中还包括不超过10%的NaCl，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养为摇床培养。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的接种量为2%，所述百分比为体积百分比。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基是TYC培养基。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。
10.如权利要求1所述的类芽孢杆菌CGMCC No.8333在制备胞外多糖中的应用。
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Inventor after: Wu Zhengjun

Inventor after: Guo Benheng

Inventor after: Gao Caixia

Inventor after: Liu Zhenmin

Inventor after: Hang Feng

Inventor after: Han Jin

Inventor before: Wu Zhengjun

Inventor before: Gao Caixia

Inventor before: Guo Benheng

Inventor before: Liu Zhenmin

Inventor before: Hang Feng

Inventor before: Han Jin

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Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WU ZHENGJUN GAO CAIXIA GUO BENHENG LIU ZHENMIN HANG FENG HAN JIN TO: WU ZHENGJUN GUO BENHENG GAO CAIXIA LIU ZHENMIN HANG FENG HAN JIN

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